瘦肉精在大鼠體內的代謝

1、克侖特羅在大鼠體內的代謝克侖特羅在大鼠體內的代謝 目錄1234理化性質：理化性質：結構簡式：結構簡式： 分子式：分子式：C12H18Cl2N2O 理化特性：理化特性： 本實驗研究了14C標記的克倫特羅在雌雄大鼠體內的代謝。喂食每只大鼠200g/kg體重的14C克倫特羅，并在之后8天期間研究其代謝產物和過程。發(fā)現(xiàn)有大約60%的放射性物質（14C）從尿液中排出，雄鼠和雌鼠分別有20%和30%的放射性物質（14C）從糞便中排出。利用HPLC（高效液相色譜法）檢測放射性物質（14C）可以對克倫特羅的代謝產物進行鑒定和定量，發(fā)現(xiàn)尿液中的一些代謝產物是不穩(wěn)定的。大部分尿液和糞便中的克倫特羅代謝產物可以使用

2、各種MS（質譜）分析技術進行分離和鑒定。在大鼠被給藥后，分析方法也可以建立克倫特羅在糞便和組織中代謝產物長達72h的圖譜?？藗愄亓_的主要代謝過程包括：N-脫烷基化（仲胺），N-氧化和硫酸共軛（伯胺）。另外，對不同性別大鼠的克侖特羅代謝產物中N-脫烷基化比率的差異進行觀察。大鼠尿液中檢測到的主要代謝產物是4-N-羥胺，而糞便中的放射性物質（14C）大多與氨基磺酸克侖特羅有關。1.實驗試劑實驗試劑：克倫特羅和用于標記的分子14 C CL4-氨基-3,5-二氯-（叔丁基氨基甲基）芐基醇。甲酸、乙酸、解旋酶、VI型硫酸、D型葡糖二酸-1,4-內酯。2.實驗動物實驗動物：8只成年大鼠（4只雄性和4只雌性

3、）。3.實驗樣品的采集：實驗樣品的采集：大鼠的排泄物的采集大鼠的排泄物的采集：8只成年大鼠被單獨飼養(yǎng)在不銹鋼籠中。允許大鼠自由飲水并且有一個標準的日常飲食。大鼠的平均重量分別為427 21g（雄性）和299 24g（雌性）。一周的環(huán)境適應期后，每只大鼠被強制喂食200 g/kg體重的14C標記的克倫特羅。后面的8天，每天把尿液和糞便收集起來備用。最后，大鼠被放血致死。鼠籠要單獨用500ml的甲醇/水（1：1，v / v）清洗干凈，并從中取1ml作為樣品做放射性物質測定。取下肝臟，如果不立即使用，這些樣品都要儲存在-20下。組織樣品的采集組織樣品的采集：4只雄性大鼠（年齡，10周）被安置在如上文

4、所述的環(huán)境中。分別在喂食克侖特羅后12h，24h，48h和72h通過放血處死大鼠。切除肝，肺和腎并存儲在-20下。鹽酸克倫特羅劑量的影響鹽酸克倫特羅劑量的影響：3只雄性大鼠（年齡，10周）被安置在如上所述環(huán)境中。分別強制喂食5，20，40 mg/kg體重14C標記的克侖特羅。3天內，每天收集3次尿液和糞便并儲存在-20下用于研究。4.儀器設備儀器設備：主要有HPLC（高效液相色譜儀）、放射性物質檢測器、吉爾森模型202餾分收集器、UV（紫外）分光光度計、帕卡德液體閃爍計數(shù)器。5.實驗過程：實驗過程：尿液：尿液：尿液樣品與甲醇混合（1：2，v/v），攪拌，以10000rpm（4）離心10 min

5、，將沉淀物丟棄，上清液在真空下濃縮并用微孔濾膜（0.5g，0.45m）過濾，最后用HPLC進行分析。糞便：糞便：通過初步分析這4只大鼠的糞便來確定大鼠組織中瘦肉精代謝產物的概況，目的是判斷大鼠糞便中是否存在不穩(wěn)定或揮發(fā)性的克侖特羅代謝產物。冷凍干燥前后的這些糞便樣品中的放射性物質含量需要通過完全燃燒和液體閃爍計數(shù)器來確定。通過對糞便提取物進行分析，比較新鮮和凍干樣品中克侖特羅代謝產物。 研究期間將每天收集到的大鼠糞便進行冷凍干燥，然后利用球磨床均質化，再對每個樣品中的14C進行測定。將大約0.5g的冷凍干燥樣品與甲醇/ 100mM的乙酸銨混勻2min，pH值3.2（1：6：3，w/v/v），然

6、后在10000rpm下（4）離心10min。將沉淀再用相同的溶劑混合萃取兩次，再與甲醇/ 1mM的氫氧化銨（1：6：3，w/v/v）混均萃取一次。放射性物質計數(shù)完成后，將4個上清液合并，用異辛烷去脂，并在N2條件下濃縮。將所得提取物在微濾膜（0.5g，0.45m）下進行過濾，然后利用HPLC進行分析，最后通過燃燒分析來確定離心沉淀中的放射性物質殘留。對每只大鼠的2天和3天的糞便以及雌性大鼠4天的糞便分別進行處理并分析，以確定糞便中代謝產物的組成和變化。喂食大鼠較高劑量的克侖特羅并對其糞便進行同樣的分析流程。組織：組織：提取約5 g的肝臟組織對肝臟代謝產物進行分析。將樣品切成小片，并使用6ml/

7、g的乙腈/甲醇/ 50mM乙酸銨緩沖液均質化，pH 3.2（6：3：1，v/v/v），然后在10000rpm和4離心10min。將上清液立即存儲在-20下，將沉淀物再進行5次萃取，即2次使用同樣的溶劑，1次用乙腈/甲醇/ 50mM的碳酸氫鈉緩沖液在pH 8.35（6：3：1，v/v/v）條件下進行萃取，最后2次用乙腈/甲醇/ 1mM的氫氧化鈉（6：3：1，v/v/v）進行萃取。最后殘留的每個樣品的離心沉淀通過燃燒分析測定放射性物質殘留。合并上述6個上清液，用乙腈飽和異辛烷去脂，真空濃縮，并在如上所述的條件下過濾，最后用HPLC分析。肺和腎臟中的代謝產物的檢測是使用相同的提取方法。腎樣品使用前，

8、要用水洗滌兩次再進行提取。酶解酶解：將粗制尿20l（或2l純化代謝產物加入20l水中）與480l0.1M乙酸鈉緩沖液（pH4.8）和20l的培養(yǎng)液（即2000菲什曼單位B-葡萄糖醛酸酶和硫酸酯酶活性的20000羅伊單位）混合，并在42酶解16h。對酶解后的產物進行離心，然后用微濾膜（0.5g，0.45l）過濾，再用放射性-HPLC進行分析。復測定在相同的條件下進行，不同的是加入了10lD-葡糖二酸-1,4-內酯來抑制b-葡糖醛酸酶的活性。更具體的是通過對純化后的代謝產物進行測定，來檢測是否有硫化反應的發(fā)生。在每個2l代謝產物樣品中加入450l 20mM Tris緩沖液和50ml產氣桿菌、VI型

9、硫酸酯酶在pH為7.1和37的條件下培養(yǎng)16h，然后進行和上文中同樣的分析。尿液中尿液中代謝產物的分離代謝產物的分離：主要有兩種方法1.使用HPLC結合餾分收集器進行分離。2.使用C8柱進行分離。1.大鼠的代謝平衡。大鼠的代謝平衡。每只大鼠被喂食200g/kg 的克倫特羅，并通過8天的研究發(fā)現(xiàn)：雄性大鼠代謝了87.1 2.5的14C，雌性大鼠代謝了90.2 4.2的14C。放射性物質(14C）主要通過尿液排出，而通過糞便排出的14C比較少（見表1），雌性大鼠尿液中的14C所占比例更高（P0.05）。與雄性大鼠比較，14C通過雌性大鼠尿液的排泄較慢。并且直到第5天（見圖1），14C在雌性大鼠糞便

10、中的含量還是比較可觀的。 在研究結束時，雄性大鼠尸體中殘留的放射性物質含量相當于克侖特羅3.62 0.36ng/g,而雌性大鼠尸體中放射性物質含量只有相當于瘦肉精2.20 0.62ng/g（P0.05）。大鼠組織中代謝產物的特征。所有大鼠肝臟提取物的放射性-HPLC分析從本質上是相似的。通過觀察，除了克侖特羅以外（在放射性物質中，其含量始終在一半以上），具有相同保留時間的兩個代謝產物為M10和M13。在給藥后48h，肝臟代謝產物M10和M13分別占肝臟組織中放射性物質的32%和17（見圖5B）。一些肝臟樣品在進行溶劑萃取之前，加入了已知量的3H標記的N-OH-CL。在這些實驗中，整個萃取過程中近100的3H標記的N-OH-CL還原為克侖特羅，而當使用一種快速的制備方法時，只有80%的N-OH-CL被還原。只對前兩只大鼠的腎臟和肺提取物進行分析，相應的放射性-HPLC分析結果見圖5C和5D。大多數(shù)在腎臟中的放射性