系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者骨髓基質(zhì)細(xì)胞因子表達(dá)及對(duì)免疫功能的影響

1、.DOC格式論文，方便您的復(fù)制修改刪減系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者骨髓基質(zhì)細(xì)胞因子表達(dá)及對(duì)免疫功能的影響（作者:_單位: _郵編: _）作者：鄒外一 童秀珍 藍(lán)惠霞， 馮煉強(qiáng)， 彭輝， 尹培達(dá)， 羅紹凱【摘要】 【目的】 研究系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）患者骨髓基質(zhì)細(xì)胞因子表達(dá)情況，及其對(duì)外周血淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響，探討SLE的發(fā)病機(jī)制?！痉椒ā?采用ELISA方法觀察SLE患者骨髓基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液IL-6、MIP-1、IFN-、TGF-等細(xì)胞因子的表達(dá)，采用四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT），觀察基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液對(duì)外周血淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響?！窘Y(jié)果】 SLE患者骨髓基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液IL-6、MIP-1、IF

2、N-濃度明顯增高，TGF-則降低，3種細(xì)胞因子與SLEDAI評(píng)分相關(guān)；正常人及SLE患者骨髓基質(zhì)細(xì)胞上清液均對(duì)刀豆蛋白A誘導(dǎo)的外周血淋巴細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，而SLE患者的上清液抑制作用明顯低于正常人；在分別加入抗MIP-1、抗IFN-單抗后，骨髓基質(zhì)細(xì)胞上清液對(duì)外周血淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用明顯增強(qiáng)，而加入抗TGF-單抗后，抑制作用明顯減弱?！窘Y(jié)論】 SLE患者骨髓基質(zhì)細(xì)胞對(duì)外周血淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用較弱，與其部分細(xì)胞因子異常表達(dá)有關(guān)，骨髓基質(zhì)細(xì)胞可能與SLE的發(fā)病、發(fā)展有一定關(guān)系。 【關(guān)鍵詞】 紅斑狼瘡，系統(tǒng)性； 骨髓，基質(zhì)細(xì)胞； 細(xì)胞因子； 淋巴細(xì)胞系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic

3、lupus erythematosus, SLE)目前病因尚未完全闡明，一些研究發(fā)現(xiàn)部分SLE造血干/祖細(xì)胞存在異常1，僅此并不能完全解釋SLE的發(fā)病，引起干/祖細(xì)胞異常的機(jī)制也未明確。骨髓基質(zhì)細(xì)胞分泌細(xì)胞因子除參與造血外也可參與免疫炎性反應(yīng)，對(duì)免疫活性淋巴細(xì)胞的前體細(xì)胞起重要的作用。除干/祖細(xì)胞異常外，SLE患者的骨髓造血微環(huán)境是否存在異常？相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較少。我們采用雙抗體夾心ELISA及四甲基偶氮唑鹽（3-4,5-dimethylthiazolyl-2,2,5-diphenyl tetrazolium，MTT）比色法，觀察SLE患者骨髓造血微環(huán)境中的基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液幾種細(xì)胞因子的表達(dá)情況

4、及其對(duì)淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響，探討SLE患者骨髓微環(huán)境是否有助于疾病發(fā)展或復(fù)發(fā)，進(jìn)一步闡明SLE發(fā)病機(jī)制，并為探索新的治療措施提供理論依據(jù)。1 材料與方法11 研究對(duì)象所有病例來自中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院2004年3月至2005年4月住院病人，正常骨髓15例，男性2例，女性13例，年齡2152歲，中位年齡32歲，取自心胸外科患者手術(shù)切除的肋骨；原發(fā)性血小板減少性紫癜或/和自身免疫性溶血性貧血15例，男性2例，女性13例，年齡1738歲，中位年齡25歲；SLE 30例均符合美國風(fēng)濕學(xué)會(huì)SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)2，SLE活動(dòng)指數(shù)評(píng)分2（SLEDAI）525分，平均12.6分，SLEDAI9分為活動(dòng)組，共18例，

5、男性2例，女性16例，年齡1353歲，中位年齡31歲，SLEDAI 1125，平均16.1；SLEDAI9分為非活動(dòng)組，共12例，男性2例，女性10例，年齡1554歲，中位年齡24歲，SLEDAI 59，平均7.3。12 方 法121 骨髓單個(gè)核細(xì)胞的制備 所有病例均取髂前上棘或髂后上棘，用含肝素的注射器抽取骨髓1215 mL置于含肝素40 U/mL的無菌試管，正常對(duì)照組肋骨用咬骨鉗擠出骨髓成分，用1640液徹底沖洗骨髓腔，將骨髓細(xì)胞收集在滅菌離心管內(nèi)，反復(fù)沖打使骨髓細(xì)胞充分分散，加等量1640液稀釋，疊加于淋巴細(xì)胞分離液上，2 000 r/min(r=15 cm)，離心20 min，吸取單個(gè)

6、核細(xì)胞層，用1640液洗滌2次，然后配制成骨髓單個(gè)核細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2×106 cells/mL。122 骨髓基質(zhì)細(xì)胞層建立 液體培養(yǎng)體系中含200 mL/L胎牛血清， IMDM、青霉素100 U/ mL，鏈霉素100 U/ mL，氫化可的松10-6 mmol/L，骨髓單個(gè)核細(xì)胞 5×105 cells/mL，置于6孔培養(yǎng)板中，每孔4 mL，每份樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，37 、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)5%CO2條件下培養(yǎng)，3 d后棄去全部上清及懸浮細(xì)胞，補(bǔ)充等量的上述體系培養(yǎng)液（不含細(xì)胞），之后每周半量換液1次，第34周當(dāng)貼壁細(xì)胞鋪滿約85%90%培養(yǎng)板底時(shí)，吸棄上清，用PB

7、S洗滌2次，加等量上述體系培養(yǎng)液，添加終濃度為5 g/mL PHA-P刺激，繼續(xù)培養(yǎng)34 d，收集上清，保留待檢。123 骨髓基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液細(xì)胞因子測(cè)定 采用固相雙抗體夾心ELISA法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液白介素-6（Interleukine-6,IL-6）、干細(xì)胞因子(Stem cell factor, SCF)、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(Stromal cell-derived factor-1, SDF-1)、干擾素（Interferon-?酌, IFN-）、轉(zhuǎn)化生長因子（Transforming growth factor , TGF-）及巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-1（Macrophage inf

8、lammation protein-1, MIP-1）濃度，嚴(yán)格按說明書操作。用Bio-Tek Elx800型酶標(biāo)儀測(cè)定A值。試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)在0.99以上。124 骨髓基質(zhì)細(xì)胞上清液對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的影響 取正常人外周血5 mL，先用等量緩沖液稀釋，然后緩慢置于等量的淋巴細(xì)胞分離液上，2 000 r/min (r=15 cm)，離心20 min，分離吸取單個(gè)核細(xì)胞層，用1640液洗滌2次，然后配制成外周血單個(gè)核細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2×105 /mL。使用96孔培養(yǎng)板，每孔加細(xì)胞懸液100L，并分別加SLE患者或正常人骨髓基質(zhì)細(xì)胞上清液100 L，對(duì)照組則不加上清液，各設(shè)3

9、個(gè)復(fù)孔，每孔加刀豆蛋白A至終質(zhì)量濃度為2.5 g/mL， 37 、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)72 h，各孔加MTT（5 mg/mL）20 L，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，800 r/min，離心20 min，小心吸棄全部上清液，每孔加二甲基亞砜 100 L，微量振蕩器振蕩30 min，使MTT還原產(chǎn)物甲肷完全溶解。酶標(biāo)儀測(cè)定540 nm吸光度。 125 單抗對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的影響 方法同上，SLE患者骨髓基質(zhì)細(xì)胞上清分別加抗IL-6（5 g/mL）、抗MIP-1 (5 g/mL)、抗IFN-( 5 g/mL)、抗TGF-單抗(20 g/mL)，余步驟同上。13 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件

10、包處理，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±)表示，兩組均數(shù)的比較用t檢驗(yàn)；多組均數(shù)的比較采用單因素方差分析；兩變量之間關(guān)系采用線性相關(guān)分析。2 結(jié) 果21 SLE患者骨髓基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液細(xì)胞因子測(cè)定SLE患者除IL-6高于對(duì)照組外（t =3.192, P0.01），SCF、SDF-1與對(duì)照組無異（分別t =0.611、0.567, P 0.05）, 3者在SLE活動(dòng)組與非活動(dòng)組則基本相近。原發(fā)性血小板減少性紫癜或溶血性貧血患者，SCF高于對(duì)照組及SLE組（分別t =2.555、2.287, P 0.05）；負(fù)調(diào)控因子中SLE患者M(jìn)IP-1、IFN-濃度明顯高于對(duì)照組（分別t

11、=4.171, 4.527, P 0.01），TGF-則低于對(duì)照組（t =3.298, P0.01）， 3種細(xì)胞因子與SLEDAI評(píng)分呈線性相關(guān)，分別r0.917、0.818、0.741，P 0.01（表1）。22 骨髓基質(zhì)細(xì)胞上清對(duì)刀豆蛋白A誘導(dǎo)的外周血淋巴細(xì)胞增殖的影響：在刀豆蛋白A存在的情況下，外周血淋巴細(xì)胞發(fā)生顯著的增殖效應(yīng)。但正常人及SLE患者骨髓基質(zhì)細(xì)胞上清液均對(duì)刀豆蛋白A誘導(dǎo)的外周血淋巴細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用（分別t =3.999、3.349, P 0.01）；而SLE患者的抑制作用明顯低于正常人（t =2.982, P 0.01）；活動(dòng)期SLE患者的抑制作用低于非活動(dòng)期患者，

12、但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t =0.560, P 0.05；表2）。23 單抗對(duì)刀豆蛋白A誘導(dǎo)的外周血淋巴細(xì)胞增殖的影響無論正常人骨髓基質(zhì)細(xì)胞上清液，還是SLE患者骨髓基質(zhì)細(xì)胞上清液，在分別加入抗MIP-1、抗IFN單抗后，骨髓基質(zhì)細(xì)胞上清液對(duì)外周血淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用明顯增強(qiáng)（分別t =3.122、3.950、2.935、3.618, P 0.01），加入抗IL-6則無差別不大（分別t =0.472、0.381, P 0.05）；而加入抗TGF單抗后（分別t =3.505、3.171, P 0.01），則抑制作用明顯減弱（表3）。3 討 論骨髓造血微環(huán)境由骨髓基質(zhì)細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)、黏附分子、基質(zhì)細(xì)胞

13、分泌的各種細(xì)胞因子及血管神經(jīng)等組成3。其中以骨髓基質(zhì)細(xì)胞最為重要，它是產(chǎn)生調(diào)控造血的細(xì)胞因子的主要來源之一，Dormady等4檢測(cè)小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清中有多種細(xì)胞因子表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)SLE患者骨髓基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液IL-6、MIP-1、IFN-濃度明顯增高，TGF-則降低，3種細(xì)胞因子與SLEDAI評(píng)分相關(guān)，IL-6是多功能細(xì)胞因子，參與造血、免疫和炎癥反應(yīng)，是骨髓造血干細(xì)胞早期增殖與分化的重要細(xì)胞因子，也是T、B淋巴細(xì)胞增殖分化以及活化的重要調(diào)節(jié)因子5。在負(fù)調(diào)控因子方面，TGF-作為雙向造血調(diào)控因子，它對(duì)各系造血干/祖細(xì)胞常常具有負(fù)調(diào)控作用，與多種細(xì)胞因子有拮抗作用，如IFN-、TNF-、I

14、L-1等，而SLE患者上述因子均增加，也可引起TGF-降低，MIP-1主要對(duì)粒系產(chǎn)生抑制。本研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道6SLE患者外周血MIP-1、IFN-及TGF-表達(dá)改變是一致的，說明這些因子可以反映SLE的活動(dòng)性，Papadaki等7報(bào)道認(rèn)為原發(fā)自身免疫病患者骨髓基質(zhì)細(xì)胞以負(fù)調(diào)控因子，如TNF-、IFN-表達(dá)增高為主，而原發(fā)性溶血或血小板減少患者以正調(diào)控因子如SCF、G-CSF表達(dá)增高為主，我們的研究結(jié)果則提示SLE患者骨髓基質(zhì)細(xì)胞負(fù)調(diào)控細(xì)胞因子表達(dá)異常,而正調(diào)控細(xì)胞因子中IL-6升高，可能與SLE自身抗體破壞外周血細(xì)胞后反應(yīng)性骨髓代償增生有關(guān)。骨髓基質(zhì)細(xì)胞分泌細(xì)胞因子除參與造血外也參與免疫炎性

15、反應(yīng)，對(duì)免疫活性淋巴細(xì)胞起重要作用8。胚胎期T細(xì)胞及B細(xì)胞分別在胸腺及骨髓微環(huán)境中發(fā)育，至表達(dá)功能性抗原識(shí)別受體階段，T、B細(xì)胞受體分別與微環(huán)境基質(zhì)細(xì)胞表面表達(dá)的自身抗原肽（主要組織相容性抗原復(fù)合物分子及自身抗原）呈高親合力結(jié)合，引發(fā)陰性選擇，將對(duì)自身抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答的T、B細(xì)胞克隆消除。在出生后，T及B細(xì)胞仍在發(fā)育，對(duì)自身抗原應(yīng)答不成熟的T及B細(xì)胞繼續(xù)施加克隆消除，如果生后胸腺及骨髓微環(huán)境基質(zhì)細(xì)胞缺陷，則克隆消除功能障礙，不成熟T、B細(xì)胞對(duì)自身抗原的應(yīng)答作用不能消除，導(dǎo)致自身免疫病增加。骨髓基質(zhì)細(xì)胞抑制活化的T淋巴細(xì)胞的擴(kuò)增，這種抑制與基質(zhì)細(xì)胞分泌的可溶性細(xì)胞因子有關(guān)9。也有研究10認(rèn)為基質(zhì)

16、細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子可以使記憶性T細(xì)胞存活，免于凋亡，IFN-能誘導(dǎo)吞噬細(xì)胞及抗原呈遞細(xì)胞上調(diào)主要組織相容性抗原復(fù)合物類分子，增強(qiáng)抗原處理及提呈能力，TGF-則可抑制免疫應(yīng)答，TGF-降低使淋巴細(xì)胞激活增加，從而導(dǎo)致致敏T淋巴細(xì)胞及多種自身抗體的產(chǎn)生，發(fā)生自身免疫反應(yīng)11。總之，自身免疫性疾病患者骨髓造血微環(huán)境基質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞因子分泌缺陷使記憶性T細(xì)胞存活并激活，同時(shí)對(duì)活化的T淋巴細(xì)胞擴(kuò)增抑制缺失或減少，可能導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生12。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持上述報(bào)道，本研究發(fā)現(xiàn)，正常人或SLE患者骨髓基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液均對(duì)刀豆蛋白A誘導(dǎo)的外周血淋巴細(xì)胞增殖有抑制作用，而SLE患者的抑制作用低于正常人，

17、活動(dòng)期SLE患者的抑制作用低于非活動(dòng)期患者，表明SLE患者骨髓造血微環(huán)境缺陷促使淋巴細(xì)胞的增殖活化，促進(jìn)SLE的發(fā)生、發(fā)展。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，分別加入抗MIP-1、抗IFN單抗后，骨髓基質(zhì)細(xì)胞上清液對(duì)外周血淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用明顯增強(qiáng)，而加入抗TGF單抗后，骨髓基質(zhì)細(xì)胞上清液對(duì)外周血淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用明顯減弱，而我們?cè)谥暗难芯恳寻l(fā)現(xiàn)SLE患者造血微環(huán)境中MIP-1、IFN-是升高的，TGF-是減低的，提示SLE患者骨髓造血微環(huán)境細(xì)胞因子異常分泌是導(dǎo)致淋巴細(xì)胞存活并激活的重要原因之一，骨髓造血微環(huán)境與SLE的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)系。因此，針對(duì)SLE患者骨髓基質(zhì)細(xì)胞的干預(yù)措施可能有利于疾病

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