第五章酶固定化

1、第五章酶固定化游離酶的缺點游離酶的缺點酶的穩(wěn)定性差，易受外界因素影響而失活酶的穩(wěn)定性差，易受外界因素影響而失活酶不易回收利用（酶的一次性使用）酶不易回收利用（酶的一次性使用）產(chǎn)物不易分純，且難連續(xù)化生產(chǎn)產(chǎn)物不易分純，且難連續(xù)化生產(chǎn)酶的催化效率不夠高酶的催化效率不夠高Contents of chapter 5概述概述第一節(jié)第一節(jié) 酶固定化酶固定化第二節(jié)第二節(jié) 細胞固定化細胞固定化第三節(jié)第三節(jié) 原生質(zhì)體固定化原生質(zhì)體固定化 2 . 什么是固定化酶？什么是固定化酶？水溶性酶水不溶性載體水溶性酶活化基團固定化酶酶的固定化固定化酶概念固定化酶概念指固定在一定載體上并在一定的空間范圍內(nèi)進行催指固定在一定載

2、體上并在一定的空間范圍內(nèi)進行催化反應(yīng)的酶?；磻?yīng)的酶。通過吸附、偶聯(lián)、交聯(lián)、包埋等物理或化學(xué)的方法通過吸附、偶聯(lián)、交聯(lián)、包埋等物理或化學(xué)的方法制備成的具有催化活性的水不溶性酶。制備成的具有催化活性的水不溶性酶。2. 固定化酶的制備方法固定化酶的制備方法吸附法離子鍵結(jié)合法共價鍵結(jié)合法交聯(lián)法凝膠包埋法半透膜包埋法固定化方法非共價結(jié)合法化學(xué)結(jié)合法包埋法熱處理法吸附法吸附法1. 吸附作用力吸附作用力2. 固體吸附劑包括活性炭、氧化鋁、硅藻土、固體吸附劑包括活性炭、氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅膠、羥基磷灰石多孔陶瓷、多孔玻璃、硅膠、羥基磷灰石3. 優(yōu)缺點優(yōu)缺點（3）包埋法）包埋法將酶或含酶菌體

3、包埋在各種多孔載體中，使酶固定將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中，使酶固定化的方法稱為包埋法?；姆椒ǚQ為包埋法。只適合作用于小分子底物和產(chǎn)物的酶。只適合作用于小分子底物和產(chǎn)物的酶。凝膠包埋法（網(wǎng)格型）半透膜包埋法（微囊型）包埋法1）凝膠包埋法（網(wǎng)格型）凝膠包埋法（網(wǎng)格型）將酶或含酶菌體包埋在高分子凝膠細微網(wǎng)格中，制將酶或含酶菌體包埋在高分子凝膠細微網(wǎng)格中，制成一定形狀的固定化酶，稱為網(wǎng)格型包埋法。也稱成一定形狀的固定化酶，稱為網(wǎng)格型包埋法。也稱為凝膠包埋法。為凝膠包埋法。首先被采用的網(wǎng)格包埋法是：首先被采用的網(wǎng)格包埋法是：u 固定化胰蛋白酶固定化胰蛋白酶u 木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶u 淀粉酶淀粉

4、酶Enzyme+N, N-甲叉雙丙稀酰胺甲叉雙丙稀酰胺, 丙稀酰胺丙稀酰胺引發(fā)劑引發(fā)劑inactiation2）半透膜包埋法（微囊型）半透膜包埋法（微囊型）將酶或含酶細胞包埋在高分子半透膜中的固定化方將酶或含酶細胞包埋在高分子半透膜中的固定化方法。法。界面聚合法是用化學(xué)手段制備微囊的方法。利用親水性單體和疏水性單體在油水界面上發(fā)生聚合反應(yīng)形成聚合體而將酶包裹起來。（3）結(jié)合法）結(jié)合法1）共價結(jié)合法）共價結(jié)合法 通過共價鍵將酶與載體結(jié)合的方法。通過共價鍵將酶與載體結(jié)合的方法。 結(jié)合方法 .將載體有關(guān)基團活化，然后將酶有關(guān)基因發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)； 與載體共價結(jié)合的酶的功能基團 -氨基，-氨基，,或位的羧

5、基、巰基、羥基、咪唑基、酚基等。載體天然有機載體（多糖、蛋白質(zhì)、細胞等）無機物（玻璃、陶瓷等）合成聚合物（聚酯、聚胺、尼龍等）優(yōu)缺點.優(yōu)點：酶與載體結(jié)合牢固，一般不會因底物濃度高或存在鹽類等原因而輕易脫落。 .缺點：反應(yīng)條件苛刻，操作條件復(fù)雜； 酶蛋白高級結(jié)構(gòu)變化，破壞活性中心，活力降低。載體活化方法A重氮法B疊氮法C烷基化反應(yīng)法D溴化氰法A重氮法重氮法反應(yīng)示意式反應(yīng)示意式 NH2NaNO2/HClN2+Cl-酶-TyrN=NOHCH2酶重氮鹽衍生物載體固定化酶A重氮法重氮法將含有苯氨基的不溶性載體與亞硝酸反應(yīng)，生成重將含有苯氨基的不溶性載體與亞硝酸反應(yīng)，生成重氮鹽衍生物，使載體引進活潑的重氮

6、基團。氮鹽衍生物，使載體引進活潑的重氮基團。載體活化后，活潑的重氮基團可與酶分子中的酚基載體活化后，活潑的重氮基團可與酶分子中的酚基或咪唑基發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)而制得固定化酶。或咪唑基發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)而制得固定化酶。B. 疊氮法疊氮法反應(yīng)示意式反應(yīng)示意式OCH2COOHOCH2COOCH2CH3OH/HClOCH2CONHNH2NH2NH2（肼）OCH2CON3NaNO2/HClOCH2CONH-酶酶-NH2B. 疊氮法疊氮法對含有羧基的載體，與肼基作用生成含有酰肼基團對含有羧基的載體，與肼基作用生成含有酰肼基團的載體，再與亞硝酸活化，生成疊氮化合物。最后的載體，再與亞硝酸活化，生成疊氮化合物。最后與酶偶

7、聯(lián)。與酶偶聯(lián)。 C烷基化反應(yīng)法烷基化反應(yīng)法含羥基的載體可用三氯三嗪等多鹵代物進行活化，形成含有鹵含羥基的載體可用三氯三嗪等多鹵代物進行活化，形成含有鹵素基團的活化載體。素基團的活化載體。鹵素基團可與酶分子上的氨基、巰基、羥基等發(fā)生烷基化鹵素基團可與酶分子上的氨基、巰基、羥基等發(fā)生烷基化反應(yīng)，制備成固定化酶。反應(yīng)，制備成固定化酶。OHO酶OD溴化氰法溴化氰法本方法主要用溴化氰（本方法主要用溴化氰（CNBr）活化多糖類（含有）活化多糖類（含有羥基）物質(zhì)（如纖維素、葡聚糖、瓊脂糖等，其中羥基）物質(zhì)（如纖維素、葡聚糖、瓊脂糖等，其中以瓊脂糖為載體的占多數(shù)以瓊脂糖為載體的占多數(shù)），生），生成亞氨基碳酸衍

8、生物。成亞氨基碳酸衍生物。D 溴化氰法溴化氰法亞氨基碳酸基團在微堿性條件下，可與酶分子上的亞氨基碳酸基團在微堿性條件下，可與酶分子上的氨基反應(yīng)，制成固定化酶。氨基反應(yīng)，制成固定化酶。D 溴化氰法溴化氰法用溴化氰法活化瓊脂糖制備得到的固定化酶目前使用溴化氰法活化瓊脂糖制備得到的固定化酶目前使用很廣，特別用作親和層析，有著良好的性能。用很廣，特別用作親和層析，有著良好的性能。共價結(jié)合法中載體的活化方法共價結(jié)合法中載體的活化方法重氮法重氮法疊氮法疊氮法烷基化法烷基化法溴化氰法溴化氰法含有苯氨基（亞硝酸）含有酰肼基/羧基（亞硝酸）含有羥基（三氯三嗪等多鹵代物）含有羥基（溴化氰活化）2）交聯(lián)法）交聯(lián)法借

9、助雙功能試劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)作用，制成借助雙功能試劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)作用，制成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化酶的方法稱為交聯(lián)法。也可用于網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化酶的方法稱為交聯(lián)法。也可用于含酶菌體或菌體碎片的固定化。含酶菌體或菌體碎片的固定化。常用試劑：戊二醛、異氰酸酯、常用試劑：戊二醛、異氰酸酯、N，N乙烯馬來亞乙烯馬來亞胺、雙重氮聯(lián)苯胺等。應(yīng)用最廣泛的是戊二醛，它胺、雙重氮聯(lián)苯胺等。應(yīng)用最廣泛的是戊二醛，它兩個醛基都可以與酶或蛋白質(zhì)的游離氨基形成席夫兩個醛基都可以與酶或蛋白質(zhì)的游離氨基形成席夫堿（堿（shiff）。）。第一篇報道是：戊二醛交聯(lián)羧肽酶得到一種分子間第一篇報道是：戊二醛交聯(lián)羧肽酶得到一種分子

10、間交聯(lián)的固定化酶。交聯(lián)的固定化酶。（4）熱處理法）熱處理法將含酶細胞在一定溫度下加熱處理一段時間，使酶將含酶細胞在一定溫度下加熱處理一段時間，使酶穩(wěn)定在菌體內(nèi)，而制備得到固定化菌體。穩(wěn)定在菌體內(nèi)，而制備得到固定化菌體。熱處理法只適用于熱穩(wěn)定性較好的酶的固定化，在熱處理法只適用于熱穩(wěn)定性較好的酶的固定化，在熱處理時，要嚴格控制好加熱溫度和時間，以免引熱處理時，要嚴格控制好加熱溫度和時間，以免引起酶的變性失活。起酶的變性失活。步驟step總體積Volume(ml)總活力Total activity(u)總蛋白Total protein(mg)比活力Specific activity(u/mg)純化

11、倍數(shù)Purification(fold)收 率Yield(%)粗酶1040460070168.1乙醇沉淀9014257410.9DEAE-Sepharose柱層析11466292.0HiTrap-Q柱層析19422180.3下表是某酶的純化總結(jié)表，試計算比活力，回收率及純化倍數(shù)。2736.913080.223314.5140726.714.88.551.410030109實驗實驗 木瓜蛋白酶的固定化木瓜蛋白酶的固定化 實驗原理：實驗原理：載體：尼龍載體：尼龍固定化方法：共價結(jié)合法固定化方法：共價結(jié)合法尼龍長鏈中的酰胺鍵經(jīng)尼龍長鏈中的酰胺鍵經(jīng)HCl水解后，產(chǎn)生游離的水解后，產(chǎn)生游離的-NH基，在

12、一定條件下與雙功能試劑戊二醛中的一基，在一定條件下與雙功能試劑戊二醛中的一個個-CHO基縮合，戊二醛中的另一個基縮合，戊二醛中的另一個-CHO基則與基則與酶中的游離氨基縮合，形成尼龍酶中的游離氨基縮合，形成尼龍(載體載體)-戊二醛戊二醛(交交聯(lián)劑聯(lián)劑)-酶，即尼龍固定化酶。酶，即尼龍固定化酶。實驗實驗 木瓜蛋白酶的固定化木瓜蛋白酶的固定化 酶的固定化步驟：酶的固定化步驟：（1）每組?。┟拷M取5塊尼龍布洗凈、晾干，浸入含塊尼龍布洗凈、晾干，浸入含18.6% CaCl2溶液和溶液和18.6%水的甲醇溶液中，在室溫下水的甲醇溶液中，在室溫下保溫保溫10s左右，并輕輕攪拌至尼龍布發(fā)粘。取出左右，并輕輕

13、攪拌至尼龍布發(fā)粘。取出后用水沖去污物，用吸水紙吸干。后用水沖去污物，用吸水紙吸干。（2）將尼龍布用）將尼龍布用3.65mol/L HCl溶液在室溫下水解溶液在室溫下水解45min，用水洗至，用水洗至pH值中性。值中性。（3）將尼龍布用）將尼龍布用5%戊二醛溶液在室溫下浸泡偶聯(lián)戊二醛溶液在室溫下浸泡偶聯(lián)20min。實驗實驗 木瓜蛋白酶的固定化木瓜蛋白酶的固定化 酶的固定化步驟：酶的固定化步驟：（4）取出尼龍布，用）取出尼龍布，用0.1mol/L 磷酸緩沖液（磷酸緩沖液（pH值值7.8）反復(fù)洗滌，洗去多余的戊二醛，吸干之后，）反復(fù)洗滌，洗去多余的戊二醛，吸干之后，立即用酶液（立即用酶液（0.51m

14、g/mL）在）在4下固定下固定3.5h（酶液用量每塊尼龍布不宜超過（酶液用量每塊尼龍布不宜超過0.8mL）。）。（5）從酶液中取出尼龍布（保留殘余酶液作測定）從酶液中取出尼龍布（保留殘余酶液作測定用），用用），用0.5mol/L NaCl溶液（用溶液（用0.1mol/L磷酸緩磷酸緩沖液（沖液（pH值值7.2）配制），洗去多余的酶蛋白，）配制），洗去多余的酶蛋白，即為尼龍固定化酶。即為尼龍固定化酶。實驗實驗 木瓜蛋白酶的固定化木瓜蛋白酶的固定化 酶活力測定：酶活力測定：（1）溶液酶活力測定：?。┤芤好富盍y定：取0.2mL酶液，加入酶液，加入1.8mL激激活劑，于活劑，于37下預(yù)熱下預(yù)熱10mi

15、n，加入，加入37預(yù)熱的預(yù)熱的0.5%酪蛋白溶液酪蛋白溶液1mL，準確反應(yīng)，準確反應(yīng)10min，然后加入，然后加入10%三氯乙酸溶液三氯乙酸溶液2.0mL終止酶反應(yīng)。對照管先加入終止酶反應(yīng)。對照管先加入10%三氯乙酸溶液，后加酪蛋白溶液，其他與測定三氯乙酸溶液，后加酪蛋白溶液，其他與測定管相同，以管相同，以4000r/min的轉(zhuǎn)速離心的轉(zhuǎn)速離心5min或過濾，取或過濾，取其上清液于波長其上清液于波長280nm處測定消光值。處測定消光值。 在上述條件下，每在上述條件下，每10min增加增加0.001個消光值為個消光值為1個酶單位個酶單位(U)(以下同以下同)。 實驗實驗 木瓜蛋白酶的固定化木瓜蛋

16、白酶的固定化 酶活力測定：酶活力測定：（2）殘留酶活力測定：方法同溶液酶活力測定。）殘留酶活力測定：方法同溶液酶活力測定。（3）固定化酶活力測定：取一塊尼龍布固定化酶，）固定化酶活力測定：取一塊尼龍布固定化酶，加入加入2.0mL激活劑，其余步驟與溶液酶測定相同。激活劑，其余步驟與溶液酶測定相同。實驗實驗 木瓜蛋白酶的固定化木瓜蛋白酶的固定化 結(jié)果計算：結(jié)果計算： 固定化酶總活力固定化酶總活力活力回收活力回收= 100% 溶液酶總活力溶液酶總活力 固定化酶總活力數(shù)固定化酶總活力數(shù)相對活力相對活力= 100% 溶液酶總活力數(shù)溶液酶總活力數(shù)-殘留酶活力數(shù)殘留酶活力數(shù)3. 固定化酶的性質(zhì)固定化酶的性質(zhì)

17、（1）固定化后酶活力的變化固定化后酶活力的變化酶活力降低，反應(yīng)速度下降酶活力降低，反應(yīng)速度下降原因：原因：1）構(gòu)象改變：酶分子在固定化過程中，空間構(gòu)象會）構(gòu)象改變：酶分子在固定化過程中，空間構(gòu)象會有所變化，甚至影響了活性中心的氨基酸。有所變化，甚至影響了活性中心的氨基酸。2）空間位阻：固定化后，酶分子空間自由度受到限）空間位阻：固定化后，酶分子空間自由度受到限制（空間位阻），會直接影響到活性中心對底物的制（空間位阻），會直接影響到活性中心對底物的定位作用。定位作用。3）內(nèi)擴散作用：內(nèi)擴散阻力使底物分子于活性中心）內(nèi)擴散作用：內(nèi)擴散阻力使底物分子于活性中心的接近受阻。的接近受阻。4）立體障礙：包

18、埋時酶被高分子物質(zhì)包埋，大分子）立體障礙：包埋時酶被高分子物質(zhì)包埋，大分子不能透過膜與酶接近。不能透過膜與酶接近。（2）固定化酶的穩(wěn)定性）固定化酶的穩(wěn)定性大多提高大多提高1）穩(wěn)定性大多提高）穩(wěn)定性大多提高熱穩(wěn)定性大多提高，有些反而下降熱穩(wěn)定性大多提高，有些反而下降對各種有機試劑及酶抑制劑的穩(wěn)定性提高對各種有機試劑及酶抑制劑的穩(wěn)定性提高對不同對不同pH（酸度）穩(wěn)定性，對分解酶的穩(wěn)定性、（酸度）穩(wěn)定性，對分解酶的穩(wěn)定性、貯存穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性提高。貯存穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性提高。2）穩(wěn)定性提高的原因）穩(wěn)定性提高的原因固定化后，酶分子與載體多點連接，可防止酶分子固定化后，酶分子與載體多點連接，可防止酶分

19、子伸展變形；伸展變形；酶活力的緩慢釋放；酶活力的緩慢釋放；抑制自降解，提高了酶穩(wěn)定性。抑制自降解，提高了酶穩(wěn)定性。青霉素?；福汗潭ɑ冈趐H5.510.3穩(wěn)定，游離酶僅在pH7.09.0穩(wěn)定。（3）固定化酶的最適溫度變化）固定化酶的最適溫度變化可能提高可能提高固定化酶的最適作用溫度一般與游離酶差不多，活固定化酶的最適作用溫度一般與游離酶差不多，活化能變化也不大，有些會發(fā)生變化；化能變化也不大，有些會發(fā)生變化；由于固定化，酶的熱穩(wěn)定性提高，所以最適溫度也由于固定化，酶的熱穩(wěn)定性提高，所以最適溫度也隨之提高；隨之提高；固定化酶的最適作用溫度可能會受到固定化方法和固定化酶的最適作用溫度可能會受到固

20、定化方法和固定化載體的影響。固定化載體的影響。（4）固定化酶的最適）固定化酶的最適pH發(fā)生改變發(fā)生改變酶經(jīng)固定化后，對底物作用的最適酶經(jīng)固定化后，對底物作用的最適pH和酶活力和酶活力-pH曲線常常發(fā)生偏移；曲線常常發(fā)生偏移；2）載體性質(zhì)對最適）載體性質(zhì)對最適pH的影響；的影響；一般用帶負電荷載體（陰離子聚合物）制備的固定一般用帶負電荷載體（陰離子聚合物）制備的固定化酶，其最適化酶，其最適pH。一般用帶正電荷載體（陽離子聚合物）制備的固定一般用帶正電荷載體（陽離子聚合物）制備的固定化酶，其最適化酶，其最適pH。1）pH對酶活性的影響：改變酶的空間構(gòu)象影響酶的催化基團的解離影響酶的結(jié)合基團的解離改

21、變底物的解離狀態(tài)，酶與底物不能結(jié)合或結(jié)合后不能生成產(chǎn)物。3）產(chǎn)物性質(zhì)對最適）產(chǎn)物性質(zhì)對最適pH的影響；的影響；產(chǎn)物酸性，其最適產(chǎn)物酸性，其最適pH。產(chǎn)物堿性，其最適產(chǎn)物堿性，其最適pH。產(chǎn)物中性，其最適產(chǎn)物中性，其最適pH不變。不變。（5）底物特異性）底物特異性發(fā)生改變發(fā)生改變對作用于低分子底物的酶，固定化前后的底物特異對作用于低分子底物的酶，固定化前后的底物特異性沒有明顯變化；性沒有明顯變化；對于可作用于大分子底物，又可作用于小分子底物對于可作用于大分子底物，又可作用于小分子底物的酶，固定化酶的底物特異性往往會發(fā)生變化。的酶，固定化酶的底物特異性往往會發(fā)生變化。固定化酶底物特異性的改變，是由

22、于載體的空間位固定化酶底物特異性的改變，是由于載體的空間位阻作用引起的。阻作用引起的。（6）固定化酶的米氏常數(shù)（）固定化酶的米氏常數(shù)（Km）發(fā)生改變發(fā)生改變當酶結(jié)合于電中性載體時，由于擴散限制，造成表當酶結(jié)合于電中性載體時，由于擴散限制，造成表觀觀Km；由于高級結(jié)構(gòu)變化及載體影響引起酶與底物親和力由于高級結(jié)構(gòu)變化及載體影響引起酶與底物親和力變化，從而使變化，從而使Km變化。當載體與底物電荷相反，變化。當載體與底物電荷相反，固定化酶的表觀固定化酶的表觀Km；當載體與底物電荷相同，固；當載體與底物電荷相同，固定化酶的表觀定化酶的表觀Km顯著增加。顯著增加。Km值又受載體的疏水性及溶液中離子強度的影

23、響。值又受載體的疏水性及溶液中離子強度的影響。改變可能改變發(fā)生變化固定化酶的性質(zhì)固定化酶的性質(zhì)固定化酶活力固定化酶活力固定化酶的穩(wěn)定性固定化酶的穩(wěn)定性固定化酶的最適溫度固定化酶的最適溫度固定化酶的最適固定化酶的最適pH固定化酶的底物特異性固定化酶的底物特異性固定化酶的米氏常數(shù)（固定化酶的米氏常數(shù)（Km）活力降低大多提高可能提高載體性質(zhì)帶負電荷：固定化酶pH帶正電荷：固定化酶pH產(chǎn)物性質(zhì)產(chǎn)物酸性：固定化酶pH產(chǎn)物堿性：固定化酶pH產(chǎn)物中性：固定化酶pH不變作用于小分子底物的酶不變可作用于小分子及大分子底物的酶改變載體與底物電荷相反Km降低載體與底物電荷相同Km升高5.4 細胞和原生質(zhì)體固定化細胞

24、和原生質(zhì)體固定化1、細胞固定化、細胞固定化細胞的固定化：通過各種方法將細胞與水不溶性載體結(jié)細胞的固定化：通過各種方法將細胞與水不溶性載體結(jié)合，制備固定化細胞的過程。合，制備固定化細胞的過程。固定化細胞：指被限制自由移動的細胞，即細胞受到物固定化細胞：指被限制自由移動的細胞，即細胞受到物理、化學(xué)等因素的約束或限制在一定的空間界限內(nèi)，但理、化學(xué)等因素的約束或限制在一定的空間界限內(nèi)，但細胞仍保留催化活性并具有能反復(fù)或連續(xù)適用的活力。細胞仍保留催化活性并具有能反復(fù)或連續(xù)適用的活力。（1） 固定化細胞的分類固定化細胞的分類按細胞類型分類按細胞類型分類固定化微生物細胞固定化微生物細胞固定化植物細胞固定化植

25、物細胞固定化動物細胞固定化動物細胞按生理狀態(tài)分按生理狀態(tài)分固定化死細胞固定化死細胞固定化活細胞固定化活細胞u固定化靜止細胞和饑餓細胞固定化靜止細胞和饑餓細胞u固定化生長細胞（增殖細胞）固定化生長細胞（增殖細胞）：完整細胞、細胞碎片、細胞器：較適合于單酶反應(yīng)：更適合于多酶反應(yīng)（2）固定化（增殖）細胞的優(yōu)點和缺點）固定化（增殖）細胞的優(yōu)點和缺點優(yōu)點優(yōu)點.有利于提高細胞的存活率和穩(wěn)定性；有利于提高細胞的存活率和穩(wěn)定性；.縮短發(fā)酵周期，提高生產(chǎn)能力（產(chǎn)率）；縮短發(fā)酵周期，提高生產(chǎn)能力（產(chǎn)率）；.提高發(fā)酵穩(wěn)定性，可在較長時間內(nèi)反復(fù)和連續(xù)使提高發(fā)酵穩(wěn)定性，可在較長時間內(nèi)反復(fù)和連續(xù)使用；用；.易與培養(yǎng)液與產(chǎn)

26、物分開，利于產(chǎn)品的分離純化，易與培養(yǎng)液與產(chǎn)物分開，利于產(chǎn)品的分離純化，提高產(chǎn)品質(zhì)量。提高產(chǎn)品質(zhì)量。（2）固定化（增殖）細胞的優(yōu)點和缺點）固定化（增殖）細胞的優(yōu)點和缺點缺點缺點.利用的僅是胞內(nèi)酶，副產(chǎn)物多；利用的僅是胞內(nèi)酶，副產(chǎn)物多；.細胞膜、細胞壁及載體存在擴散限制作用；細胞膜、細胞壁及載體存在擴散限制作用；.載體形成的孔隙大小影響高分子底物和產(chǎn)物的通載體形成的孔隙大小影響高分子底物和產(chǎn)物的通透性。透性。（3）固定化細胞的制備（）固定化細胞的制備（P169-178）一般說，對于一步和兩步反應(yīng)的轉(zhuǎn)化過程，用固定一般說，對于一步和兩步反應(yīng)的轉(zhuǎn)化過程，用固定化酶較合適；對多步轉(zhuǎn)化，采用整體細胞有利。

27、化酶較合適；對多步轉(zhuǎn)化，采用整體細胞有利。固定方法吸附法包埋法：制備固定化細胞的主要方法。：凝膠包埋法是應(yīng)用最廣泛的方法。瓊脂凝膠包埋法海藻酸鈣凝膠包埋法角叉菜膠包埋法明膠包埋法聚丙烯酰胺凝膠包埋法光交聯(lián)樹脂包埋法研究熱點研究熱點光交聯(lián)樹脂包埋法光交聯(lián)樹脂包埋法例：相對分子量為例：相對分子量為1000-3000的光交聯(lián)聚氨酯預(yù)聚物等，加入的光交聯(lián)聚氨酯預(yù)聚物等，加入1%左右的光敏劑，加水配成一定濃度，加熱至左右的光敏劑，加水配成一定濃度，加熱至50，然后，然后與一定濃度的細胞懸浮液混合均勻，攤成一定厚度的薄層，與一定濃度的細胞懸浮液混合均勻，攤成一定厚度的薄層，用紫外照射用紫外照射3min，就

28、可制得。，就可制得?；钚蕴抗潭ɑa(chǎn)脂肪酶的發(fā)酵性絲孢酵母細胞的研究活性炭固定化產(chǎn)脂肪酶的發(fā)酵性絲孢酵母細胞的研究摘要：以活性碳為載體，采用吸附培養(yǎng)的方法將發(fā)摘要：以活性碳為載體，采用吸附培養(yǎng)的方法將發(fā)酵性絲孢酵母細胞固定化，確定了吸附培養(yǎng)固定化酵性絲孢酵母細胞固定化，確定了吸附培養(yǎng)固定化的適宜條件，并測定了固定化細胞的保存穩(wěn)定性和的適宜條件，并測定了固定化細胞的保存穩(wěn)定性和使用穩(wěn)定性。使用穩(wěn)定性。結(jié)果表明，在結(jié)果表明，在100mL發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)基中(250mL搖瓶搖瓶)添添加加1.0 g活性碳于活性碳于30、160 r/min吸附培養(yǎng)吸附培養(yǎng)48h，可，可吸附較多細胞。將固定化細胞于吸附

29、較多細胞。將固定化細胞于40保存保存30 d脂肪脂肪酶活力無明顯下降。用固定化細胞催化人豆油轉(zhuǎn)酯酶活力無明顯下降。用固定化細胞催化人豆油轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)，連續(xù)催化化反應(yīng)，連續(xù)催化5批后酯化率仍超過批后酯化率仍超過50。載體的預(yù)處理載體的預(yù)處理將一定量活性炭顆粒置于將一定量活性炭顆粒置于lmol/L HCl溶液中，于溶液中，于50攪拌攪拌1h后除去酸液，用去離子水反復(fù)沖洗至洗后除去酸液，用去離子水反復(fù)沖洗至洗液液pH值為中性，然后于值為中性，然后于130烘干待用。烘干待用。固定化細胞的吸附培養(yǎng)與處理固定化細胞的吸附培養(yǎng)與處理在在l00mL發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)基中(250mL搖瓶搖瓶)加入一定量經(jīng)加入一

30、定量經(jīng)預(yù)處理的載體，接入預(yù)處理的載體，接入10的液體種子，于的液體種子，于30、160r/min搖床發(fā)酵，濾出載體，用去離子水和搖床發(fā)酵，濾出載體，用去離子水和50mmol/L磷酸緩沖液磷酸緩沖液(pH 7.0)洗滌洗滌3次，風(fēng)干制得次，風(fēng)干制得固定化細胞。固定化細胞。固定化細胞的保存穩(wěn)定性固定化細胞的保存穩(wěn)定性將固定化細胞置于將固定化細胞置于4保存，定期取樣測定胞內(nèi)脂保存，定期取樣測定胞內(nèi)脂肪酶活力，以游離細胞作對照舊。肪酶活力，以游離細胞作對照舊。固定化細胞的使用穩(wěn)定性固定化細胞的使用穩(wěn)定性用固定化細胞催化大豆油進行轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)，每反應(yīng)用固定化細胞催化大豆油進行轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)，每反應(yīng)一批后，回收

31、固定化細胞，用丙酮充分洗滌，風(fēng)干，一批后，回收固定化細胞，用丙酮充分洗滌，風(fēng)干，加入新的反應(yīng)體系中，繼續(xù)進行轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)。加入新的反應(yīng)體系中，繼續(xù)進行轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)。5.4 細胞和原生質(zhì)體固定化細胞和原生質(zhì)體固定化2. 原生質(zhì)體的固定化原生質(zhì)體的固定化（1）原生質(zhì)體的制備）原生質(zhì)體的制備1）制備過程）制備過程 將對數(shù)生長期的細胞收集將對數(shù)生長期的細胞收集懸浮在含有滲透壓穩(wěn)定懸浮在含有滲透壓穩(wěn)定劑的高滲緩沖液中劑的高滲緩沖液中加入水解酶加入水解酶分離分離得到原生得到原生質(zhì)體質(zhì)體2）細胞壁水解酶）細胞壁水解酶細菌：溶菌酶細菌：溶菌酶酵母菌：蝸牛消化酶酵母菌：蝸牛消化酶霉菌：幾丁質(zhì)酶霉菌：幾丁質(zhì)酶植物：纖

32、維素酶，果膠酶植物：纖維素酶，果膠酶（2）原生質(zhì)體固定化）原生質(zhì)體固定化 將原生質(zhì)替制備好后，把離心收集到的原生質(zhì)體重將原生質(zhì)替制備好后，把離心收集到的原生質(zhì)體重新懸浮在含有滲透壓穩(wěn)定劑的緩沖液中，配成一定新懸浮在含有滲透壓穩(wěn)定劑的緩沖液中，配成一定濃度的原生質(zhì)體懸浮液，然后采用包埋法制成固定濃度的原生質(zhì)體懸浮液，然后采用包埋法制成固定化原生質(zhì)體。化原生質(zhì)體。（3）固定化原生質(zhì)體的特點）固定化原生質(zhì)體的特點1）增加細胞的通透性，利于氧氣及營養(yǎng)物質(zhì)的傳遞）增加細胞的通透性，利于氧氣及營養(yǎng)物質(zhì)的傳遞和吸收，利于胞內(nèi)產(chǎn)物的釋放，可顯著提高產(chǎn)率。和吸收，利于胞內(nèi)產(chǎn)物的釋放，可顯著提高產(chǎn)率。2）有載體的

33、保護作用，具有較好的操作穩(wěn)定性和保）有載體的保護作用，具有較好的操作穩(wěn)定性和保存穩(wěn)定性，可反復(fù)使用或連續(xù)使用較長時間，利于存穩(wěn)定性，可反復(fù)使用或連續(xù)使用較長時間，利于連續(xù)化生產(chǎn)。連續(xù)化生產(chǎn)。3）易與發(fā)酵產(chǎn)物分開，有利于產(chǎn)物的分離純化，提）易與發(fā)酵產(chǎn)物分開，有利于產(chǎn)物的分離純化，提高產(chǎn)品質(zhì)量。高產(chǎn)品質(zhì)量。4）固定化原生質(zhì)體發(fā)酵的培養(yǎng)基中需添加滲透壓穩(wěn)）固定化原生質(zhì)體發(fā)酵的培養(yǎng)基中需添加滲透壓穩(wěn)定劑，以保持原生質(zhì)體的穩(wěn)定性。定劑，以保持原生質(zhì)體的穩(wěn)定性。輔酶、細胞及原生質(zhì)體的固定化方法輔酶、細胞及原生質(zhì)體的固定化方法輔酶輔酶多采用共價結(jié)合法多采用共價結(jié)合法細胞細胞吸附法吸附法凝膠包埋法凝膠包埋法原

34、生質(zhì)體原生質(zhì)體包埋法包埋法上節(jié)課主要內(nèi)容上節(jié)課主要內(nèi)容固定化酶的性質(zhì)固定化酶的性質(zhì)輔酶的固定化輔酶的固定化細胞及原生質(zhì)體的固定化細胞及原生質(zhì)體的固定化改變可能改變發(fā)生變化固定化酶的性質(zhì)固定化酶的性質(zhì)固定化酶活力固定化酶活力固定化酶的穩(wěn)定性固定化酶的穩(wěn)定性固定化酶的最適溫度固定化酶的最適溫度固定化酶的最適固定化酶的最適pH固定化酶的底物特異性固定化酶的底物特異性固定化酶的米氏常數(shù)（固定化酶的米氏常數(shù)（Km）活力降低大多提高可能提高載體性質(zhì)帶負電荷：固定化酶pH帶正電荷：固定化酶pH產(chǎn)物性質(zhì)產(chǎn)物酸性：固定化酶pH產(chǎn)物堿性：固定化酶pH產(chǎn)物中性：固定化酶pH不變作用于小分子底物的酶不變可作用于小分子

35、及大分子底物的酶改變載體與底物電荷相反Km降低載體與底物電荷相同Km升高輔酶、細胞及原生質(zhì)體的固定化方法輔酶、細胞及原生質(zhì)體的固定化方法輔酶輔酶多采用共價結(jié)合法多采用共價結(jié)合法細胞細胞吸附法吸附法凝膠包埋法凝膠包埋法原生質(zhì)體原生質(zhì)體包埋法包埋法評價固定化酶（細胞）的指標評價固定化酶（細胞）的指標1、固定化酶（細胞）的活力、固定化酶（細胞）的活力2、偶聯(lián)率及相對活力、偶聯(lián)率及相對活力3、固定化酶（細胞）的半衰期、固定化酶（細胞）的半衰期 5.5 固定化酶（細胞）的應(yīng)用固定化酶（細胞）的應(yīng)用固定化酶在基礎(chǔ)理論研究中應(yīng)用固定化酶在基礎(chǔ)理論研究中應(yīng)用固定化酶和親和色譜固定化酶和親和色譜固定化酶（細胞）

36、在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用固定化酶（細胞）在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用固定化酶在醫(yī)藥治療上的應(yīng)用固定化酶在醫(yī)藥治療上的應(yīng)用固定化酶在分析化學(xué)中應(yīng)用固定化酶在分析化學(xué)中應(yīng)用固定化酶與環(huán)境保護固定化酶與環(huán)境保護固定化酶在新能源開發(fā)中的應(yīng)用固定化酶在新能源開發(fā)中的應(yīng)用1. 在基礎(chǔ)理論研究中的應(yīng)用在基礎(chǔ)理論研究中的應(yīng)用（1）闡明酶反應(yīng)的機理）闡明酶反應(yīng)的機理在多酶反應(yīng)中，將酶固定化后裝成酶柱，說明每一個酶在多酶反應(yīng)中，將酶固定化后裝成酶柱，說明每一個酶的作用。的作用。（2）酶亞基性質(zhì)的研究）酶亞基性質(zhì)的研究采用固定化方法，控制一定的條件，使多亞基酶采用固定化方法，控制一定的條件，使多亞基酶中只有一個亞基與載體相連，

37、再通過一定的方法，中只有一個亞基與載體相連，再通過一定的方法，除去未被固定的亞基，從而研究單亞基的性質(zhì)。除去未被固定的亞基，從而研究單亞基的性質(zhì)。己糖激酶葡萄糖葡萄糖-6-磷酸果糖-6-磷酸磷酸葡萄糖異構(gòu)酶磷酸果糖激酶果糖-1,6-二磷酸醛縮酶3-磷酸甘油醛磷酸二羥丙酮活化載體 載 體+活化+例如：醛縮酶亞基活力的測定例如：醛縮酶亞基活力的測定8mol/L尿素透析醛縮酶亞基活力測定固定化衍生物活力/U蛋白質(zhì)/mg比活力/Umg-1全酶1001004.5亞基9.827.51.6（3）揭示酶原激活機理）揭示酶原激活機理有時酶原激活并不涉及蛋白水解。有時酶原激活并不涉及蛋白水解。如：酪氨酸酶，固定化

38、后，不需水解就可活化至如：酪氨酸酶，固定化后，不需水解就可活化至天然酶活的天然酶活的2030。說明蛋白酶結(jié)構(gòu)重排后可激活酶的一些活力。說明蛋白酶結(jié)構(gòu)重排后可激活酶的一些活力。（4）研究蛋白質(zhì)）研究蛋白質(zhì)-核酸分子結(jié)構(gòu)核酸分子結(jié)構(gòu)如：用雙功能試劑測定酶側(cè)鏈基團之間的距離；如：用雙功能試劑測定酶側(cè)鏈基團之間的距離； 用交聯(lián)法分析寡聚蛋白的四級結(jié)構(gòu)。用交聯(lián)法分析寡聚蛋白的四級結(jié)構(gòu)。2. 親和分離系統(tǒng)親和分離系統(tǒng)（1）生物親和技術(shù)的基礎(chǔ)：生物活性化合物特異性）生物親和技術(shù)的基礎(chǔ)：生物活性化合物特異性信息的綜合。信息的綜合。（2）親和分離）親和分離 利用生命現(xiàn)象中生物分子間特有的高親和力、高專利用生命現(xiàn)

39、象中生物分子間特有的高親和力、高專一性，可逆結(jié)合而設(shè)計的一種十分巧妙的純化方法，一性，可逆結(jié)合而設(shè)計的一種十分巧妙的純化方法，是唯一的一種能夠體現(xiàn)待分離物質(zhì)間生物學(xué)功能差是唯一的一種能夠體現(xiàn)待分離物質(zhì)間生物學(xué)功能差異的分離方法。異的分離方法。（3）親和分離種類）親和分離種類1）將某種作為配基的生物分子偶聯(lián)于固相載體上制）將某種作為配基的生物分子偶聯(lián)于固相載體上制成親和吸附劑，用作色譜的填充劑來分離與之特異成親和吸附劑，用作色譜的填充劑來分離與之特異結(jié)合的配體，然后將配體洗脫下來并回收結(jié)合的配體，然后將配體洗脫下來并回收-親和色親和色譜法。譜法。2）將配基偶聯(lián)于載體上，用于選擇性地去除某些污）將

40、配基偶聯(lián)于載體上，用于選擇性地去除某些污染物。染物。3）將細胞表面抗原分子對應(yīng)的抗體偶聯(lián)于載體上用）將細胞表面抗原分子對應(yīng)的抗體偶聯(lián)于載體上用于細胞的標記、分離及性質(zhì)研究。于細胞的標記、分離及性質(zhì)研究。（4）應(yīng)用）應(yīng)用1）物質(zhì)分離）物質(zhì)分離2）微量物質(zhì)的分析）微量物質(zhì)的分析3）肽庫及抗體庫的篩選）肽庫及抗體庫的篩選4）制藥工業(yè)（親和色譜用于藥用重組蛋白的純化）制藥工業(yè)（親和色譜用于藥用重組蛋白的純化）5）核酸分離（堿基配對）核酸分離（堿基配對）色譜固定化金屬離子親和色譜法純化豬銅鋅超氧化物歧化酶以Cu+-Sepharose 4B固定化金屬離子親和色譜法純化豬銅鋅超氧化物歧化酶，考察丁不同的洗脫

41、緩沖溶液及其pH 對純化效率的影響，顯示了方法的有效性。色譜固定化銅離子親和膜色譜柱吸附血紅蛋白的研究將纖維素濾紙進行堿處理及環(huán)氧活化、偶聯(lián)亞氨基二乙酸、固定化銅離子等處理，并將其裝入自制的色譜柱管，制得固定化銅離子親和膜色譜柱。該柱可用于吸附血紅蛋白(hemoglobin，Hb)，吸附率可達到90以上。3. 藥物控釋載體藥物控釋載體從時間和空間分布上控制藥物的釋放。從時間和空間分布上控制藥物的釋放。（1）一些藥物不能用于臨床的原因）一些藥物不能用于臨床的原因1）很多藥物尤其是蛋白質(zhì)類藥物，口服易被胃酸破）很多藥物尤其是蛋白質(zhì)類藥物，口服易被胃酸破壞或沉淀。壞或沉淀。2）單純注射后瞬時血藥濃度

42、提高，但馬上被肝臟及）單純注射后瞬時血藥濃度提高，但馬上被肝臟及血液中的酶系統(tǒng)所消除，需要反復(fù)注射，不僅增加血液中的酶系統(tǒng)所消除，需要反復(fù)注射，不僅增加治療費用，而且增加感染的機會。治療費用，而且增加感染的機會。3）腫瘤化療用細胞毒性物質(zhì)選擇性較差，全身毒副）腫瘤化療用細胞毒性物質(zhì)選擇性較差，全身毒副作用嚴重。作用嚴重。4）有些藥物親水性強，難于穿過細胞膜。）有些藥物親水性強，難于穿過細胞膜。5）蛋白質(zhì)類藥物易引起免疫反應(yīng)。）蛋白質(zhì)類藥物易引起免疫反應(yīng)。6）很多藥物穩(wěn)定性差，不耐貯存。）很多藥物穩(wěn)定性差，不耐貯存。藥物控制釋放技術(shù)：將藥物或其他的活性物質(zhì)與適當?shù)妮d體按一定的形式制成制劑，控制藥

43、物在人體內(nèi)吸收、代謝以及排泄的過程。使藥物按設(shè)計的劑量，在要求的時間范圍內(nèi)以一定的模式在體內(nèi)釋放或使藥物在指定部位釋放而達到治療某種疾病的目的。（2）解決方法）解決方法1）聚合物修飾）聚合物修飾 多用于蛋白質(zhì)類藥物。這類藥物生物半衰期短，免多用于蛋白質(zhì)類藥物。這類藥物生物半衰期短，免疫性強，可用適當?shù)乃苄愿叻肿泳酆衔锛右孕揎椧咝詮姡捎眠m當?shù)乃苄愿叻肿泳酆衔锛右孕揎椧愿纳破湫阅?。以改善其性能?）凝膠包埋）凝膠包埋 希望藥物能夠較長時間內(nèi)維持一個穩(wěn)定濃度希望藥物能夠較長時間內(nèi)維持一個穩(wěn)定濃度 用生物相容性好的高分子聚合物與藥物混合制成含用生物相容性好的高分子聚合物與藥物混合制成含有藥物的凝

44、膠，植入人體內(nèi)特定部位，以達到緩釋有藥物的凝膠，植入人體內(nèi)特定部位，以達到緩釋給藥效果。給藥效果。3）微球制劑）微球制劑 用高聚物微球包埋或化學(xué)偶聯(lián)藥物可制成微球制劑，用高聚物微球包埋或化學(xué)偶聯(lián)藥物可制成微球制劑，它具有靶向性、緩釋性及減少抗藥性等特點。微球它具有靶向性、緩釋性及減少抗藥性等特點。微球與靶細胞接觸，可以通過胞飲進入胞內(nèi)發(fā)生作用，與靶細胞接觸，可以通過胞飲進入胞內(nèi)發(fā)生作用，不影響細胞膜通透性，不會產(chǎn)生抗藥性。不影響細胞膜通透性，不會產(chǎn)生抗藥性。4）脂質(zhì)體）脂質(zhì)體 脂質(zhì)體是磷脂雙分子層在水溶液中自發(fā)形成的超微脂質(zhì)體是磷脂雙分子層在水溶液中自發(fā)形成的超微型中空小泡，具有靶向性、長效性

45、。并且可以通過型中空小泡，具有靶向性、長效性。并且可以通過胞飲作用胞內(nèi)釋放藥物，從而避免抗藥性；此外還胞飲作用胞內(nèi)釋放藥物，從而避免抗藥性；此外還具有更好的生物相容性和可生物降解性，并且無毒具有更好的生物相容性和可生物降解性，并且無毒性，無免疫原性。性，無免疫原性。5）導(dǎo)向藥物）導(dǎo)向藥物 導(dǎo)向藥物具有主動靶向性，將針對腫瘤細胞的單克導(dǎo)向藥物具有主動靶向性，將針對腫瘤細胞的單克隆抗體與化療藥物化學(xué)偶聯(lián)，可以直接作用于腫瘤隆抗體與化療藥物化學(xué)偶聯(lián)，可以直接作用于腫瘤細胞而產(chǎn)生殺傷作用，并且降低全身毒性。細胞而產(chǎn)生殺傷作用，并且降低全身毒性。高分子通報生物可降解聚酯用作蛋白質(zhì)藥物控釋載體聚乳酸PLA

46、及乳酸與羥基乙酸的共聚物PLGA，由于其良好的生物相容性以及生物降解性，可用作蛋白質(zhì)類藥物控釋體系的載體材料，同時可延長蛋白質(zhì)藥物的釋放。本文綜述了幾種生物相容性聚酯及其衍生物以及它們的形成方法：(1)在PLGA的分子鏈中引入親水性的含醚鍵的分子如PEO、PEG，來提高聚合物的親水性，形成PLGA嵌段共聚物；(2)將細胞可接受的片段或多肽固定在聚合物支架表面，來增強PLGA與細胞間的粘附力，得到靶向的PLGA衍生物；(3)改變PLGA載體內(nèi)的酸性環(huán)境，提高蛋白質(zhì)藥物在載體中的穩(wěn)定性，發(fā)展了支化聚酯PVA-g-PLGA，并得到均速的藥物釋放。以上這些方法所得到的聚酯及其衍生物，均可作為蛋白質(zhì)類藥物安全、可靠的載體材料。4. 生物傳感器生物傳感器由固定化酶（或細胞、細胞器等）與適當?shù)膿Q能器由固定化酶（或細胞、細胞器等）與適當?shù)膿Q能器（電極、場效應(yīng)管、離子選擇場效應(yīng)管等）密切結(jié)（電極、場效應(yīng)管、離子選擇場效應(yīng)管等）密切結(jié)合而構(gòu)成的分析系統(tǒng)，由感受器、換能器和電子線合而構(gòu)成的分析系統(tǒng)，由感受器、換能器和電子線路三部分組成。路三部分組成。應(yīng)用：葡萄糖氧化酶電極，青