蛋白純化答疑

1、蛋白純化答疑By aqiao 發(fā)表于 2007-4-15 18:38:00 凝膠過(guò)濾層析 也叫做分子排阻層析。一種利用帶孔凝膠珠作基質(zhì)，按照分子大小分離蛋白質(zhì)或其它分子混合物的層析技術(shù)。 關(guān)鍵是不知道你用什么凝膠過(guò)濾層析。一般來(lái)說(shuō)大部分細(xì)菌比蛋白質(zhì)小，要看是什么的凝膠過(guò)濾層析，才能達(dá)到材料上的阻擋。 響凝膠過(guò)濾層析的多種因素 很多人以為凝膠過(guò)濾非常簡(jiǎn)單直接，無(wú)需花太多精神仔細(xì)優(yōu)化。其實(shí)影響凝膠過(guò)濾的參數(shù)非常多，現(xiàn)與大家分享幾點(diǎn)經(jīng)驗(yàn)： 1 層析柱必須有柱頭及分布器，即adaptor，緊壓膠面完合沒有空隙，否則樣品上樣受影響。 2 凝膠懸浮液不可太稠，否則很容易出氣泡；太稀裝柱時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，亦影響效果

2、。50- 70%較適合。若是干粉，溶脹時(shí)間必須充足。裝前完全攪勻。 3 一次性倒入層析柱中，容量不夠則需加裝柱器。切不可分幾次倒，柱效和對(duì)稱性都很難合格。 4 裝柱及層析工作所用緩沖液的溫度需一樣。 5 柱底網(wǎng)下的氣泡一定要除掉，可先用20%乙醇濕一下底網(wǎng)。 6 每種膠在不同柱高下的裝柱流速、壓力都不一樣。跟足介質(zhì)說(shuō)明書的指引就萬(wàn)無(wú)一失了！找不到查AKTA系統(tǒng)的 Unicorn 中主屏幕的 adviser 即可，也可以查這光盤上有關(guān)層析凝膠的操作手冊(cè)。 7 上樣前柱平衡非常重要，不光UV平穩(wěn)，至少平衡一個(gè)柱體積。 8 緩沖液pH值會(huì)影響分離效果，經(jīng)驗(yàn)中用pH7.0和pH4.5的緩沖液分離5個(gè)低

3、分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白，結(jié)果頗有不同。 9 加入0.15M NaCl可防止非特異性的吸附及蛋白間的聚合。 如果在適當(dāng)期間加入不同的材料可以有效的防止對(duì)應(yīng)的細(xì)菌。 老兄，我新手哈，只能給你這么多的了。 這個(gè)網(wǎng)站可以稍微幫你點(diǎn)參考，但是得全綜合來(lái)總結(jié)，我就不方便全部總結(jié)了！ 請(qǐng)多支持我哈，個(gè)人感覺你的問(wèn)題太簡(jiǎn)單了。不好針對(duì)性的回答，不可能把所有的情況說(shuō)出來(lái)再分析吧？！ 回答者：janefeng1986 - 試用期 一級(jí) 3-23 01:52同意樓上的說(shuō)法 回答者：菜刀狗狗 - 助理 三級(jí) 3-25 18:25一、菌體的裂解 1、怎樣裂解細(xì)菌？ 細(xì)胞的破碎方法 1.高速組織搗碎：將材料配成稀糊狀液，放置于筒

4、內(nèi)約1/3體積，蓋緊筒蓋，將調(diào)速器先撥至最慢處，開動(dòng)開關(guān)后，逐步加速至所需速度。此法適用于動(dòng)物內(nèi)臟組織、植物肉質(zhì)種子等。 2.玻璃勻漿器勻漿：先將剪碎的組織置于管中，再套入研桿來(lái)回研磨，上下移動(dòng)，即可將細(xì)胞研碎，此法細(xì)胞破碎程度比高速組織搗碎機(jī)為高，適用于量少和動(dòng)物臟器組織。 3.超聲波處理法：用一定功率的超聲波處理細(xì)胞懸液，使細(xì)胞急劇震蕩破裂，此法多適用于微生物材料，用大腸桿菌制備各種酶，常選用50-100毫克菌體/毫升濃度，在1KG至10KG頻率下處理10-15分鐘，此法的缺點(diǎn)是在處理過(guò)程會(huì)產(chǎn)生大量的熱，應(yīng)采取相應(yīng)降溫措施，時(shí)間以及超聲間歇時(shí)間、超聲時(shí)間可以自己調(diào)整，超聲完全了菌液應(yīng)該變清

5、亮，如果不放心可以在顯微鏡下觀察。對(duì)超聲波及熱敏感的蛋白和核酸應(yīng)慎用。 4.反復(fù)凍融法：將細(xì)胞在-20度以下冰凍，室溫融解，反復(fù)幾次，由于細(xì)胞內(nèi)冰粒形成和剩余細(xì)胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎。 5.化學(xué)處理法：有些動(dòng)物細(xì)胞，例如腫瘤細(xì)胞可采用十二烷基磺酸鈉（SDS）、去氧膽酸鈉等細(xì)胞膜破壞，細(xì)菌細(xì)胞壁較厚，可采用溶菌酶處理效果更好，我用的濃度一般為1mg/ml。 無(wú)論用哪一種方法破碎組織細(xì)胞，都會(huì)使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)或核酸水解酶釋放到溶液中，使大分子生物降解，導(dǎo)致天然物質(zhì)量的減少，加入二異丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或減慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性

6、，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且應(yīng)該在破碎的同時(shí)多加幾次；另外，還可通過(guò)選擇pH、溫度或離子強(qiáng)度等，使這些條件都要適合于目的物質(zhì)的提取。 這是標(biāo)準(zhǔn)配方: 裂解液：50mM Tris-HCl(pH8.59.0), 2mM EDTA, 100mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 1mg/ml溶菌酶。(溶菌酶在這個(gè)pH范圍內(nèi)比較好發(fā)揮作用) 但我個(gè)人的經(jīng)驗(yàn)是:如果你裂解細(xì)菌是為了提取蛋白的話,而且蛋白的分子量又小于20kd的話,盡量減少溶菌酶的用量,會(huì)引入溶菌酶這種雜蛋白.一般配60ml裂解液用藥匙匙柄盛一點(diǎn)就夠.判斷裂解好壞的標(biāo)準(zhǔn)是,溶液很

7、粘. protocol是10ml-50ml緩沖液(菌體洗滌液,裂解液等)/1g濕菌體. 如果只做一個(gè)鑒定,我覺得100-200ml菌就夠了. 但凡超聲,我都用60ml裂解液,因?yàn)槲覀兊某晝x(現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)錄象里的那種)很適合用100ml小燒杯,裝60ml裂解液,這樣能讓超聲頭離液面不高不低,不會(huì)冒泡泡,也不會(huì)灑出來(lái).菌多我就延長(zhǎng)超聲時(shí)間. 沉淀,也就是包涵體沉淀了,如果要上柱純化,一定要先用4M尿素洗滌一下再用8M尿素溶解.如果不上柱,只是跑跑電泳,可以直接用8M尿素溶解以后,離心取上清,加入適量體積的loading buffer.loading buffer對(duì)于包涵體的溶解能力是較

8、弱的. 取200微升菌液，離心后直接加上樣buffer，100度3分鐘后上樣，然后SDSPAGE. 這個(gè)方法到底能不能溶解細(xì)菌中的包涵體? 而樓主的問(wèn)題,雖然loading buffer對(duì)于包涵體的溶解能力是較弱的,但是我覺得你的做法只是在鑒定有無(wú)表達(dá),用loading buffer是沒有問(wèn)題的. 2、表達(dá)重組蛋白時(shí)，細(xì)菌裂解方法都有哪些？ 在表達(dá)重組蛋白時(shí)，誘導(dǎo)以后跑SDS-PAGE發(fā)現(xiàn)表達(dá)都很好，但是在裂解細(xì)胞時(shí)遇到問(wèn)題?？偸遣荒軓氐琢呀饧?xì)胞。 首先我采用超聲裂解，可是不管我如何超聲總有部分細(xì)菌沒有裂解。 我的超聲條件如下：寧波新芝超聲細(xì)胞破碎儀，功率400W，超5秒，間隔5秒，重復(fù)99次

9、。然后顯微鏡觀察，不徹底時(shí)再重復(fù)99次。菌體來(lái)自200 ml培養(yǎng)液，用20 ml PBS重懸。 然后我又嘗試加溶菌酶，首先加至終濃度100 ug/ml，4C半小時(shí)菌液不變粘，加大濃度至1 mg/ml，半小時(shí)后仍無(wú)明顯變化。因?yàn)槲矣玫腜BS是pH7.4，我懷疑是pH不合適，換用pH8.0 TE buffer，1 mg/ml溶菌酶，4C半小時(shí)仍無(wú)明顯變粘。因?yàn)檫@次使用的溶菌酶是前一天配好的，擔(dān)心溶菌酶失效，重新稱取凍干粉末，直接加入菌液，仍然沒有明顯變化。 真是郁悶。到底出了什么事？請(qǐng)高手解答，并介紹優(yōu)化的方案。 同時(shí)希望能介紹一下如何選擇細(xì)胞破碎方法，以及如何確定最佳條件。 溶菌酶在pH7.4時(shí)

10、是否沒有活性了？可否配成濃縮液保存溶菌酶，如果可以，應(yīng)如何保存？ 加入溶菌酶以后，如果細(xì)胞壁已破壞，菌液應(yīng)該變粘吧，因?yàn)楹怂岜会尫懦鰜?lái)。 而超聲破碎細(xì)胞，我覺得菌液是不會(huì)變粘的，因?yàn)槌暱梢园汛蠓肿雍怂岽蛩槌尚∑巍?我判斷細(xì)胞破碎不完全是因?yàn)?，在將破碎后樣品離心分離上清和沉淀跑SDS-PAGE觀察，發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞碎片組分中除了經(jīng)常出現(xiàn)的一兩條帶以外，還有菌體總蛋白樣品中的很多帶出現(xiàn)。據(jù)此可以判斷細(xì)胞只是部分破碎。 不知我的分析是否正確，請(qǐng)版主和各位高手指教。 如果溶菌酶效果還可以，我覺得先用溶菌酶初步裂解細(xì)胞，然后再用超聲進(jìn)一步破碎并斷裂大分子核酸以降低粘度的細(xì)胞破碎策略可能比較好。因?yàn)槌曈锌?/p>

11、能使蛋白變性，但單用溶菌酶不能確定是否完全破碎，還要再加核酸酶降低粘度。這種兩步法策略應(yīng)該還可以減少破碎條件優(yōu)化的時(shí)間。 我用的溶菌酶放置時(shí)間比較長(zhǎng)了，有可能失活了。我剛從生工又定了一支，不過(guò)得后天到貨，但愿它有用。 如何觀察溶菌酶是否已裂解細(xì)胞，通過(guò)觀察粘度變化是否可以？ 只反復(fù)凍融是否可以有效裂解大腸桿菌細(xì)胞？ 溶菌酶只有在pH值大于8.0的條件下才能發(fā)揮溶菌作用，請(qǐng)務(wù)必保持PBS的pH8.0，同時(shí)溶菌酶的量一定要足！ 在加入溶菌酶后，最好放于磁力攪拌器上攪拌30分鐘，再進(jìn)行超聲破菌，我的超聲條件是：功率400W，工作2秒，間隔2秒，重復(fù)199次。菌體來(lái)自500 ml培養(yǎng)物，用30 ml

12、PBS重懸，超聲效率還是可以的。 哪兒的溶菌酶好用？ 我用生工的溶菌酶，稱取干粉20mg。200ml菌液用18 ml NaCl重懸，加入2 ml 25mM Tris-HCl(pH8.0)，將溶菌酶干粉加入體系，混勻，測(cè)pH降低到56，加20 ul 2M Tris堿，體系pH升到8。4C放置1小時(shí)，菌液上層變澄清，搖動(dòng)發(fā)現(xiàn)體系沒有變粘。測(cè)pH仍在8左右。再37C保溫1小時(shí)，還沒有變化，我簡(jiǎn)直不知如何才好了。 另一瓶200ml培養(yǎng)物，溶菌酶處理1小時(shí)后超聲。條件：300W，超5秒停5秒，重復(fù)99次。菌液有變化，但很不明顯。繼續(xù)超聲400次，從外觀來(lái)看沒有太大區(qū)別。我簡(jiǎn)直要說(shuō)tmd了。見鬼了。 我的

13、操作有什么地方不妥當(dāng)，請(qǐng)各位指正。 溶菌酶的廠商要求是否很重要？ 我的誘導(dǎo)物來(lái)自1：20過(guò)夜培養(yǎng)物接種，37C生長(zhǎng)3小時(shí)后30C誘導(dǎo)2小時(shí)（0.8mM IPTG）。 是否菌液太濃，Pharmacia的說(shuō)明書200 ml培養(yǎng)物用10 ml重懸，我用20 ml，仍然不夠??？有人告訴我菌液應(yīng)該稀一些，200 ml用3040 ml重懸。但實(shí)際操作也不夠理想。 SDS-PAGE總是觀察到細(xì)胞破碎效果不夠徹底。超聲那么多次，蛋白都要被超碎變性了。 3、酵母的破碎 酵母是一類單細(xì)胞真菌的總稱，其成員分別屬于不同的真菌綱，細(xì)胞壁成分是否會(huì)有較大差別，這些都是做破碎酵母細(xì)胞前要考慮的。我歸納了一下，做破碎酵母的

14、幾種方法： 1 機(jī)械的方法：一般的PROTOCOL都是用glass beads：如 sigma G-8772，加玻璃珠后超聲，蛋白活性保持較好。 2 化學(xué)裂解的方法：10g酵母 加1ml的乙酸乙酯，充分?jǐn)嚢柚烈后w狀（希望高手點(diǎn)評(píng)） 3 尿素裂解液（尿素8mol/L, NaCl 0.5mol/L,Tris 20mmol/L, EDTA 20mmol/L, 2%SDS, PH值8.0）高壓勻漿。（這個(gè)好象也該在方法2中） 4 液氮凍融并研磨酵母破壁，我認(rèn)為這種可能在小試中比較合適。 5 溫和的酶法，可能不會(huì)會(huì)破壞酵母原生質(zhì)體 酶法裂解主要用兩種酶：1。蝸牛酶，可以直接從蝸牛的胃液中獲得；2。lyt

15、icase，可以從sigma定購(gòu)。這兩種酶解法都可以和上面的幾種方法結(jié)合使用，尤其是glass beads方法，效果很好。 我用過(guò)化學(xué)裂解的方法，10g酵母 加1ml的乙酸乙酯，充分?jǐn)嚢柚烈后w狀。此法的裂解效果不錯(cuò)的，不妨試一下。 一篇文章是加尿素裂解液（尿素8mol/L, NaCl 0.5mol/L,Tris 20mmol/L, EDTA 20mmol/L, 2%SDS, PH值8.0），據(jù)說(shuō)效果可以 酵母破碎效果好的我所做過(guò)的方法中還是玻璃珠，就象microbe 和rongjunli所說(shuō)的那樣，效率很高的，而且對(duì)目的蛋白活性不會(huì)有什么影響。一般應(yīng)該用這個(gè)方法。 4、超聲破碎的條件選擇 超聲

16、破碎的條件不能一概而論，要看你的實(shí)驗(yàn)要求，有的是細(xì)菌破碎，有的是對(duì)組織細(xì)胞進(jìn)行破碎，要掌握好功率和每次超聲時(shí)間，功率大時(shí)，每次超聲時(shí)間可縮短，不能讓溫度升高，必要時(shí)在冰浴條件下進(jìn)行超聲破碎。至于每次超聲時(shí)是否起泡沫到不是關(guān)鍵的問(wèn)題，這與你超聲的量明顯有關(guān)。 5、如何鑒定細(xì)菌超聲破碎的程度 最簡(jiǎn)單的方法：涂片-革蘭氏結(jié)晶紫溶液染色0.5分鐘-顯微鏡觀察 切記：只用結(jié)晶紫染色，別忘了染色后再用水稍沖洗一下 6、細(xì)菌裂解的DNaseI 不同純度的酶換算標(biāo)準(zhǔn)不同，所以你最好查查是哪個(gè)公司的酶？仔細(xì)看說(shuō)明書，可能會(huì)有換算說(shuō)明。 另外看一下參考文獻(xiàn)所用的酶是哪個(gè)公司的，到該公司的主頁(yè)也可能有收獲。 我用過(guò)

17、華美和TAKARA的DNA酶，華美的是用mg/ml。華美也有RNase free的DNA酶，定量用活性單位。TAKARA的兩種酶都是用活性單位定量的。 我在超聲裂解細(xì)菌時(shí)加入一些DNA酶，一般用超聲液加不同量的酶做一個(gè)預(yù)實(shí)驗(yàn)，選取符合你需要的酶量。 其實(shí)根據(jù)目的和方法的不同，所需要的酶量也是可調(diào)節(jié)的，比如酶切溫度（16度或37度）。 7、超聲裂解細(xì)菌是否完全？ 最簡(jiǎn)單的方法：涂片-革蘭氏結(jié)晶紫溶液染色0.5分鐘-顯微鏡觀察 切記：只用結(jié)晶紫染色 二、包涵體的洗滌 1、包涵體的洗滌問(wèn)題 通常的洗滌方法一般是洗不干凈的，我以前是這么做的，先把包涵體用6M鹽酸胍溶解充分，過(guò)濾除去未溶解的物質(zhì)，注意留

18、樣跑電泳，然后用水稀釋到4M,離心把沉淀和上清分別跑電泳，如此類推可以一直稀釋到合適的濃度，你可以找到一個(gè)合適去除雜質(zhì)的辦法，其實(shí)這就是梯度沉淀的方法，我覺得比通常的直接洗脫效果好。 包涵體一般難溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑電泳對(duì)比，因?yàn)橛袝r(shí)候難溶解的就是你的目標(biāo)蛋白，所以每次處理都要把上清和沉淀跑電泳對(duì)比，免得把目標(biāo)蛋白弄丟了。 此外剛處理完的包涵體好溶解。冷凍后難溶解，溶解也需要長(zhǎng)點(diǎn)時(shí)間，也需要大量的溶劑。如果說(shuō)是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。 2、如何得到比較純的包涵體 對(duì)于包涵體的純化，包涵體的前處理是很重要的。 包涵體中主要含有重組蛋白,但也含有一些細(xì)菌成分,如一

19、些外膜蛋白、質(zhì)粒DNA和其它雜質(zhì)。洗滌常用1%以下的中性去垢劑，如Tween、Triton、Lubel和 NP40等加EDTA和還原劑2-巰基蘇糖醇（DTT）、-巰基乙醇等反復(fù)多次進(jìn)行，因去垢劑洗滌能力隨溶液離子強(qiáng)度升高而加強(qiáng)，在洗滌包涵體時(shí)可加50 mM NaCL。這樣提取的包涵體純度至少可達(dá)50%以上，而且可保持元結(jié)構(gòu)。也可用低濃度的鹽酸胍或尿素/中性去垢劑/EDTA/還原劑等洗去包涵體表面吸附的大部分不溶性雜蛋白。洗滌液pH以與工程菌生理?xiàng)l件相近為宜，使用的還原劑為0.1-5mM。EDTA為0.1-0.3 mM。去垢劑如Triton X-100、脫氧膽酸鹽和低濃度的變性劑如尿素充分洗滌去

20、除雜質(zhì),這一步很重要,因?yàn)榇竽c桿菌外膜蛋白Omp T(37 KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵體的溶解和復(fù)性過(guò)程中可導(dǎo)致重組蛋白質(zhì)的降解。 對(duì)于尿素和鹽酸胍的選擇： 尿素和鹽酸胍屬中強(qiáng)度變性劑，易經(jīng)透析和超濾除去。它們對(duì)包涵體氫鍵有較強(qiáng)的可逆性變性作用，所需濃度尿素8-10M，鹽酸胍6-8M。尿素溶解包涵體較鹽酸胍慢而弱，溶解度為70-90%，尿素在作用時(shí)間較長(zhǎng)或溫度較高時(shí)會(huì)裂解形成氰酸鹽，對(duì)重組蛋白質(zhì)的氨基進(jìn)行共價(jià)修飾，但用尿素溶解具有不電離，呈中性，成本低，蛋白質(zhì)復(fù)性后除去不會(huì)造成大量蛋白質(zhì)沉淀以及溶解的包涵體可選用多種色譜法純化等優(yōu)點(diǎn)，故目前已被廣泛采用。 鹽酸胍

21、溶解能力達(dá)95%以上，且溶解作用快而不造成重組蛋白質(zhì)的共價(jià)修飾。但它也有成本高、在酸性條件下易產(chǎn)生沉淀、復(fù)性后除去可能造成大量蛋白質(zhì)沉淀和對(duì)蛋白質(zhì)離子交換色譜有干擾等缺點(diǎn)。 包涵體最后的純化，一般是離子交換，疏水，或者是親和層析，親和層析尤其是金屬螯合層析用得比較廣泛，而純化的效果也不錯(cuò)，通常是一步就能達(dá)到純度為95%以上的包涵體。 8M高濃度尿素溶解后離心獲得的包涵體溶解液，放在4度冰箱過(guò)夜后出現(xiàn)沉淀，這種現(xiàn)象我也在實(shí)驗(yàn)中遇到過(guò);開始感覺很奇怪，后來(lái)發(fā)現(xiàn)是我們的冰箱的溫控出了問(wèn)題實(shí)驗(yàn)際溫度要比設(shè)定溫度低至少4度（呵呵，不好意思?。２贿^(guò)我接著往下進(jìn)行SDS-PAGE、層析等發(fā)現(xiàn)沒有什么不良影

22、響。所以，你不用擔(dān)心也許你的蛋白也只是和你開了個(gè)玩笑呢！ 三、關(guān)于包涵體的溶解： 1、 請(qǐng)教GST包涵體溶解 直接用8M的脲或 6M胍融解，取上清，測(cè)濃度。直接稀釋后包被檢測(cè)相應(yīng)抗體。（由于快速稀釋相當(dāng)于復(fù)性過(guò)程，產(chǎn)物用于檢測(cè)沒有問(wèn)題的） 我所用的包涵體提取方法： 1PBS或生理鹽水洗滌誘導(dǎo)后菌體，Buffer A重懸菌體，超聲波破碎至清亮 24度，10000rpm離心10分鐘，棄上清 3用PBS或生理鹽水洗滌沉淀23次 4往沉淀中加197ml Buffer A及03ml 20的SKL（十二烷基肌氨酸鈉）貯存液，劇烈攪動(dòng)，使其緩慢溶解，室溫靜置30分鐘至2小時(shí) 54度，10000rpm離心10

23、分鐘，取上清 6加20PEG4000 210ul至終濃度為02，加50mM的氧化型谷胱甘肽420ul至終濃度為1mM,加100mM的還原型谷胱甘肽420ul至終濃度為2mM,靜置30分鐘至2小時(shí)（亦可4度復(fù)性過(guò)夜） 7以PBS（pH8.0)或TE（pH8.0)透析，取出20度保存?zhèn)溆?！Buffer A配方： Tris-base 50mM EDTA 0.5mM NaCl 50mM 甘油 5% DTT 5mM 2、包涵體的溶解 十二烷基肌氨酸鈉與十二烷基肌氨酸在溶解包涵體時(shí)，可不可以互相代替？可以替換，調(diào)pH不久沒什么區(qū)別了嗎；兩者的功能團(tuán)相同，pH不同，前者鈉鹽便于保存罷了 3、有關(guān)包涵體的溶

24、解問(wèn)題 強(qiáng)的變性劑如尿素（6-8M）、鹽酸胍（GdnHCl 6M），是通過(guò)離子間的相互作用，打斷包涵體蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的各種化學(xué)鍵，使多肽伸展，一般來(lái)講，鹽酸胍優(yōu)于尿素，因?yàn)辂}酸胍是較尿素強(qiáng)的變性劑，它能使尿素不能溶解的包涵體溶解，而且尿素分解的異氰酸鹽能導(dǎo)致多肽鏈的自由氨基甲?；?，特別是在堿性pH值下長(zhǎng)期保溫時(shí)。SDS、正十六烷基三甲基銨氯化物、Sarkosyl等是去垢劑，可以破壞蛋白內(nèi)的疏水鍵，也可溶解一些包涵體蛋白質(zhì)。另外，對(duì)于含有半胱氨酸的蛋白質(zhì)，分離的包涵體中通常含有一些鏈間形成的二硫鍵和鏈內(nèi)的非活性二硫鍵。還需加入還原劑，如巰基乙醇、二硫基蘇糖醇（DTT）、二硫赤蘚糖醇、半胱氨

25、酸。對(duì)于目標(biāo)蛋白沒有二硫鍵某些包涵體的增溶，有時(shí)還原劑的使用也是必要的，可能由于含二硫鍵的雜蛋白影響了包涵體的溶解。 4、8M尿素溶解的包涵體溶液應(yīng)如何保存? 我在4度放了半個(gè)月，目前沒出什么問(wèn)題 5、8M尿素溶解的包涵體溶液在室溫下可以放多久而不出現(xiàn)問(wèn)題? BI溶液在室溫放置48小時(shí)，可能會(huì)對(duì)目的蛋白有影響，因?yàn)槟蛩卦趬A性條件下可使一些氨基酸?；蚨缧┨幚鞡I溶液比較好。具體有什么影響我也不是很清楚。 6、GST融合蛋白形成包含體不溶，咋辦？ GST融合蛋白應(yīng)該不能用尿素等作用太強(qiáng)的變性劑，否則GST融合蛋白是不能與beads相結(jié)合的 GST的Beads是應(yīng)用酶與底物結(jié)合的原理，所以要

26、去除處理因素后才好結(jié)合，不知你的溫和的去污劑是什么？ 做完裂解之后加Triton X100輕搖30min，蛋白溶解的會(huì)多些！ 四、包涵體的復(fù)性 1、包涵體如何復(fù)性 包涵體的復(fù)性主要有兩種方式： 1，稀釋溶液，但是操作的液體量大，蛋白稀釋 2，透析，超濾或電滲透析去除變性劑 其中透析很適合實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用，但是時(shí)間長(zhǎng)。另外，如果蛋白質(zhì)右兩個(gè)以上的2硫鍵，很可能錯(cuò)誤形成配對(duì)，應(yīng)用還原劑。還有，復(fù)性的具體方法還要根據(jù)前期試驗(yàn)及篩選來(lái)確定！ 另外，你用多大體積的透析緩沖液？可能不夠，要更換幾次 你家了多少蛋白呀 ？蛋白量過(guò)大也會(huì)使復(fù)性困難。 你用的透析代是否是新的，處理過(guò)沒有？新代有化學(xué)雜質(zhì)！ 最后，有些復(fù)

27、性過(guò)程就是還有沉淀（透析方法的缺點(diǎn)）看看溶液中蛋白含量，說(shuō)不定已經(jīng)夠用了 包涵體的復(fù)性還要注意以下幾點(diǎn)： 1.首先要獲得較高純度的包涵體。 2.包涵體溶解要徹底，一般應(yīng)使溶解液體量較大，不要怕蛋白被稀釋，要有助溶措施。 3.透析前后均要離心 4.透析不能太快. 5.純化的最佳條件要摸索。 小技巧： 1）包含體要徹底洗滌干凈，洗滌液中加入適量Triton-X100. 2) 包含體溶解后裝入透析袋在復(fù)性液中復(fù)性 3）復(fù)性液的組成很有講究，本人使用 Oxidised Glutathione/ Reduced Glutathione 還加入一定的L-Arginine-Hydrochloride 12-

28、24h 4) 復(fù)性完畢在低濃度的緩沖液中連續(xù)緩慢透析12-24h 5) 復(fù)性率的測(cè)定 據(jù)變性蛋白和非變性蛋白的光學(xué)性質(zhì)不同測(cè)定（望有經(jīng)驗(yàn)的戰(zhàn)友能更詳細(xì)地講解） 6）TritionX100、SDS這一類去垢劑最后不易去除，在制藥行業(yè)中一般不允許采用。好像SDS最后殘留量不能大于0.5%吧，忘了。 我用Triton洗滌有些包涵體效果不是很好。包涵體洗滌是純化極為重要的一步，改變培養(yǎng)條件，再洗滌包涵體，有時(shí)可以在上柱前已經(jīng)只剩下3-4條雜帶，這樣后續(xù)的純化就很方便了。因?yàn)樯V柱的純化條件比較難optimize。 這段文字可以參考： 用Novagen公司pET System Manual提供的方法，分

29、別進(jìn)行細(xì)菌滲透休克，超聲波裂解，研究融合蛋白在細(xì)胞周質(zhì)，細(xì)胞質(zhì)和包涵體中的分布。 滲透休克 用方法誘導(dǎo)細(xì)菌（10ml體積），測(cè)菌液OD600，10000 r/min離心0.5 min去上清，加入滲透休克溶液1（V1= OD 600V2/5，V1為滲透休克溶液1，V2為培養(yǎng)新鮮菌液），冰浴10 min，10000 r/min離心0.5 min，去上清。加V1體積滲透休克溶液2重懸，搖動(dòng)冰浴10 min，10000 r/min離心0.5 min，保存上清、細(xì)菌沉淀。作如下處理：上清用三氯乙酸(TCA Trichloroacetic acid) 沉淀，加1/10體積100% TCA (w/v)，渦漩

30、15 sec.，冰浴10 min，13000 r/min離心5 min，100 ul丙酮洗滌沉淀，干燥1 h，加V1/2體積1 PBS（pH 10）溶解，-20保存，取10 ul加入等體積2SB，進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳分析，UNIUER SAL HooD-S.N. 75s 成像系統(tǒng)照相。 超聲波裂解細(xì)菌 滲透休克細(xì)菌沉淀加1/10培養(yǎng)體積20 mM Tris-HCl（pH 7.5，0）重懸，冰浴，超聲波裂解，20%工作選擇，脈沖粉碎1 min，然后13000 r/min離心5 min，-20保存上清、細(xì)菌沉淀。上清進(jìn)行TCA沉淀，處理同上。沉淀用Protein Extraction

31、Reagent（Ni-NTAHi Bind Purification Kit BugBuster. 提供 ）按 Novagen公司pET System Manual提供方法反復(fù)處理，洗滌包涵體。包涵體按培養(yǎng)菌100OD600/3 ul體積加1% SDS溶解，加等體積2SB，進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳分析，進(jìn)行蛋白條帶灰度掃描，計(jì)算融合蛋白Trx-PrPC27-30占細(xì)菌總蛋白的相對(duì)含量。 1.2.7重組融合蛋白的純化 PrP-pET-32a（+）轉(zhuǎn)化表達(dá)菌E.coli BL21（DE3），TB培養(yǎng)基中，25，AMP 200 ug/ml，搖床（250 rmin）培養(yǎng)至OD600約為1.5，

32、更換等體積新鮮TB培養(yǎng)基，加入IPTG至終濃度1 mM，AMP 200 ug/ml，25，4 h，4000 g離心收集菌體。按 Ni-NTA HiBind Purification Kit使用說(shuō)明溶解包涵體，純化融合蛋白。 或使用筆者改進(jìn)方法，將Ni-NTA HiBind Purification Kit使用說(shuō)明中Buffer D改成Wash-Buffer，Buffer-E改成Elute-Buffer，最后用Buffer-E重生Ni-NTA HiBind Rasin，Binding- Buffer平衡以后加50%酒精保存，以免長(zhǎng)菌。 洗脫所得蛋白用TCA沉淀，處理同上，得融合蛋白Trx-PrP

33、C27-30，凍干保存。然后12% SDS-PAGE凝膠電泳分析。 3、包涵體復(fù)性2 精氨酸可助溶，但精氨酸是代謝產(chǎn)物高濃度對(duì)人可能不好。 另外甘氨酸、纈氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸有助溶作用。你可以試一試。 對(duì)于疏水蛋白的可溶表達(dá)，可以降低誘導(dǎo)溫度（可以試試4度誘導(dǎo)過(guò)夜）和IPTG的量，降低蛋白的表達(dá)速度，從而減少包涵體形成的速度，增加正確折疊蛋白的量?；蛘邠Q成GST融合表達(dá)載體，GST可以增加后面融合蛋白的可溶表達(dá)。我的蛋白包涵體在經(jīng)變性純化后透析復(fù)性過(guò)程中，在透析液中加入了1%的甘氨酸和5%的甘油，有一定的助溶效果。我想對(duì)于你的情況，由于含有二硫鍵，還要加入一定比例的谷胱甘肽，才能形成

34、正確的二硫鍵。復(fù)性是一個(gè)很難捉摸的過(guò)程，不同蛋白的復(fù)性條件也各不相同。 5、包涵體復(fù)性問(wèn)題 包含體復(fù)性三大原則： 1。低濃度 2。平緩梯度 3。低溫 有蛋白析出最大的可能型是：蛋白濃度太高，建議你稀釋以后再作透析。 此外，透析的鹽濃度（比如ura）要平緩降低：8m-6m-4m-2m-pbs-H2O。 6、包涵體復(fù)性形成聚集物 關(guān)鍵是蛋白在復(fù)性過(guò)程中凝聚了以后，調(diào)節(jié)PH可以使其溶解，但是這樣復(fù)性好的蛋白有沒有活性還是問(wèn)題，雖然樣品溶解了，但活性不高或沒有也不行呀！ 7、復(fù)性中蛋白析出！ 出現(xiàn)蛋白析出，肯定是條件變化太劇烈了。復(fù)性應(yīng)該采取復(fù)性液濃度和PH值逐漸變化的方法，例如根據(jù)你包含體的溶液成分

35、，每隔1個(gè)PH或濃度值配置一種溶液，逐步透析到正常。此外透析時(shí)必須濃度極低，條件溫和，使蛋白質(zhì)能夠正確折疊。但是復(fù)性的比率應(yīng)該很低。 若加變性劑尿素可加到2M，鹽酸胍可加到1-1.5M； 另外可將甘油濃度增加，范圍可在30%，且在復(fù)性樣品中也可加適量甘油；一些拙見。 8、包涵體復(fù)性液配方 對(duì)于包涵體復(fù)性，一般在尿素濃度4M左右時(shí)復(fù)性過(guò)程開始，到2M 左右時(shí)結(jié)束。對(duì)于鹽酸胍而言，可以從4M開始，到1.5M 時(shí)復(fù)性過(guò)程已經(jīng)結(jié)束。TRIS系統(tǒng)和PBS系統(tǒng)都沒有明確的規(guī)定，這些需要你在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不斷試驗(yàn)，確定合適的緩沖系統(tǒng)；不過(guò)復(fù)性過(guò)程主要是注意以下幾個(gè)問(wèn)題： 1）最適pH值范圍為8.0-9.0之間；

36、 2) 溫度適宜選擇4； 3）復(fù)性過(guò)程蛋白濃度不宜過(guò)大，一般為0.1-0.2mg/mL； 4) 復(fù)性時(shí)間一般為24-36小時(shí)； 5) 低分子化合物 如L-Arg有助于增加復(fù)性中間產(chǎn)物的溶解度；脲、鹽酸胍、烷基脲、以及碳酸酰胺類等，在非變性濃度下是很有效的促進(jìn)劑，都可阻止蛋白聚集；Tris對(duì)蛋白質(zhì)復(fù)性有促進(jìn)作用；EDTA可以防止蛋白降解； 6) 氧化還原體系，如GSH/GSSG、DTT/GSSG、DTE/GSSG等.。 還有就是你的蛋白質(zhì)的特性 9、什么叫復(fù)性成功 復(fù)性效果的檢測(cè)： 根據(jù)具體的蛋白性質(zhì)和需要，可以從生化、免疫、物理性質(zhì)等方面對(duì)蛋白質(zhì)的復(fù)性效率進(jìn)行檢測(cè)。 1，凝膠電泳：一般可以用非

37、變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳可以檢測(cè)變性和天然狀態(tài)的蛋白質(zhì)，或用非還原的聚丙烯酰胺電泳檢測(cè)有二硫鍵的蛋白復(fù)性后二硫鍵的配對(duì)情況。 2，光譜學(xué)方法：可以用紫外差光譜、熒光光譜、圓二色性光譜（CD）等，利用兩種狀態(tài)下的光譜學(xué)特征進(jìn)行復(fù)性情況的檢測(cè)，但一般只用于復(fù)性研究中的過(guò)程檢測(cè)。 3，色譜方法：如IEX、RP-HPLC、CE等，由于兩種狀態(tài)的蛋白色譜行為不同， 4，生物學(xué)活性及比活測(cè)定：一般用細(xì)胞方法或生化方法進(jìn)行測(cè)定，較好的反映了復(fù)性蛋白的活性，值得注意的是，不同的測(cè)活方法測(cè)得的結(jié)果不同，而且常常不能完全反映體內(nèi)活性。 5，黏度和濁度測(cè)定：復(fù)性后的蛋白溶解度增加，變性狀態(tài)時(shí)由于疏水殘基暴露，一般水

38、溶性很差，大多形成可見的沉淀析出。 6，免疫學(xué)方法：如ELISA、WESTERN等，特別是對(duì)結(jié)構(gòu)決定簇的抗體檢驗(yàn)，比較真實(shí)的反映了蛋白質(zhì)的折疊狀態(tài)。 在正常的生理?xiàng)l件下，組成蛋白質(zhì)的多肽鏈都能以獨(dú)特的方式進(jìn)行折疊，形成自己特有的空間結(jié)構(gòu)，以執(zhí)行某一些生命活動(dòng)。當(dāng)外界環(huán)境改變時(shí)，可能造成基因突變和蛋白質(zhì)序列改變，錯(cuò)誤剪接和運(yùn)輸，錯(cuò)誤折疊和異常聚積，形成對(duì)機(jī)體有害的反應(yīng)，引起構(gòu)象病的發(fā)生和無(wú)生物活性、不可溶的包涵體形成。目前對(duì)包涵體形成和復(fù)性過(guò)程中發(fā)生聚集的機(jī)制尚不清楚，許多已建立的高效復(fù)性方法是在反復(fù)實(shí)驗(yàn)和優(yōu)化的基礎(chǔ)上建立的，且沒有普遍性，但從這許許多多的個(gè)例中發(fā)現(xiàn)了一些規(guī)律：如聚集的發(fā)生是由鏈

39、間的疏水相互作用介導(dǎo)、聚集具有相對(duì)特異性、折疊中間體可能具有不同的作用等等，并利用這些知識(shí)建立了一些重組蛋白質(zhì)高效復(fù)興性的方法。相信隨著結(jié)構(gòu)生物學(xué)、生物信息學(xué)、蛋白質(zhì)工程學(xué)及相關(guān)新技術(shù)和新設(shè)備的發(fā)展和完善，在不久的將來(lái)，預(yù)測(cè)和設(shè)計(jì)最佳復(fù)性方案將成為可能。 10、怎樣鑒定融合蛋白復(fù)性是否成功 問(wèn)：最近在做GST融合蛋白的純化，由于目的蛋白主要存在于包涵體中，所以在變性條件下將包涵體溶解，經(jīng)復(fù)性，透析后用GSH sepharose 4B純化，結(jié)果得到了比較純的融合蛋白，這是否說(shuō)明GST的活性已得到恢復(fù)（因?yàn)槟芘cGSH結(jié)合），請(qǐng)問(wèn)這種情況下，是否能代表我的目的蛋白的活性也得到了恢復(fù)？由于我的目的蛋白

40、只是一個(gè)蛋白的某一段，不具有酶活性，也不是什么受體之類的，所以不知如何鑒定它的活性。 如果我得到的是變性的融合蛋白，那么用于制備多抗或者單抗會(huì)有影響嗎？ 如果我的融合蛋白是可溶性的，那么用GSH sepharose 4B純化得到的融合蛋白可以直接用于制備多抗嗎？溶液中的GSH，Tis等成分對(duì)免疫動(dòng)物有影響嗎？是否需要透析除取這些成分才能去免疫動(dòng)物呢？ 答：1）。不可以。GST 具體多大忘記了，但做為TAG 使用的 蛋白純化中的一點(diǎn)心得 .大腸桿菌表達(dá)外源蛋白，在超聲破碎的時(shí)候，用含有1%triton-X-100的PBS懸浮，然后超聲的效果較好，1%triton-X-100的作用還是很明顯的，對(duì)

41、其他的一些細(xì)菌同樣起作用，比如鏈霉菌。 2.利用Ni2+親和層析純化帶有His Tag的融合蛋白，在洗脫非特異結(jié)合蛋白的時(shí)候，首先用PBS洗脫3遍，每次10min，然后用含有低濃度的咪唑（40mM）的PBS繼續(xù)洗滌3遍，每遍10min；這樣可以將非特異的結(jié)合蛋白降低到最低。3.本人在選擇親和層析的時(shí)候偏向于選擇beads而不是已經(jīng)量化的柱子。分析其原因是因?yàn)閎eads的用量可以根據(jù)自己要純化的蛋白的多少?zèng)Q定beads的用量，而柱子不能；另外，一種蛋白最好選擇單獨(dú)的純化系統(tǒng)，無(wú)論怎樣洗脫，都很難將結(jié)合的蛋白全部洗下來(lái)，這樣就很容易對(duì)接下來(lái)其他蛋白的純化造成污染。4.Novagen的NTA是用來(lái)純

42、化His tag得比較好的產(chǎn)品，Pharmasia的GST tag純化系統(tǒng)比較好。5.要是純化后的蛋白用來(lái)做PULL-DOWN試驗(yàn)，最后的洗脫步驟就不用做了，直接將掛有蛋白的Beads保存在4度，不過(guò)要添加一定量的蛋白酶抑制劑和NaN3，保存時(shí)間可以到一個(gè)月。6.最后做完試驗(yàn)，要上樣SDS-PAGE鑒定，不用將蛋白洗脫下來(lái)，直接取10ul 的beads然后加入等體積的2*上樣buffer，然后沸水煮沸10min，短暫離心后，去5ul就可以上樣了。異源蛋白的表達(dá)是個(gè)很復(fù)雜的問(wèn)題，有許許多多的影響因素，而且由于蛋白本身千差萬(wàn)別，很難有一個(gè)很完善或很標(biāo)準(zhǔn)的流程方法。另外，表達(dá)的宿主也是多種多樣，目前

43、比較常用的包括E.coli，酵母（以甲醇酵母居多），昆蟲細(xì)胞，哺乳動(dòng)物細(xì)胞等，各自有著其本身的特點(diǎn)，優(yōu)缺點(diǎn)各異。1. 宿主的選擇。表達(dá)宿主雖眾多，但比較常用的也就E.coli，酵母（以甲醇酵母居多），昆蟲細(xì)胞，哺乳動(dòng)物細(xì)胞等，各自代表了一種體系。 E.coli 原核宿主，無(wú)翻譯后修飾。但周期短、費(fèi)用低、表達(dá)量大，一直是最常用的宿主之一。蛋白一般很好表達(dá)，量很大，但很可能由于蛋白的翻譯后修飾不完善而沒有活性(或形成包涵體)，尤其是表達(dá)真核蛋白時(shí)最應(yīng)注意。酵母，有了比較完備的翻譯后修飾系統(tǒng)，尤其是糖基化。但是個(gè)人感覺酵母表達(dá)異源蛋白時(shí)對(duì)蛋白本身的特點(diǎn)要求很大，有的蛋白表達(dá)量非常大，有的卻幾乎一點(diǎn)也

44、沒有，很折磨人。昆蟲細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞本人沒有做過(guò)，但園子里也有很詳細(xì)的介紹，搜一下google也有不少，其中還有許多是畫成了表格，對(duì)比各自的優(yōu)缺點(diǎn)，網(wǎng)絡(luò)不好，沒找鏈接，希望有人可以不全，多謝多謝！另外，也有很多用鏈霉菌表達(dá)的成功實(shí)例，不過(guò)個(gè)人感覺鏈霉做起來(lái)相當(dāng)麻煩，周期長(zhǎng)，轉(zhuǎn)化困難，表達(dá)量也沒什么優(yōu)勢(shì)，而且翻譯后修飾雖然也有，但仍與真核差別較大。不過(guò)鏈霉菌有許多次級(jí)代謝產(chǎn)物（一些小分子物質(zhì)）可能比蛋白表達(dá)本身更有意義2. 轉(zhuǎn)化子、表達(dá)子的篩選轉(zhuǎn)化子的篩選，由于許多質(zhì)粒是穿梭質(zhì)粒，因此大多具有E.coli中的抗性篩選標(biāo)記，篩選起來(lái)是很方便的（當(dāng)然，我不清楚細(xì)胞方面的篩選，一般使用病毒載體吧，希望高

45、手們介紹一下）。但是轉(zhuǎn)化成功的并不意味著能夠成功表達(dá)目的蛋白了，因此還需要“表達(dá)子”的篩選，尤其是整合入基因組的片斷（E.coli一般是游離質(zhì)粒表達(dá)，好像不用再篩選了，有就有，沒有就沒有了）。我做的是畢赤酵母(GS115,pPIC9k)，在篩選過(guò)程中遇到了不小的問(wèn)題，一般如果目的蛋白有些容易檢測(cè)的特殊活性（比如抑菌活性），則篩選起來(lái)是比較容易的。但是如果沒有，由于酵母是整合入基因組表達(dá)的，就不太好說(shuō)了，我用原位點(diǎn)雜交的方法篩選過(guò)，效果不好，但篩選量倒挺大；還有就是5ml小量發(fā)酵篩選，工作量就比較大了，而且篩了400-500個(gè)也沒有。還有就是發(fā)現(xiàn)不同的篩選方法獲得的陽(yáng)性菌株好像不是很平行，將上述

46、篩到的菌株放大到100ml時(shí)就沒有了。請(qǐng)教師兄，他說(shuō)有可能是不同水平發(fā)酵溶氧量差別很大，導(dǎo)致酵母生長(zhǎng)狀態(tài)差異，酵母又挺嬌氣的，差一點(diǎn)也不干活，比較郁悶。不知有沒有解決的方法。3. 稀有密碼子由于是異源表達(dá)，不同宿主之間其密碼子的偏好性就有不少的差異，這種差異經(jīng)常直接導(dǎo)致了異源表達(dá)的失敗。下面有幾個(gè)問(wèn)題，我有一些看法，希望大家能給與指導(dǎo)和幫助。首先，如何確定是否是該問(wèn)題導(dǎo)致的表達(dá)失敗。我的一位同學(xué)給了我個(gè)判斷方法的建議，覺得很有道理，和大家分享討論。他建議我在不同水平簡(jiǎn)單檢測(cè)一下表達(dá)的情況：基因水平，做個(gè)PCR之類的看看是否已成功轉(zhuǎn)入（質(zhì)粒或整合入宿主）；做個(gè)半定量RT-PCR看看mRNA是否轉(zhuǎn)

47、錄了；再看看SDS-PAGE是否有蛋白表達(dá)。如果根本轉(zhuǎn)化就失敗了，沒有什么好說(shuō)的；如果基因進(jìn)去了但mRNA沒有表達(dá)，可能需要考慮啟動(dòng)子的問(wèn)題，換個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子或干脆換個(gè)質(zhì)粒；如果mRNA轉(zhuǎn)錄了可沒有蛋白翻譯，那就需要考慮是否是密碼子偏好性或mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的問(wèn)題了。然后進(jìn)一步查證，需要利用軟件或上網(wǎng)查找是否存在這樣的二級(jí)結(jié)構(gòu)，以及是否含有稀有密碼子影響了翻譯。在這個(gè)問(wèn)題上我試著查了一些網(wǎng)站，如http:/www.kazusa.or.jp/codon/ ；http:/gcua.schoedl.de/ ；http:/www.genebee.msu.su/cgi-bin/nph-rna2.pl。等等。但

48、是許多東西看不太懂，理解起來(lái)有困難。希望能有軟件高手詳細(xì)介紹一下用法，尤其是能分析自己片斷是否含有很多稀有密碼子或二級(jí)結(jié)構(gòu)等。在此感謝了！接下來(lái)就是如果確定有可能是稀有密碼子問(wèn)題如何解決？目前我見到的有兩種方法，一是有些宿主比如大腸桿菌的Rosetta，是由BL21改造，整合了含稀有密碼子tRNA的片斷，使其能順利表達(dá)的新型宿主菌，不知其他種類的宿主是否也有這種商業(yè)化的修飾菌；另外就是利用PCR等方法將片斷上的稀有密碼子改造（突變），換成其他編碼同樣氨基酸的密碼子。當(dāng)然，還可能干脆就換表達(dá)體系了，這一般是大家最不希望的了。 4. 菌種的保存、退化一般來(lái)說(shuō)是加甘油20%左右，-70保存；或制成干

49、粉保存。但是在做甲醇酵母時(shí)發(fā)現(xiàn)了個(gè)問(wèn)題，就是重組工程菌的退化現(xiàn)象比較嚴(yán)重，一般都是學(xué)生做得好好的，但是畢業(yè)以后下面的師弟一接手，蛋白就不表達(dá)了，或表達(dá)量非常的低。連續(xù)好幾個(gè)師兄的結(jié)果都是如此，很是奇怪。我猜測(cè)可能是由于整合入基因組，畢竟是個(gè)外源的基因，不知整合到了染色體的什么部分，會(huì)不會(huì)過(guò)段時(shí)間就給“踢”下來(lái)，或就沉寂了？E.coli在復(fù)蘇時(shí)都有抗性壓著，酵母好像沒有太合適的（不知pPICZ系列的那個(gè)抗生素好用不好用，但畢竟好貴）。我有個(gè)想法，是否也應(yīng)像公司在做工程細(xì)胞時(shí)那樣，挑個(gè)幾十上百個(gè)，一起傳代，10幾代后仍然穩(wěn)定表達(dá)的才說(shuō)明基因整合到了合適的部位，不會(huì)再下來(lái)了？5. 拷貝數(shù)對(duì)表達(dá)量的影響對(duì)于“游離”的質(zhì)粒，比如E.coli的BL21表達(dá)時(shí)，質(zhì)粒的拷貝數(shù)是否對(duì)表達(dá)量有所影響？當(dāng)然，由于大腸表達(dá)最主要的問(wèn)題經(jīng)常是表達(dá)太高了形成了包涵體，所以說(shuō)白了應(yīng)該希望表達(dá)量更低點(diǎn)的可能比較多，經(jīng)常嘗試各種方法（低溫、低濃度IPTG等等）來(lái)降低表達(dá)量。那么BL21中的質(zhì)粒是