第2章1生化實(shí)驗(yàn)中的緩沖液

1、生化實(shí)驗(yàn)中的緩沖液生化實(shí)驗(yàn)中的緩沖液 緩沖溶液的正確配制和緩沖溶液的正確配制和pH值的準(zhǔn)確測(cè)定，在生物化值的準(zhǔn)確測(cè)定，在生物化學(xué)的研究工作中有著極為重要的意義，因?yàn)樵谏矬w內(nèi)學(xué)的研究工作中有著極為重要的意義，因?yàn)樵谏矬w內(nèi)進(jìn)行的各種生物化學(xué)過程都是在精確的進(jìn)行的各種生物化學(xué)過程都是在精確的pH值下進(jìn)行的，值下進(jìn)行的，而且受到而且受到H+的嚴(yán)格調(diào)控，能夠做到這一點(diǎn)是因?yàn)樯矬w的嚴(yán)格調(diào)控，能夠做到這一點(diǎn)是因?yàn)樯矬w內(nèi)有完善的天然緩沖系統(tǒng)。生物體內(nèi)細(xì)胞的生長和活動(dòng)內(nèi)有完善的天然緩沖系統(tǒng)。生物體內(nèi)細(xì)胞的生長和活動(dòng)需要一定的需要一定的pH值，體內(nèi)值，體內(nèi)pH環(huán)境的任何改變都將引起與代環(huán)境的任何改變都將引

2、起與代謝有關(guān)的酸堿電離平衡移動(dòng)，從而影響生物體內(nèi)細(xì)胞的謝有關(guān)的酸堿電離平衡移動(dòng)，從而影響生物體內(nèi)細(xì)胞的活性?；钚浴榱嗽趯?shí)驗(yàn)室條件下準(zhǔn)確地模擬生物體內(nèi)的天然環(huán)境，為了在實(shí)驗(yàn)室條件下準(zhǔn)確地模擬生物體內(nèi)的天然環(huán)境，就必須保持體外生物化學(xué)反應(yīng)過程有體內(nèi)過程完全相同就必須保持體外生物化學(xué)反應(yīng)過程有體內(nèi)過程完全相同的的pH值，此外，各種生化樣品的分離純化和分析鑒定，值，此外，各種生化樣品的分離純化和分析鑒定，也必須選用合適的也必須選用合適的pH值，因此，在生物化學(xué)的各種研究值，因此，在生物化學(xué)的各種研究工作中和生物技術(shù)的各種開發(fā)工作中，深刻地了解各種工作中和生物技術(shù)的各種開發(fā)工作中，深刻地了解各種緩沖試

3、劑的性質(zhì)，準(zhǔn)確恰當(dāng)?shù)剡x擇和配制各種緩沖溶液，緩沖試劑的性質(zhì)，準(zhǔn)確恰當(dāng)?shù)剡x擇和配制各種緩沖溶液，精確地測(cè)定溶液的精確地測(cè)定溶液的pH值，就是非常重要的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)工作。值，就是非常重要的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)工作。適合生命科學(xué)研究使用的緩沖體系應(yīng)具有以下特性：適合生命科學(xué)研究使用的緩沖體系應(yīng)具有以下特性： pKa值在值在68之間；之間； 在水中的溶解度高；在水中的溶解度高； 不易穿透生物膜；不易穿透生物膜； 鹽效應(yīng)小；鹽效應(yīng)??； 離子濃度、溶液組成和溫度對(duì)解離的影響??；離子濃度、溶液組成和溫度對(duì)解離的影響小； 不與金屬離子生成復(fù)合物或沉淀；不與金屬離子生成復(fù)合物或沉淀； 該緩沖劑化學(xué)穩(wěn)定；該緩沖劑化學(xué)穩(wěn)定； 紫外

4、和可見光波長范圍內(nèi)光吸收?。蛔贤夂涂梢姽獠ㄩL范圍內(nèi)光吸收??； 易制得高純度的鹽。易制得高純度的鹽。 按照這些要求可以設(shè)計(jì)和選擇最為合適的緩沖劑按照這些要求可以設(shè)計(jì)和選擇最為合適的緩沖劑來配制所需的緩沖溶液。來配制所需的緩沖溶液。人體體液的人體體液的pH值：值：體體 液液pH體體 液液pH血血 清清7.357.45 大腸液大腸液8.38.0成人胃液成人胃液0.91.5淚淚6.66.9 唾唾 液液6.37.1尿尿4.87.5胰胰 液液7.58.0腦脊液腦脊液7.357.45（一）磷酸鹽緩沖液（一）磷酸鹽緩沖液 磷酸鹽是生物化學(xué)研究中使用最廣泛的一種緩沖劑，磷酸鹽是生物化學(xué)研究中使用最廣泛的一種緩沖

5、劑，由於它們是二級(jí)解離，有二個(gè)由於它們是二級(jí)解離，有二個(gè)pKa值，所以用它們配制值，所以用它們配制的緩沖液，的緩沖液，pH范圍最寬：范圍最寬： NaH2PO4： pKa12.12， pKa27.21 Na2HPO4： pKa17.21， pKa212.32 配酸性緩沖液：配酸性緩沖液： 用用 NaH2PO4，pH14， 配中性緩沖液：配中性緩沖液： 用混合的兩種磷酸鹽，用混合的兩種磷酸鹽，pH68， 配堿性緩沖液：配堿性緩沖液： 用用 Na2HPO4，pH1012。 用鉀鹽比鈉鹽好，因?yàn)榈蜏貢r(shí)鈉鹽難溶，鉀鹽易溶，用鉀鹽比鈉鹽好，因?yàn)榈蜏貢r(shí)鈉鹽難溶，鉀鹽易溶，但若配制但若配制SDS-聚丙烯酰胺凝

6、膠電泳的緩沖液時(shí)，只能聚丙烯酰胺凝膠電泳的緩沖液時(shí)，只能用磷酸鈉而不能用磷酸鉀，因?yàn)橛昧姿徕c而不能用磷酸鉀，因?yàn)镾DS（十二烷基硫酸鈉（十二烷基硫酸鈉）會(huì)與鉀鹽生成難溶的十二烷基硫酸鉀。）會(huì)與鉀鹽生成難溶的十二烷基硫酸鉀。 磷酸鹽緩沖液的優(yōu)點(diǎn)為：磷酸鹽緩沖液的優(yōu)點(diǎn)為： 容易配制成各種濃度的緩沖液；容易配制成各種濃度的緩沖液； 適用的適用的pH范圍寬；范圍寬； pH受溫度的影響??；受溫度的影響小； 緩沖液稀釋后緩沖液稀釋后pH變化小，如稀釋十倍后變化小，如稀釋十倍后pH的變化小的變化小于于0.1。 其缺點(diǎn)為：其缺點(diǎn)為： 易與常見的鈣易與常見的鈣Ca2+離子、鎂離子、鎂Mg2+離子以及重金屬離子離

7、子以及重金屬離子締合生成沉淀；締合生成沉淀； 會(huì)抑制某些生物化學(xué)過程，如對(duì)某些酶的催化作用會(huì)抑制某些生物化學(xué)過程，如對(duì)某些酶的催化作用會(huì)產(chǎn)生某種程度的抑制作用。會(huì)產(chǎn)生某種程度的抑制作用。 應(yīng)用：應(yīng)用： 1、PB緩沖液：緩沖液：Na2HPO4-NaH2PO4; 2、PBS緩沖液：緩沖液：Na2HPO4-KH2PO4 , NaCl+KCl (二二) Tris（三羥甲基氨基甲烷，（三羥甲基氨基甲烷，N-Tris (hydroxymethyl) aminomethane）緩沖液）緩沖液 Tris緩沖液在生物化學(xué)研究中使用的越來越多，有緩沖液在生物化學(xué)研究中使用的越來越多，有超過磷酸鹽緩沖液的趨勢(shì)，如在

8、超過磷酸鹽緩沖液的趨勢(shì)，如在SDS-聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠電泳中已都使用電泳中已都使用Tris緩沖液，而很少再用磷酸鹽。緩沖液，而很少再用磷酸鹽。 Tris緩沖液的常用有效緩沖液的常用有效pH范圍是在范圍是在“中性中性”范圍，范圍， 例如：例如： Tris-HCl緩沖液：緩沖液： pH7.58.5 Tris-磷酸鹽緩沖液：磷酸鹽緩沖液： pH5.09.0 配制常用的緩沖液的方法有兩種：配制常用的緩沖液的方法有兩種： 按書后附錄中所列該緩沖液表中的方法，分別配制按書后附錄中所列該緩沖液表中的方法，分別配制0.05mol/L Tris和和0.05mol/L HCl溶液，然后按表中所列溶液，然

9、后按表中所列體積混合。由于標(biāo)準(zhǔn)濃度的稀鹽酸不易配制，所以常體積混合。由于標(biāo)準(zhǔn)濃度的稀鹽酸不易配制，所以常用另一種方法；用另一種方法； 若配若配1L 0.1mol/L的的Tris-HCl緩沖液：先稱緩沖液：先稱12.11g Tris堿溶于堿溶于950mL970mL 無離子水中，邊攪拌邊滴加無離子水中，邊攪拌邊滴加4mol/L HCl，用，用pH計(jì)測(cè)定溶液計(jì)測(cè)定溶液pH值至所需的值至所需的pH值，然值，然后再加水補(bǔ)足到后再加水補(bǔ)足到1L。 Tris-HCl緩沖液的優(yōu)點(diǎn)是：緩沖液的優(yōu)點(diǎn)是： 因?yàn)橐驗(yàn)門ris堿的堿性較強(qiáng)，所以可以只用這一種緩沖體堿的堿性較強(qiáng)，所以可以只用這一種緩沖體系配制系配制pH范

10、圍由酸性到堿性的大范圍范圍由酸性到堿性的大范圍pH值的緩沖液；值的緩沖液； 對(duì)生物化學(xué)過程干擾很小，不與鈣、鎂離子及重金對(duì)生物化學(xué)過程干擾很小，不與鈣、鎂離子及重金屬離子發(fā)生沉淀。屬離子發(fā)生沉淀。 其缺點(diǎn)是：其缺點(diǎn)是： 緩沖液的緩沖液的pH值受溶液濃度影響較大，緩沖液稀釋十值受溶液濃度影響較大，緩沖液稀釋十倍，倍，pH值的變化大于值的變化大于0.1； 溫度效應(yīng)大，溫度變化對(duì)緩沖液溫度效應(yīng)大，溫度變化對(duì)緩沖液pH值的影響很大，值的影響很大，即：即：pKa0.031 ，例如：，例如：4時(shí)緩沖液的時(shí)緩沖液的pH8.4，則，則37時(shí)的時(shí)的pH7.4，所以一定要在使用溫度下進(jìn)，所以一定要在使用溫度下進(jìn)行

11、配制，室溫下配制的行配制，室溫下配制的Tris-HCl緩沖液不能用于緩沖液不能用于04; 易吸收空氣中的易吸收空氣中的CO2，所以配制的緩沖液要蓋嚴(yán)密封，所以配制的緩沖液要蓋嚴(yán)密封; 此緩沖液對(duì)某些此緩沖液對(duì)某些pH電極發(fā)生一定的干擾作用，所以電極發(fā)生一定的干擾作用，所以要使用與要使用與Tris溶液具有兼容性的電極。溶液具有兼容性的電極。 （三）（三） 有機(jī)酸緩沖液有機(jī)酸緩沖液 這一類緩沖液多數(shù)是用羧酸與它們的鹽配制而成，這一類緩沖液多數(shù)是用羧酸與它們的鹽配制而成，pH范圍為酸性，即范圍為酸性，即pH3.06.0，最常用的是甲酸、，最常用的是甲酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸等。乙酸、檸檬酸和琥珀酸等

12、。 甲酸甲酸鹽緩沖液很有用，因其揮發(fā)性強(qiáng)，使用甲酸甲酸鹽緩沖液很有用，因其揮發(fā)性強(qiáng)，使用后可以用減壓法除之。乙酸乙酸鈉和檸檬酸檸檬后可以用減壓法除之。乙酸乙酸鈉和檸檬酸檸檬酸鈉緩沖體系也使用的較多，檸檬酸有三個(gè)酸鈉緩沖體系也使用的較多，檸檬酸有三個(gè)pKa值：值：pKa13.10，pKa24.75， pKa36.40。琥珀酸有二個(gè)。琥珀酸有二個(gè)pKa值：值：pKa14.18， pKa25.60。 有機(jī)酸緩沖液的缺點(diǎn)是：有機(jī)酸緩沖液的缺點(diǎn)是： 所有這些羧酸都是天然的代謝產(chǎn)物，因而對(duì)生化反所有這些羧酸都是天然的代謝產(chǎn)物，因而對(duì)生化反應(yīng)過程可能發(fā)生干擾作用；應(yīng)過程可能發(fā)生干擾作用； 檸檬酸鹽和琥珀酸鹽

13、可以和過渡金屬離子（檸檬酸鹽和琥珀酸鹽可以和過渡金屬離子（Fe3+、Zn2+、Mg2+等）結(jié)合而使緩沖液受到干擾；等）結(jié)合而使緩沖液受到干擾； 這類緩沖液易與這類緩沖液易與Ca2+離子結(jié)合，所以樣品中有離子結(jié)合，所以樣品中有Ca2+離離子時(shí)，不能用這類緩沖液。子時(shí)，不能用這類緩沖液。 （四）硼酸鹽緩沖液（四）硼酸鹽緩沖液 常用的有效常用的有效pH范圍是：范圍是：pH8.510.0，因而它是堿，因而它是堿性范圍內(nèi)最常用的緩沖液，其優(yōu)點(diǎn)是配制方便，只使性范圍內(nèi)最常用的緩沖液，其優(yōu)點(diǎn)是配制方便，只使用一種試劑，缺點(diǎn)是能與很多代謝產(chǎn)物形成絡(luò)合物，用一種試劑，缺點(diǎn)是能與很多代謝產(chǎn)物形成絡(luò)合物，尤其是能與

14、糖類的羥基反應(yīng)生成穩(wěn)定的復(fù)合物而使緩尤其是能與糖類的羥基反應(yīng)生成穩(wěn)定的復(fù)合物而使緩沖液受到干擾。沖液受到干擾。 （五）氨基酸緩沖液（五）氨基酸緩沖液 此緩沖液使用的范圍寬，可用于此緩沖液使用的范圍寬，可用于pH=2.011.0，例如，例如最常用的有：最常用的有： 甘氨酸甘氨酸HCl緩沖液：緩沖液：pH=2.05.0， 甘氨酸甘氨酸NaOH緩沖液：緩沖液：pH=8.011.0， 甘氨酸甘氨酸Tris緩沖液：緩沖液：pH=8.011.0，（此緩沖，（此緩沖液用于廣泛使用的液用于廣泛使用的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的電極聚丙烯酰胺凝膠電泳的電極緩沖液），緩沖液）， 組氨酸緩沖液：組氨酸緩沖液：pH=5

15、.56.5， 甘氨酰胺緩沖液：甘氨酰胺緩沖液：pH=7.88.8， 甘氨酰甘氨酸緩沖液：甘氨酰甘氨酸緩沖液：pH=8.09.0。 此類緩沖體系的優(yōu)點(diǎn)是：此類緩沖體系的優(yōu)點(diǎn)是：為細(xì)胞組份和各種提取液提為細(xì)胞組份和各種提取液提供更接近的天然環(huán)境。供更接近的天然環(huán)境。 其缺點(diǎn)是：其缺點(diǎn)是： 與羧酸鹽和磷酸鹽緩沖體系相似，也會(huì)干擾某些生與羧酸鹽和磷酸鹽緩沖體系相似，也會(huì)干擾某些生物化學(xué)反應(yīng)過程，如代謝過程等。物化學(xué)反應(yīng)過程，如代謝過程等。 試劑的價(jià)格較高。試劑的價(jià)格較高。 （六）兩性離子緩沖液（六）兩性離子緩沖液（Zwitterionic buffers），又），又稱稱Goods緩沖液緩沖液 1960

16、年，年，N.E.Good和他的同事們總結(jié)了現(xiàn)有的各種緩和他的同事們總結(jié)了現(xiàn)有的各種緩沖試劑的優(yōu)缺點(diǎn)后認(rèn)為，必須用人為設(shè)計(jì)和人工合成的沖試劑的優(yōu)缺點(diǎn)后認(rèn)為，必須用人為設(shè)計(jì)和人工合成的方法來找到專門用于生命科學(xué)研究的特定的緩沖體系，方法來找到專門用于生命科學(xué)研究的特定的緩沖體系，這些緩沖體系應(yīng)具有特有的要求和特性。他們合成的一這些緩沖體系應(yīng)具有特有的要求和特性。他們合成的一系列系列Goods緩沖液可查閱有關(guān)的資料。緩沖液可查閱有關(guān)的資料。 Goods緩沖液的主要優(yōu)點(diǎn)是不參加和不干擾生物化學(xué)緩沖液的主要優(yōu)點(diǎn)是不參加和不干擾生物化學(xué)反應(yīng)過程，對(duì)酶化學(xué)反應(yīng)等無抑制作用，所以它們專反應(yīng)過程，對(duì)酶化學(xué)反應(yīng)等

17、無抑制作用，所以它們專門用于細(xì)胞器和極易變性的、對(duì)門用于細(xì)胞器和極易變性的、對(duì)pH敏感的蛋白質(zhì)和酶敏感的蛋白質(zhì)和酶的研究工作。的研究工作。 其缺點(diǎn)是：其缺點(diǎn)是： 價(jià)格昂貴，價(jià)格昂貴， 對(duì)測(cè)定蛋白質(zhì)含量的雙縮脲法和對(duì)測(cè)定蛋白質(zhì)含量的雙縮脲法和Lowry法不適用，法不適用，因?yàn)樗鼈儠?huì)使空白管的顏色加深。因?yàn)樗鼈儠?huì)使空白管的顏色加深。Goods緩沖液的配制緩沖液的配制(七) pH值的測(cè)定 測(cè)定溶液pH值通常有兩種方法，最簡(jiǎn)便但較粗略的方法是用pH試紙，分為廣泛和精密pH試紙兩種。 廣泛pH試紙的變色范圍是pH=1-14、9-14等，只能粗略確定溶液的pH值。 精密pH試紙，可以較精確地測(cè)定溶液的pH值，其變色范圍是2-3個(gè)pH單位，例如有pH=1.4-3.0、5.4-7.0、9.5-13.0等許多種，可根據(jù)待測(cè)溶液的酸、堿性選用某一范圍的試紙。 測(cè)定的方法是將試紙條剪成小塊，用鑷子夾一小塊試紙，用玻璃棒蘸少許溶液與試紙接觸，試紙變色后與色階板對(duì)照，估讀出所測(cè)pH值。切不可將試紙直接放入溶液中，以免污染樣品溶液。 精確測(cè)