乙肝兩對半定性測定課件

1、乙肝兩對半測定(cdng) 酶聯(lián)免疫法實習生：廖於波指導(dǎo)老師：李海龍(hi ln)第一頁，共三十二頁。HBV是乙型病毒性肝炎的病原體。HBV感染呈世界性流行，但不同地區(qū)感染的流行程度差異很大。據(jù)WHO報道，全球約20億人曾感染過HBV，其中3.5億人為慢性感染者，每年約有100萬人死于HBV感染所致(su zh)的肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝細胞癌。我國屬高流行地區(qū)一般地區(qū)HBsAg陽性率為7.18%。第二頁，共三十二頁。乙肝病毒血清(xuqng)標志物HBsAgn第一個出現(xiàn)，感染后1-2周即可陽性n陽性表示存在HBV感染HBsAbn出現(xiàn)在HBsAg消失后n保護性抗體n疫苗免疫成功(chnggng

2、)的標志 第三頁，共三十二頁。乙肝病毒血清(xuqng)標志物HBeAgn病毒(bngd)復(fù)制標志n傳染性強HBeAb n傳染性降低n長期存在是DNA與肝細胞整合的結(jié)果第四頁，共三十二頁。乙肝病毒血清(xuqng)標志物HBcAg nHBV復(fù)制的標志n血清中難以檢測出來(ch li)IgM-HBcAb n急性HBV感染IgG-HBcAbn急性感染恢復(fù)期和慢性持續(xù)感染第五頁，共三十二頁。檢測HBV病毒血清(xuqng)標志物是臨床最常用的病原學診斷方法。HBV具有三個抗原抗體系統(tǒng)，即乙肝表面抗原（HBSAg）和乙肝表面抗體（HBsAb）、e抗原（HBeAg）和e抗體（HBeAb）、核心抗原（HB

3、cAg）核心抗體（HBcAb），由于HBcAg在血液中難于檢出，故臨床免疫學檢測不包括HBcAg，目前常采用酶聯(lián)免疫法和化學發(fā)光法檢測。第六頁，共三十二頁。酶聯(lián)免疫吸附實驗(shyn)原理用于檢測包被(bo bi)于固相板孔中的待測抗原（或抗體）。即用酶標記抗體，并將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使抗原抗體反應(yīng)在固相載體表面進行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除，最后通過酶作用于底物后顯色來判斷結(jié)果。顏色反應(yīng)的深淺與標本中相應(yīng)抗體或抗原的量呈正比。第七頁，共三十二頁。乙肝病毒血清(xuqng)標志物檢測原理血清學標志原理包被試劑標記或結(jié)合物結(jié)果判斷HBsAg夾心法HBsAbHBsAb顯色(

4、+)HBsAb夾心法HBsAgHBsAg顯色(+)HBeAg夾心法HBeAbHBeAb顯色(+)HBeAb競爭法HBeAbHBeAb及中和抗原不顯色(+)HBcAb競爭法HBcAgHBcAb不顯色(+)第八頁，共三十二頁。標本(biobn)本要求采集： 血漿：使用抗凝血漿管（枸櫞酸鹽、EDTA鹽、肝素(n s)之一為抗凝劑）采集樣品。樣品離心分離后，提取血漿用于檢測。 血清：采用正確醫(yī)用技術(shù)采集標本。離心分離后，提取血清樣品用于檢測。第九頁，共三十二頁。標本(biobn)要求儲存：樣品可存放于28冰箱，24小時內(nèi)測定。若需長時間保存，則應(yīng)凍存于-20以下，避免反復(fù)凍融。上述樣品使用前應(yīng)恢復(fù)(h

5、uf)到室溫，輕輕搖動混勻。若標本有沉淀物形成，應(yīng)離心除去，并確定未變質(zhì)方可使用。嚴重融血或脂血標本不可使用。第十頁，共三十二頁。試劑(shj)（安圖生物）編號編號組分名稱組分名稱96人份人份1包被板69孔X1塊2樣品稀釋液2.3ml X1瓶3酶結(jié)合物5.5ml X1瓶4底物液6.2ml X1瓶5顯色劑6.2ml X1瓶6洗滌液30ml X1瓶7終止液5.5ml X1瓶8陰性對照1.0ml X1瓶9陽性對照1.0ml X1瓶10子母袋1個11說明書1份12板貼3張主要組成主要組成(z chn)成成分分第十一頁，共三十二頁。實驗(shyn)前準備1.取出試劑盒及待測樣品，將所有試劑及樣品恢復(fù)至室

6、溫（1825）。2.將恒溫箱或水浴鍋調(diào)至反應(yīng)溫度。3.洗液用蒸餾水作20倍稀釋(xsh)后備用。第十二頁，共三十二頁。檢驗(jinyn)步驟排板第十三頁，共三十二頁。檢驗(jinyn)步驟表面抗原（兩步法）1.留一孔作空白對照，加入樣本稀釋液20ul/孔（含空白孔），其他加入陰性對照三孔和陽性對照二孔100ul/孔及待測標本100ul/孔于相應(yīng)的反應(yīng)孔內(nèi)。2.在微型真當器上振蕩30秒使孔內(nèi)液體混合均勻（該步驟非常(fichng)重要）。3.貼上板貼，置37下溫育60分鐘。第十四頁，共三十二頁。檢驗(jinyn)步驟4.撕下板貼，除空白孔外，各孔加入(jir)酶結(jié)合物50ul。5.在微型振蕩器上

7、振蕩30秒使孔內(nèi)液體混合均勻（該步驟非常重要）。6.貼上板貼，置37下溫育30分鐘。7.撕下板貼，洗板6次，最后在吸水紙上拍干。8.每孔加入底物液、顯色劑各50ul，37避光溫育30分鐘。第十五頁，共三十二頁。檢驗(jinyn)步驟9.加終止液50ul/孔，輕輕振蕩混勻后，立即(lj)測試結(jié)果。10.使用酶標儀450nm單波長測量各孔的OD值。第十六頁，共三十二頁。檢驗(jinyn)步驟表面抗體、e抗原、e抗體、核心抗體（一步法）1.留一孔空白，三孔加入(jir)陰性對照、二孔加入(jir)陽性對照各50ul/孔，其他各孔分別加入(jir)樣本50ul (HBcAb測定時待測血清用生理鹽水1:

8、30稀釋50ul血清+1.5ml生理鹽水) 。2.除空白孔外，各孔加入酶結(jié)合物50ul。3.在微型真當器上振蕩30秒使孔內(nèi)液體混合均勻（該步驟非常重要）。4.貼上板貼，置37下溫育30分鐘。第十七頁，共三十二頁。檢驗(jinyn)步驟5.撕下板貼，洗板6次，最后在吸水紙上拍干。6.每孔加入底物液、顯色劑各50ul，37避光反應(yīng)10分鐘。7.加終止液50ul/孔，輕輕振蕩混勻后，立即測試結(jié)果。8.使用(shyng)酶標儀450nm單波長測量各孔的OD值。第十八頁，共三十二頁。第十九頁，共三十二頁。第二十頁，共三十二頁。第二十一頁，共三十二頁。結(jié)果(ji gu)判定血清學標志原理包被試劑標記或結(jié)合

9、物結(jié)果判斷HBsAg夾心法HBsAbHBsAb顯色(+)HBsAb夾心法HBsAgHBsAg顯色(+)HBeAg夾心法HBeAbHBeAb顯色(+)HBeAb競爭法HBeAbHBeAb及中和抗原不顯色(+)HBcAb競爭法HBcAgHBcAb不顯色(+)1.肉眼(ruyn)判定第二十二頁，共三十二頁。結(jié)果(ji gu)判定2.酶標儀判定：用酶標儀單波長(bchng)450nm或雙波長(bchng)450nm/630nm測定各孔OD值，根據(jù)OD值判定結(jié)果第二十三頁，共三十二頁。注意事項濃縮洗滌液配制前充分搖勻。加樣本(yngbn)時要加到孔底。加試劑前應(yīng)將試劑瓶翻轉(zhuǎn)數(shù)次，使液體混勻。如果滴加，滴

10、加前應(yīng)棄去1-2滴。第二十四頁，共三十二頁。注意事項滴加時瓶身應(yīng)保持垂直，以使滴量準確。勿將試劑滴在孔壁上。洗滌時各孔須加滿，防止孔口(kn ku)內(nèi)有游離酶殘留。洗滌時注意孔與孔之間的交叉污染。脂血，溶血可影響結(jié)果。第二十五頁，共三十二頁。注意事項所有樣本都應(yīng)按傳染源處理。樣品顯色深淺與樣品中抗體的含量(hnling)沒有一定正相關(guān)。任何一種測試都不能絕對保證樣品中沒有低濃度的抗體存在。不同品名、不同批號的試劑不可混用，以免產(chǎn)生錯誤結(jié)果。第二十六頁，共三十二頁。影響(yngxing)檢測結(jié)果的因素1.樣本采集與處理的影響 1.1 標本嚴重溶血。 1.2 標本凝固不全：血液還未開始凝固時即強行

11、(qingxng)離心分離血清，使血清中仍殘留部分纖維蛋原。2、試劑的影響 2.1 不同批號。 2.2 不同廠家。第二十七頁，共三十二頁。影響檢測(jin c)結(jié)果的因素3.操作(cozu)技術(shù)的影響 3.1 加樣吸嘴的潔凈與否和吸量的準確性，直接影響檢測結(jié)果。 3.2 溫浴影響。 3.3 手洗條件一致性較差，對結(jié)果影響較大，半自動與全自動洗板機使用不當也會影響結(jié)果。第二十八頁，共三十二頁。常見(chn jin)模式及臨床意義HBsAgHBsAbHBeAgHBeAbHBcAb臨 床 意 義+ + + +急性或慢性乙型肝炎感染；提示HBV復(fù)制，傳染性強大三陽大三陽+ + + +急性HBV感染趨向

12、恢復(fù)；慢性HBsAg攜帶者；傳染性弱小三陽小三陽+ + +急性HBV感染；慢性HBsAg攜帶者；傳染性弱+ + +慢性HBsAg攜帶者易轉(zhuǎn)陰；急性HBV感染趨向恢復(fù)+ + +急性HBV感染早期或慢性攜帶者，傳染性強+ +急性HBV感染早期；急性HBV感染潛伏期；慢性HBV攜帶者，傳染性弱第二十九頁，共三十二頁。常見(chn jin)模式及臨床意義HBsAgHBsAbHBeAgHBeAbHBcAb臨 床 意 義+ + + +非典型性或亞臨床型HBV感染+ +注射過乙肝疫苗有免疫力；既往感染；假陽性+ + + +急性HBV感染后康復(fù)+ + +HBV感染后已恢復(fù)+ + +既往感染，仍有免疫力；HBV感染恢復(fù)期+ +既往感染未能測出HBsAb；恢復(fù)期HBsAg已消，HBsAb尚未出現(xiàn)；無癥狀HBsAg攜帶者過去和現(xiàn)在未感染過HBV第三十頁，共三十二頁。第三十一頁，共三十二頁。內(nèi)容(nirng)總結(jié)乙肝兩對半測定 酶聯(lián)免疫(mi