生物測(cè)定技術(shù)

1、第四章 除草劑生物測(cè)定技術(shù) u除草劑生物測(cè)定的意義 u除草劑生物測(cè)定的基本原理 u除草劑生物測(cè)定技術(shù)程序和原則u除草劑生物測(cè)定方法簡(jiǎn)介u除草劑田間藥效試驗(yàn)一、除草劑生物測(cè)定的意義一、除草劑生物測(cè)定的意義v生物測(cè)定是除草劑研究種不可缺少的手段生物測(cè)定是除草劑研究種不可缺少的手段v某種化合物是否具有殺草活性某種化合物是否具有殺草活性v為特定雜草篩選一種除草劑為特定雜草篩選一種除草劑v除草劑作用方式的研究除草劑作用方式的研究 二、除草劑生物測(cè)定的基本原理二、除草劑生物測(cè)定的基本原理 試驗(yàn)均在同一控制條件下試驗(yàn)均在同一控制條件下必須設(shè)對(duì)照，每一處理重復(fù)必須設(shè)對(duì)照，每一處理重復(fù)34次次試材應(yīng)該健壯、整齊

2、、隨機(jī)排列試材應(yīng)該健壯、整齊、隨機(jī)排列測(cè)定結(jié)果應(yīng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析測(cè)定結(jié)果應(yīng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析在一定范圍內(nèi)，生物試材與除草劑濃度在一定范圍內(nèi)，生物試材與除草劑濃度成比例的傷害反應(yīng)成比例的傷害反應(yīng)三、除草劑生物測(cè)定技術(shù)的程序和原則三、除草劑生物測(cè)定技術(shù)的程序和原則 （）生物測(cè)定材料的選擇試材的選擇應(yīng)兼?zhèn)鋵?duì)藥劑較感性高和具有一定的可測(cè)范圍以及大量易得的均一材料。（二）測(cè)定參數(shù)的選擇試材對(duì)除草劑的反應(yīng)可以通過各種參數(shù)來評(píng)價(jià)。除草劑對(duì)植物的影響一般為非專一性的，因此，各種器官均能作為某一除草劑的活力指標(biāo)。 種子發(fā)芽率許多除草劑可抑制敏感種子的發(fā)芽及胚根和芽鞘的生長(zhǎng)、因此，可以利用觀察種子的萌發(fā)率來測(cè)定某種藥劑

3、的存在與否。 植株生長(zhǎng)量在生物測(cè)定中，試材重量的測(cè)定是最常用的。 主要測(cè)定參數(shù)生理生化指標(biāo)生理生化指標(biāo)在肉眼可見的反應(yīng)出現(xiàn)之前，試材的生理生化的變化往往可以測(cè)定出來。植物呼吸和光合作用以及所含成分或新陳代謝物質(zhì)的變化等都可以作為測(cè)定的指標(biāo)。癥狀癥狀有些除草劑可引起試材的典型癥狀，因此，可以利用此種反應(yīng)來鑒定除草劑。 特殊技術(shù)特殊技術(shù)Parker以青萍為試材，以百草枯和脲類除草劑的拮抗作用來測(cè)青萍的濃度；若以愈傷組織為試材，則測(cè)愈傷組織的生長(zhǎng)量。 測(cè)定結(jié)果表達(dá)方法測(cè)定結(jié)果表達(dá)方法正確地評(píng)價(jià)某一藥劑的生物測(cè)定結(jié)果是很重要的 。常用地上部鮮重減少50（ED50）、地上部干重減少50CR50、株高減少

4、50（LD50?；駿D50）及覆蓋面積減少50（EC50）所需要的除草劑量來表示這一類試驗(yàn)結(jié)果。 Y=a+bx0級(jí)級(jí)同對(duì)照同對(duì)照 1級(jí)級(jí)抑劑生長(zhǎng)抑劑生長(zhǎng)25以下以下 2級(jí)級(jí)抑制生長(zhǎng)抑制生長(zhǎng)50以下以下 3級(jí)級(jí)抑制生長(zhǎng)抑制生長(zhǎng)75以下以下 4級(jí)級(jí)抑制生長(zhǎng)抑制生長(zhǎng)75以上以上 5級(jí)級(jí)死亡死亡目測(cè)的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)目測(cè)的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)四、除草劑常用的生物測(cè)定方法四、除草劑常用的生物測(cè)定方法 v黃瓜幼苗法黃瓜幼苗法v小杯法小杯法v小球藻法小球藻法v去胚乳小麥幼苗法去胚乳小麥幼苗法v浮萍法浮萍法 種子發(fā)芽測(cè)定法是一種常用的除草劑種子發(fā)芽測(cè)定法是一種常用的除草劑活性測(cè)定方法，種子發(fā)芽率、根與莖的生活性測(cè)定方法，種子發(fā)芽

5、率、根與莖的生長(zhǎng)量或作長(zhǎng)度在一定范圍內(nèi)與藥劑劑量呈長(zhǎng)量或作長(zhǎng)度在一定范圍內(nèi)與藥劑劑量呈相關(guān)性，因此可用作除草劑的定量測(cè)定，相關(guān)性，因此可用作除草劑的定量測(cè)定，有較高的靈敏度。有較高的靈敏度。種子發(fā)芽測(cè)定法種子發(fā)芽測(cè)定法 1發(fā)芽率發(fā)芽率 調(diào)查對(duì)照處理和藥劑處理種子的發(fā)芽數(shù)量，然后計(jì)算發(fā)芽率。 藥劑處理的發(fā)芽數(shù) 發(fā)芽率（）一一X 100 對(duì)照處理的發(fā)芽數(shù) 調(diào)查項(xiàng)目調(diào)查項(xiàng)目2生長(zhǎng)抑制率生長(zhǎng)抑制率 測(cè)定發(fā)芽以后芽或根的長(zhǎng)度，或者是測(cè)量鮮重或干重（較少）。 對(duì)照處理一藥劑處理生長(zhǎng)抑制率（%）X100 對(duì)照處理1.黃瓜幼苗形態(tài)法黃瓜幼苗形態(tài)法。1234CK57%2,4D丁酯乳油對(duì)黃瓜種苗的抑制作用丁酯乳油

6、對(duì)黃瓜種苗的抑制作用100mg/L10mg/L1mg/L1mg/L0.01mg/LCK 本方法是測(cè)定激素類除草劑及其他植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑活性的常用方法，具有 反 應(yīng) 靈 敏 、 測(cè) 定 范 圍 大（0.11000ppm），操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。 2.小杯法小杯法4 5 CK 1 2 3 該法是上海植物生理研究所于該法是上海植物生理研究所于1972年建立的。年建立的?？梢詼y(cè)定二苯醚類，酰胺類和氨基甲酸酯類、氯可以測(cè)定二苯醚類，酰胺類和氨基甲酸酯類、氯代脂肪酸類等除草劑的活性，但對(duì)抑制植物光合代脂肪酸類等除草劑的活性，但對(duì)抑制植物光合作用的除草劑則幾乎不能采用。作用的除草劑則幾乎不能采用。該法具有操作簡(jiǎn)便，

7、測(cè)定周期短、范圍較廣的該法具有操作簡(jiǎn)便，測(cè)定周期短、范圍較廣的優(yōu)點(diǎn)。優(yōu)點(diǎn)。 試材選用小麥、油菜、水稻、稗草等。以直徑3.5 cm，高5.0cm的玻璃杯為容器（亦可用50ml 的小燒杯代替）。杯底放一張圓濾紙片，吸取一定量的有機(jī)溶劑溶解的待測(cè)藥液倒入杯內(nèi)，揮發(fā)干溶劑。若以水稻、稗草等水生雜草種子為試材，則在小燒杯中加入2ml蒸餾水；3d后分別記載株高或測(cè)定鮮重。計(jì)算抑制生長(zhǎng)50所需要的濃度（LC50）。 若以小麥、油菜種子為試材、則在濾紙片下放一層直徑約為0.5cm大小的玻璃珠（短玻棒也可）再加入3ml蒸餾水。選擇剛萌動(dòng)的種子10粒，排放到濾紙片上，置28恒溫箱培養(yǎng)，白天給予日光燈照。培養(yǎng)期間每

8、天加入一定量蒸餾水來補(bǔ)充揮發(fā)掉的水份。 0級(jí)級(jí)同對(duì)照同對(duì)照 1級(jí)級(jí)抑制生長(zhǎng)抑制生長(zhǎng)25以下以下 2級(jí)級(jí)抑制生長(zhǎng)抑制生長(zhǎng)50以下以下 3級(jí)級(jí)抑制生長(zhǎng)抑制生長(zhǎng)75以下以下 4級(jí)級(jí)抑制生長(zhǎng)抑制生長(zhǎng)75以上以上 藥效的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為藥效的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為然后計(jì)算每一濃度處理的抑制指數(shù)： （級(jí)別X各級(jí)代表株數(shù)）抑制指數(shù)X100總株數(shù)X最高級(jí)別 將抑制指數(shù)（抑制百分?jǐn)?shù)）轉(zhuǎn)換為機(jī)率值，濃度（劑量）以對(duì)數(shù)值表示，求出EC50。 本法是本法是Parker于于1966年首先報(bào)道年首先報(bào)道的，后經(jīng)改進(jìn)，縮短測(cè)定時(shí)間。高的，后經(jīng)改進(jìn)，縮短測(cè)定時(shí)間。高粱法適宜于測(cè)定非光合作用抑制劑，粱法適宜于測(cè)定非光合作用抑制劑，它具有操作簡(jiǎn)便

9、，培養(yǎng)期間不用管它具有操作簡(jiǎn)便，培養(yǎng)期間不用管理、周期短，測(cè)定范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。理、周期短，測(cè)定范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。還可改用燕麥、黃瓜等為材料來擴(kuò)還可改用燕麥、黃瓜等為材料來擴(kuò)大測(cè)試范圍。大測(cè)試范圍。3.高梁法簡(jiǎn)介高梁法簡(jiǎn)介培養(yǎng)皿黃砂除草劑高梁種子 上海植生所的方法是：用直徑9cm的培養(yǎng)皿，裝滿干燥黃砂并刮平，每皿加人30ml藥液，正好使全皿黃砂浸透，然后用有十個(gè)齒的齒板在皿的適當(dāng)位置壓孔（或用細(xì)玻棒均勻壓10個(gè)孔）以便每皿能排10位根長(zhǎng)12mm（根尖尚未長(zhǎng)出根鞘）的萌發(fā)高粱種子（一般于試驗(yàn)前的一天在25溫箱內(nèi)催芽）。為了縮短測(cè)試時(shí)間，在排種培養(yǎng)的前一天，將上述培養(yǎng)好的培養(yǎng)皿、置于34恒溫箱中過夜，以提

10、高砂溫（室溫低時(shí)尤為重要），排種工作在恒溫室中進(jìn)行，然后放在34恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，隔8小時(shí)左右，就可劃道標(biāo)記每一株根尖位置起點(diǎn)，過1416h，對(duì)照根長(zhǎng)30mm左右，即可測(cè)量，求出抑制生長(zhǎng)50的除草劑濃度。 此法對(duì)高粱種子要求嚴(yán)格，雜交高粱種子因生長(zhǎng)勢(shì)不整齊不適于作試材，農(nóng)家品種生長(zhǎng)勢(shì)整齊。可采用。此外，培養(yǎng)皿內(nèi)裝砂量要適合，少了會(huì)使植物材料與藥劑接觸不良，砂多則使植物生長(zhǎng)受阻礙，這都會(huì)影響到測(cè)定結(jié)果的精確性本方法是在Jaworski的黑麥草測(cè)定法啟發(fā)下，由沈陽化工研究院除草劑組建立的。它適宜于測(cè)定一氯代乙酰胺類除草劑，敏感度達(dá)0.01PPm；亦可測(cè)除草醚、五氯酚鈉等除草劑，但敏感度較低。測(cè)定原理是

11、利用稗草中胚軸（從種子到芽鞘節(jié)處的長(zhǎng)度）在黑暗中伸長(zhǎng)的特點(diǎn)，以藥劑抑制中胚軸的長(zhǎng)度來測(cè)定藥劑的活性。 4.稗草胚軸中胚軸法稗草胚軸中胚軸法 將一系列濃度的敵草胺藥液或待測(cè)液50ml注入50ml小燒杯中。每杯投入10顆剛剛露白的稗草籽。為了避免在測(cè)定中可能有個(gè)別幼芽浮起，可以在種子周圍撒一些石英砂，使種子固定。放入恒溫箱中，在2830下黑暗培養(yǎng)，經(jīng)4天后測(cè)定中胚軸的長(zhǎng)度。u建立時(shí)間：1964年由上海植生所建立u適用范圍：用于測(cè)定光合作用抑制劑類除草劑u優(yōu)點(diǎn)：與其他測(cè)定光合作用抑制劑的方法相比，具有操作簡(jiǎn)便、測(cè)定周期短、專一性好等優(yōu)點(diǎn)。5.去胚乳小麥幼苗法去胚乳小麥幼苗法（1）選擇飽滿度一致的小麥

12、種子，浸種2h后，排列在鋪有濾紙或紗布的搪瓷盤中，在室溫20左右進(jìn)行催芽，34d后苗高達(dá)23cm。 (2)精選高度一致的幼苗，輕輕取出；免得傷害根部，然后用鑷子摘除胚乳，再用水漂洗掉附在上面的胚乳成分，準(zhǔn)備種植。去胚乳小麥幼苗法去胚乳小麥幼苗法（3）在直徑4.5cm高5.0cm的小玻璃杯注入不同濃度的供試藥液3ml和稀釋10倍的培養(yǎng)液6ml，每杯播入上述去胚乳小麥幼苗10株。（4）在溫度2126左右和光照下培養(yǎng)67d后觀察藥效。注意每天應(yīng)該給每個(gè)小杯稱重，補(bǔ)足損失的水分。12345CK測(cè)量所有小麥苗的生長(zhǎng)量，即從芽鞘到最長(zhǎng)葉尖的距離，并按下式求出生長(zhǎng)抑制率，繼而求出EC50 對(duì)照生長(zhǎng)量一處理生

13、長(zhǎng)量對(duì)照生長(zhǎng)量一處理生長(zhǎng)量 生長(zhǎng)抑制率（）生長(zhǎng)抑制率（）X 100 對(duì)照生長(zhǎng)量對(duì)照生長(zhǎng)量結(jié)果檢查與計(jì)算結(jié)果檢查與計(jì)算 本法是由南開大學(xué)元素所譚惠芳等建立本法是由南開大學(xué)元素所譚惠芳等建立的。對(duì)測(cè)定觸殺型除草劑較敏感，如百草枯、的。對(duì)測(cè)定觸殺型除草劑較敏感，如百草枯、殺草快、除草醚、敵稗等。另外，對(duì)通過干殺草快、除草醚、敵稗等。另外，對(duì)通過干擾體內(nèi)含氮化合物代謝而殺草的除草劑也很擾體內(nèi)含氮化合物代謝而殺草的除草劑也很敏感，如殺草強(qiáng)、殺草胺，敏感，如殺草強(qiáng)、殺草胺， 2 2，4 4D D， 2 2，4 4，5 5T T、二氯丁酸等。、二氯丁酸等。 6.蘿卜子葉法蘿卜子葉法 將洗凈的水蘿卜種子播種在

14、墊有二層濾紙的大將洗凈的水蘿卜種子播種在墊有二層濾紙的大培養(yǎng)皿內(nèi)，加入適量蒸餾水，加蓋后置培養(yǎng)皿內(nèi)，加入適量蒸餾水，加蓋后置27恒溫恒溫箱黑暗培養(yǎng)約箱黑暗培養(yǎng)約30h后，從幼苗上切下子葉，選擇大后，從幼苗上切下子葉，選擇大小一致的小一致的10片放于墊有一層濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)（皿片放于墊有一層濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)（皿直徑直徑5cm），皿內(nèi)盛有），皿內(nèi)盛有2mm磷酸緩沖液配制的一磷酸緩沖液配制的一系列不同濃度除草劑溶液系列不同濃度除草劑溶液5ml，加蓋置于，加蓋置于25土土l的恒溫室內(nèi)培養(yǎng)，給予的恒溫室內(nèi)培養(yǎng)，給予20003000lx螢光燈連續(xù)螢光燈連續(xù)光照光照3d后，稱子葉鮮重，求出抑制葉片生長(zhǎng)后，稱子葉

15、鮮重，求出抑制葉片生長(zhǎng)50的除草劑濃度，也可測(cè)定葉綠素的含量。的除草劑濃度，也可測(cè)定葉綠素的含量。該法是由沈陽化工研究院建立的，適用于脲類及均三氮苯類光合作用抑制劑的生物測(cè)定方法。對(duì)綠麥隆、利谷隆的敏感度可達(dá)0.025ppm。 7.番茄水培法番茄水培法 首先用盆栽法培養(yǎng)番茄苗，待二片真葉時(shí)，作水培試材用。取30ml試管編號(hào)。將供試藥劑用培養(yǎng)液稀釋成一系列濃度的溶液，每只試管加入10ml。挑選生長(zhǎng)健壯，大小高度一致的番茄苗，將主根及子葉剪掉后插入試管，每管插苗4株（播前稱重，使各管苗重相等）。在光照下25培養(yǎng)2周左右（反應(yīng)速度與光照及溫度有關(guān)），測(cè)定苗的鮮重。培養(yǎng)期間應(yīng)每天補(bǔ)加蒸發(fā)掉的水分。以生

16、長(zhǎng)抑制率來評(píng)價(jià)活性，亦可求出EC50。 和番茄水培法相似的還有燕麥法將土壤和供試藥劑和番茄水培法相似的還有燕麥法將土壤和供試藥劑混合，在大玻璃管內(nèi)裝入混合，在大玻璃管內(nèi)裝入200g土壤（以干土計(jì)），播土壤（以干土計(jì)），播入挑選的燕麥種子，土壤水分保持在入挑選的燕麥種子，土壤水分保持在50左右，自然左右，自然光下培養(yǎng)光下培養(yǎng)2周后，測(cè)量地上部分的鮮重。周后，測(cè)量地上部分的鮮重。 菜豆葉片法土壤內(nèi)混入一定量藥劑，然后播入菜菜豆葉片法土壤內(nèi)混入一定量藥劑，然后播入菜豆種子，土壤含水量豆種子，土壤含水量60左右，自然光下培養(yǎng)，當(dāng)?shù)谧笥遥匀还庀屡囵B(yǎng)，當(dāng)?shù)谝黄貜?fù)葉長(zhǎng)全，第二片又剛剛出現(xiàn)時(shí)，測(cè)量其葉一

17、片三重復(fù)葉長(zhǎng)全，第二片又剛剛出現(xiàn)時(shí)，測(cè)量其葉面積。面積。 Taylor和和Loader，1984年建立了該種方年建立了該種方法，目的是篩選防治野燕麥的除草劑混劑，法，目的是篩選防治野燕麥的除草劑混劑，該法快速、簡(jiǎn)便。該法快速、簡(jiǎn)便。8.葉鞘滴注法葉鞘滴注法具體方法是：當(dāng)正常生長(zhǎng)的燕麥具體方法是：當(dāng)正常生長(zhǎng)的燕麥長(zhǎng)至長(zhǎng)至1個(gè)半葉（即個(gè)半葉（即1葉葉1心）時(shí)，在心）時(shí)，在第一片葉張開的葉鞘里，滴加第一片葉張開的葉鞘里，滴加10ul供試的一定濃度的藥液。供試的一定濃度的藥液。24-28h后，切下根，取上部約后，切下根，取上部約2cm長(zhǎng)長(zhǎng)的一段，插入清水洋菜培養(yǎng)基上。的一段，插入清水洋菜培養(yǎng)基上。再經(jīng)

18、再經(jīng)24h，取出測(cè)量每一劑量處理，取出測(cè)量每一劑量處理的葉片延伸長(zhǎng)度，并以此評(píng)判除的葉片延伸長(zhǎng)度，并以此評(píng)判除草劑活性。草劑活性。本法是Suwunnamek設(shè)計(jì)的，用來測(cè)定內(nèi)吸傳導(dǎo)性且作用緩慢的除草劑，如草甘膦等。該法既可反應(yīng)藥劑的傳導(dǎo)性能，又能反映藥劑對(duì)地下部分再生能力的抑制程度。9.再生苗測(cè)重法再生苗測(cè)重法 用盆栽法種植香附子，等長(zhǎng)成苗后，葉面噴灑一定濃度的草甘膦藥液，一周后剪除香附子苗（離土表1cm），再經(jīng)過一個(gè)月左右測(cè)再生苗的的鮮重。沈陽化工研究院改進(jìn)了此方法，利用玉米做試材。具體方法：將6粒已催芽的玉米種子種在花盆內(nèi)，在3葉期時(shí)噴施草甘膦，24h 后，從第一片玉米葉基部剪去頂端。經(jīng)一定時(shí)間后，測(cè)量再生苗的鮮重或高度。也可在噴藥后不同時(shí)期剪去苗的地上部，測(cè)其是否再生或再生后地上部分的鮮重。五、除草劑田間藥效試驗(yàn)調(diào)查除草劑效果或調(diào)查除草劑增產(chǎn)情況都要堅(jiān)持隨機(jī)取樣，隨機(jī)取樣的方法有五點(diǎn)法，對(duì)角線法、棋盤式取樣法等。生育期施用除草劑，應(yīng)在施藥前13天先調(diào)查一次雜草基數(shù)，作物播前或播后苗前施用除草劑則不進(jìn)行用藥前的雜草基數(shù)調(diào)查。施藥后調(diào)查除草效果應(yīng)根據(jù)除草劑的作用快慢決定調(diào)查時(shí)間，還要根據(jù)除草劑持效長(zhǎng)短作第二次甚至第三次調(diào)查，每?jī)纱握{(diào)查之間相隔715天。調(diào)查點(diǎn)的數(shù)量應(yīng)由小區(qū)面積決定，小區(qū)試驗(yàn)一般每小區(qū)取35點(diǎn)調(diào)查，示范性試驗(yàn)每區(qū)調(diào)查點(diǎn)應(yīng)在5個(gè)