第7章原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細胞雜交

1、植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)Good Morning第第7 7章章 原生質(zhì)體培養(yǎng)與原生質(zhì)體培養(yǎng)與 體細胞雜交體細胞雜交原生質(zhì)體的分離與純化原生質(zhì)體的分離與純化原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體融合第第7章章 原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng) 與和體細胞雜交與和體細胞雜交本章主要內(nèi)容本章主要內(nèi)容(3(3學時學時) )l(1)了解原生質(zhì)體培養(yǎng)的意義；了解原生質(zhì)體培養(yǎng)的意義；l(2)掌握原生質(zhì)體分離的大致步驟；掌握原生質(zhì)體分離的大致步驟；l (3)掌握原生質(zhì)體培養(yǎng)的方法；掌握原生質(zhì)體培養(yǎng)的方法；l(4)掌握原生質(zhì)體融合的方湊。掌握原生質(zhì)體融合的方湊。 第第7章章 原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng) 與和體細胞雜

2、交與和體細胞雜交本章教學目的與要求本章教學目的與要求 原生質(zhì)體（原生質(zhì)體（Protoplast）l含義：含義：去掉細胞壁的由質(zhì)膜包裹、去掉細胞壁的由質(zhì)膜包裹、具有生活力的裸露細胞。具有生活力的裸露細胞。第第7章章 原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng) 與和體細胞雜交與和體細胞雜交微微 絲絲葉綠體葉綠體線粒體線粒體質(zhì)質(zhì) 膜膜細胞核細胞核內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)微微 管管細胞壁細胞壁高爾基體高爾基體第第7章章 原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng) 與和體細胞雜交與和體細胞雜交液液 泡泡第一節(jié)、原生質(zhì)體分離及純化第一節(jié)、原生質(zhì)體分離及純化l一、原生質(zhì)體分離原生質(zhì)體分離雙子葉外植體雙子葉外植體胚性細胞胚性細胞第第7章章 原生質(zhì)體培養(yǎng)原生

3、質(zhì)體培養(yǎng) 與和體細胞雜交與和體細胞雜交l多數(shù)植物分離原生質(zhì)體的經(jīng)典材料多數(shù)植物分離原生質(zhì)體的經(jīng)典材料-葉肉細胞。葉肉細胞。第一節(jié)、原生質(zhì)體分離第一節(jié)、原生質(zhì)體分離 及純化及純化（一）材料來源（一）材料來源l禾本科植物：禾本科植物： 愈傷組織或懸浮細胞。愈傷組織或懸浮細胞。第一節(jié)、原生質(zhì)體分離第一節(jié)、原生質(zhì)體分離 及純化及純化（二）（二） 分離方法分離方法機械分離法機械分離法酶法分離法酶法分離法1、機械分離法（、機械分離法（Machanical isolation）第一節(jié)、原生質(zhì)體分離第一節(jié)、原生質(zhì)體分離 及純化及純化優(yōu)點：優(yōu)點：（1）能排除酶的有害影響能排除酶的有害影響；缺點：缺點：（1）原生

4、質(zhì)體的產(chǎn)量低；原生質(zhì)體的產(chǎn)量低；（2）方法繁瑣費力；）方法繁瑣費力；（3）局限性大）局限性大（1 1）酶的種類）酶的種類l纖維素酶類（纖維素酶類（CellulaseCellulase） l果膠酶類（果膠酶類（PectolyasePectolyase）l半纖維素酶類（半纖維素酶類（HemicellulaseHemicellulase）l崩潰酶崩潰酶l蝸牛酶蝸牛酶2、酶法分離（酶法分離（Enzymatic isolation）第一節(jié)、原生質(zhì)體分離第一節(jié)、原生質(zhì)體分離 及純化及純化（2）酶液的配制第一節(jié)、原生質(zhì)體分離第一節(jié)、原生質(zhì)體分離 及純化及純化滲透壓穩(wěn)定劑滲透壓穩(wěn)定劑及及pH酶的配比及濃酶的配

5、比及濃度度（3 3）分離原生質(zhì)體）分離原生質(zhì)體第一節(jié)、原生質(zhì)體分離第一節(jié)、原生質(zhì)體分離 及純化及純化兩步分離法兩步分離法一步分離法一步分離法方法有二：方法有二：葉肉原生質(zhì)體分離提純?nèi)~肉原生質(zhì)體分離提純圖示原生質(zhì)體分離過程（以葉片為例）圖示原生質(zhì)體分離過程（以葉片為例）第一節(jié)、原生質(zhì)體分離第一節(jié)、原生質(zhì)體分離 及純化及純化過濾、離心過濾、離心加果膠酶加果膠酶和纖維素酶和纖維素酶第一節(jié)、原生質(zhì)體分離第一節(jié)、原生質(zhì)體分離 及純化及純化葉片葉片愈傷組織愈傷組織二、二、 原生質(zhì)體純化與活力測定原生質(zhì)體純化與活力測定（一）原生質(zhì)體純化（一）原生質(zhì)體純化第一節(jié)、原生質(zhì)體分離第一節(jié)、原生質(zhì)體分離 及純化及純化

6、方法三種方法三種離心沉淀法離心沉淀法漂浮法漂浮法界面法界面法1、 離心沉淀法離心沉淀法l原理原理：應用原生質(zhì)體的比重大于溶液，離心后原：應用原生質(zhì)體的比重大于溶液，離心后原生質(zhì)體沉于底部。生質(zhì)體沉于底部。l步驟步驟：l第一步原生質(zhì)體溶液用第一步原生質(zhì)體溶液用400400目網(wǎng)篩過濾。目網(wǎng)篩過濾。l第二步離心（第二步離心（500-1000r/min500-1000r/min，離心，離心5-6min5-6min）。）。l第三步吸去上清液，洗滌液重新懸浮，再離心沉第三步吸去上清液，洗滌液重新懸浮，再離心沉淀。如此淀。如此2-32-3次。次。l第四步用原生質(zhì)體培養(yǎng)液洗第四步用原生質(zhì)體培養(yǎng)液洗1 1次，收

7、集原生質(zhì)體。次，收集原生質(zhì)體。第一節(jié)、原生質(zhì)體分離第一節(jié)、原生質(zhì)體分離 及純化及純化2、漂浮法、漂浮法原理：應用滲透劑含量較高的洗滌液使原生質(zhì)體原理：應用滲透劑含量較高的洗滌液使原生質(zhì)體漂浮在液體的表面。漂浮在液體的表面。l步驟步驟：l第一步：第一步：400400目網(wǎng)篩過濾。目網(wǎng)篩過濾。l第二步：離心。第二步：離心。l第三步：吸去上清液，洗滌液重懸，離心沉淀。第三步：吸去上清液，洗滌液重懸，離心沉淀。2-32-3次。次。l第四步：收集溶液表面原生質(zhì)體，用培養(yǎng)液洗第四步：收集溶液表面原生質(zhì)體，用培養(yǎng)液洗1 1次。次。第一節(jié)、原生質(zhì)體分離第一節(jié)、原生質(zhì)體分離 及純化及純化 3 、 界面法界面法25

8、%蔗糖溶液蔗糖溶液13%甘露醇溶液甘露醇溶液原理：原理：選兩種不同滲透濃度的溶液，其選兩種不同滲透濃度的溶液，其中一種溶液密度大于原生質(zhì)體的密度，中一種溶液密度大于原生質(zhì)體的密度，另一種溶液小于原生質(zhì)體的密度。另一種溶液小于原生質(zhì)體的密度。第一節(jié)、原生質(zhì)體分離第一節(jié)、原生質(zhì)體分離 及純化及純化（二）（二） 原生質(zhì)體活力測定原生質(zhì)體活力測定1、形態(tài)識別：、形態(tài)識別：形態(tài)上完整，呈圓形，含有飽滿的形態(tài)上完整，呈圓形，含有飽滿的細胞質(zhì)，顏色鮮艷的即為存活的原生質(zhì)體。細胞質(zhì)，顏色鮮艷的即為存活的原生質(zhì)體。2、染色識別、染色識別l1 1）0.1%0.1%酚番紅或酚番紅或EvansEvans藍染色：有活力

9、的不被藍染色：有活力的不被染色，死亡的被染上色。染色，死亡的被染上色。l2 2）雙醋酸鹽熒光素）雙醋酸鹽熒光素(FDA)(FDA)染色法：在熒光顯微染色法：在熒光顯微鏡下有熒光的即為有活性的原生質(zhì)體。鏡下有熒光的即為有活性的原生質(zhì)體。第一節(jié)、原生質(zhì)體分離第一節(jié)、原生質(zhì)體分離 及純化及純化第二節(jié)第二節(jié) 原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng)一、培養(yǎng)基一、培養(yǎng)基pH滲透壓滲透壓鈣鎂鈣鎂生長物質(zhì)生長物質(zhì)氮源氮源碳源碳源培養(yǎng)基培養(yǎng)基第第7章章 原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng) 與和體細胞雜交與和體細胞雜交二、培養(yǎng)方法二、培養(yǎng)方法培養(yǎng)方法培養(yǎng)方法液體淺層培養(yǎng)液體淺層培養(yǎng)平板培養(yǎng)法平板培養(yǎng)法雙層培養(yǎng)法雙層培養(yǎng)法飼養(yǎng)層培養(yǎng)法飼養(yǎng)

10、層培養(yǎng)法第二節(jié)、原生質(zhì)體培養(yǎng)第二節(jié)、原生質(zhì)體培養(yǎng)1 1、液體淺層培養(yǎng)、液體淺層培養(yǎng)第二節(jié)、原生質(zhì)體培養(yǎng)第二節(jié)、原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體原生質(zhì)體懸浮液懸浮液1mm厚液體培養(yǎng)基厚液體培養(yǎng)基2x105/ml2、平板培養(yǎng)、平板培養(yǎng) 原生質(zhì)體純化、離心、稀釋后，再與原生質(zhì)體純化、離心、稀釋后，再與1.4%瓊脂或瓊脂糖（瓊脂或瓊脂糖（3737 C C左右）等體積混合成左右）等體積混合成0.7% 0.7% ，培養(yǎng)于培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)于培養(yǎng)皿中。第二節(jié)、原生質(zhì)體培養(yǎng)第二節(jié)、原生質(zhì)體培養(yǎng)3、雙層培養(yǎng)法（固、液培養(yǎng)）、雙層培養(yǎng)法（固、液培養(yǎng)） 培養(yǎng)皿底部鋪一層培養(yǎng)皿底部鋪一層0.7%瓊脂糖的固瓊脂糖的固體培養(yǎng)基，在其上進

11、行原生質(zhì)體淺層培體培養(yǎng)基，在其上進行原生質(zhì)體淺層培養(yǎng)。養(yǎng)。第二節(jié)、原生質(zhì)體培養(yǎng)第二節(jié)、原生質(zhì)體培養(yǎng)固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基4、飼養(yǎng)層培養(yǎng)、飼養(yǎng)層培養(yǎng)方法一：方法一：X-X-射線殺死原生質(zhì)體，與生活射線殺死原生質(zhì)體，與生活力正常的原生質(zhì)體混合，加入力正常的原生質(zhì)體混合，加入0.7%0.7%瓊脂，瓊脂，制成混合液，培養(yǎng)于培養(yǎng)皿中。制成混合液，培養(yǎng)于培養(yǎng)皿中。第二節(jié)、原生質(zhì)體培養(yǎng)第二節(jié)、原生質(zhì)體培養(yǎng)方法二：方法二：X-X-射線殺死原生質(zhì)體，與射線殺死原生質(zhì)體，與0.7%0.7%瓊瓊脂混合，在培養(yǎng)皿中鋪成平板，作為飼養(yǎng)脂混合，在培養(yǎng)皿中鋪成平板，作為飼養(yǎng)層，再將生活力正常的原生質(zhì)體與層，再將生活力正常的原

12、生質(zhì)體與0.7%0.7%瓊瓊脂混合，培養(yǎng)于飼養(yǎng)層上。脂混合，培養(yǎng)于飼養(yǎng)層上。4、飼養(yǎng)層培養(yǎng)、飼養(yǎng)層培養(yǎng)第二節(jié)、原生質(zhì)體培養(yǎng)第二節(jié)、原生質(zhì)體培養(yǎng)第一次分裂第一次分裂第二次分裂第二次分裂第三次分裂第三次分裂多細胞團多細胞團第二節(jié)、原生質(zhì)體培養(yǎng)第二節(jié)、原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體的分裂原生質(zhì)體的分裂肉眼可見細胞團肉眼可見細胞團愈傷組織愈傷組織器官發(fā)生途徑器官發(fā)生途徑胚胎發(fā)生途徑胚胎發(fā)生途徑植株植株第二節(jié)、原生質(zhì)體培養(yǎng)第二節(jié)、原生質(zhì)體培養(yǎng)植株再生途徑植株再生途徑定義：定義：原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體融合也叫做也叫做體細胞雜交體細胞雜交，使分離出來的不同親本的原生質(zhì)體，在人使分離出來的不同親本的原生質(zhì)體，在人工控制條

13、件下，相互融合成一體，形成雜工控制條件下，相互融合成一體，形成雜種細胞，并進一步發(fā)育成雜種植株的技術(shù)。種細胞，并進一步發(fā)育成雜種植株的技術(shù)。第第7章章 原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng) 與和體細胞雜交與和體細胞雜交第三節(jié)、原生質(zhì)體融合第三節(jié)、原生質(zhì)體融合一、原生質(zhì)體融合意義一、原生質(zhì)體融合意義克服雜交不親合克服雜交不親合克服生殖器官敗育克服生殖器官敗育克服柑桔多胚克服柑桔多胚第三節(jié)、原生質(zhì)體融合第三節(jié)、原生質(zhì)體融合番茄+馬鈴薯第三節(jié)、原生質(zhì)體融合第三節(jié)、原生質(zhì)體融合二、融合方法 無機鹽誘導融合無機鹽誘導融合 高高pH-高高Ca離子離子 聚乙二醇聚乙二醇(PEG)法法 PEG結(jié)合高鈣結(jié)合高鈣-高高pH誘

14、導法誘導法 電融合技術(shù)電融合技術(shù)第三節(jié)、原生質(zhì)體融合第三節(jié)、原生質(zhì)體融合(一一)無機鹽誘導融合無機鹽誘導融合: NaNO3法法l1972年：年： Carlson誘導原生質(zhì)體融合獲得誘導原生質(zhì)體融合獲得首例雜種植株粉藍煙草和朗氏煙草體細胞首例雜種植株粉藍煙草和朗氏煙草體細胞雜種。雜種。NaNO3的作用：的作用：中和質(zhì)膜的負電荷，使原中和質(zhì)膜的負電荷，使原生質(zhì)體不再相互排斥，而緊密結(jié)合在一起生質(zhì)體不再相互排斥，而緊密結(jié)合在一起不足：誘導頻率不高。不足：誘導頻率不高。第三節(jié)、原生質(zhì)體融合第三節(jié)、原生質(zhì)體融合 19731973年：年：KellerKeller用用pH10.5pH10.5的的50 mM

15、CaCl50 mM CaCl2 2溶溶液在液在3737時，誘發(fā)煙草葉肉原時，誘發(fā)煙草葉肉原生質(zhì)體融合。生質(zhì)體融合。優(yōu)點：雜種產(chǎn)量高。優(yōu)點：雜種產(chǎn)量高。不足：高不足：高pHpH值對細胞有毒害作用。值對細胞有毒害作用。第三節(jié)、原生質(zhì)體融合第三節(jié)、原生質(zhì)體融合（二）高（二）高pH-高高Ca離子法離子法PEG法法特點：特點：融合頻率高融合頻率高可重復性強可重復性強誘發(fā)融合無特異性誘發(fā)融合無特異性毒性較低毒性較低植物植物+ +植物植物植物植物+ +動物動物動物動物+ +酵母酵母Polyethylene Glycol（聚乙二醇）（聚乙二醇）第三節(jié)、原生質(zhì)體融合第三節(jié)、原生質(zhì)體融合（三）（三）PEG法法PE

16、G法法原理原理PEG是一種帶負電性的高分子化合物，是一種帶負電性的高分子化合物，在原生質(zhì)體融合中起到一種橋梁作用，可以使在原生質(zhì)體融合中起到一種橋梁作用，可以使原生質(zhì)體凝聚。在洗脫過程中，原生質(zhì)體凝聚。在洗脫過程中，PEG將被洗掉，將被洗掉，導致質(zhì)膜表面電荷重排。粘連的質(zhì)膜大面積緊導致質(zhì)膜表面電荷重排。粘連的質(zhì)膜大面積緊密相連，電荷的重排隊導致一個原生質(zhì)體的負密相連，電荷的重排隊導致一個原生質(zhì)體的負性電荷部位與另一原生質(zhì)體的正性電荷部位相性電荷部位與另一原生質(zhì)體的正性電荷部位相連而導致融合。連而導致融合。第三節(jié)、原生質(zhì)體融合第三節(jié)、原生質(zhì)體融合PEGPEG法法示意圖示意圖第三節(jié)、原生質(zhì)體融合第

17、三節(jié)、原生質(zhì)體融合-+-橋梁橋梁+-PEG被洗掉被洗掉+-+-電荷重排電荷重排+-+-+-+-膜接觸膜接觸l最為常用。最為常用。l具體做法具體做法：在無菌條件下混合雙親原生質(zhì)：在無菌條件下混合雙親原生質(zhì)體體-滴加滴加PEGPEG溶液，搖勻，靜置溶液，搖勻，靜置-滴加滴加高鈣高鈣- -高高pHpH溶液，搖勻，靜置溶液，搖勻，靜置-滴加原生滴加原生質(zhì)體培養(yǎng)液洗滌數(shù)次質(zhì)體培養(yǎng)液洗滌數(shù)次-離心獲得原生質(zhì)離心獲得原生質(zhì)體細胞團體細胞團-篩選篩選-再生雜合細胞再生雜合細胞第三節(jié)、原生質(zhì)體融合第三節(jié)、原生質(zhì)體融合（四）（四）PEG結(jié)合高鈣結(jié)合高鈣-高高pH誘導法誘導法(五五)電融合技術(shù)電融合技術(shù)Senda

18、1979年首先用此方法實現(xiàn)原生年首先用此方法實現(xiàn)原生質(zhì)體融合質(zhì)體融合細胞融合儀細胞融合儀第三節(jié)、原生質(zhì)體融合第三節(jié)、原生質(zhì)體融合電融合法原理電融合法原理 交流電場使原生質(zhì)體表面電荷偶極交流電場使原生質(zhì)體表面電荷偶極化，沿著電極排列，形成串珠?；?，沿著電極排列，形成串珠。+-負極負極正極正極+-+-+-+-第三節(jié)、原生質(zhì)體融合第三節(jié)、原生質(zhì)體融合+-+-+-+-施加直流電場后，形成串珠的原生質(zhì)體在質(zhì)施加直流電場后，形成串珠的原生質(zhì)體在質(zhì)膜接觸處發(fā)生穿孔，開始遺傳物質(zhì)的交流。膜接觸處發(fā)生穿孔，開始遺傳物質(zhì)的交流。第三節(jié)、原生質(zhì)體融合第三節(jié)、原生質(zhì)體融合+-+-+-+-+-+-+-+-原生質(zhì)體的融合

19、過程：原生質(zhì)體的融合過程：第三節(jié)、原生質(zhì)體融合第三節(jié)、原生質(zhì)體融合三、體細胞雜種細胞篩選與鑒定三、體細胞雜種細胞篩選與鑒定1 1互補選擇法互補選擇法第三節(jié)、原生質(zhì)體融合第三節(jié)、原生質(zhì)體融合2、機械分離雜種細胞法、機械分離雜種細胞法3. 雙熒光標記選擇法雙熒光標記選擇法異硫氰酸熒光素（異硫氰酸熒光素（FITC）：綠色）：綠色異硫氰酸羅丹明（異硫氰酸羅丹明（RITC）：紅色）：紅色3. 3. 雙熒光標記選擇法雙熒光標記選擇法第三節(jié)、原生質(zhì)體融合第三節(jié)、原生質(zhì)體融合第三節(jié)、原生質(zhì)體融合第三節(jié)、原生質(zhì)體融合四、體細胞雜種植株的鑒定四、體細胞雜種植株的鑒定 形態(tài)學鑒定形態(tài)學鑒定 細胞學觀察細胞學觀察 D

20、NA內(nèi)切圖譜分析內(nèi)切圖譜分析 同工酶分析同工酶分析第三節(jié)、原生質(zhì)體融合第三節(jié)、原生質(zhì)體融合4-1、形態(tài)學鑒定、形態(tài)學鑒定第三節(jié)、原生質(zhì)體融合第三節(jié)、原生質(zhì)體融合4-2、細胞學觀察、細胞學觀察染色體形態(tài)和數(shù)目的比較染色體形態(tài)和數(shù)目的比較18條染色體條染色體36條染色體條染色體第三節(jié)、原生質(zhì)體融合第三節(jié)、原生質(zhì)體融合4-3、 DNA內(nèi)切圖譜分析內(nèi)切圖譜分析RAPD帶型帶型（隨機擴增的多態(tài)性（隨機擴增的多態(tài)性DNA）第三節(jié)、原生質(zhì)體融合第三節(jié)、原生質(zhì)體融合l(1) 原生質(zhì)體培養(yǎng)的意義：原生質(zhì)體培養(yǎng)的意義：(1)再生植株；再生植株； (2)用于遠緣用于遠緣體細胞融合，進行體細胞雜交。體細胞融合，進行體細胞雜交。l(2) 原生質(zhì)體分離方法：機械分離法、酶法分離。原生質(zhì)體分離方法：機械分離法、酶法分離。 l(3)酶的種類及特點酶的種類及特點l(4)原生質(zhì)體的純化方法：離心沉淀法；漂浮法；界面