基因芯片技術(shù)在分枝桿菌菌種鑒定和結(jié)核耐藥性檢測中的應(yīng)用及評價-

1、*通訊作者文章編號:1007-4287(201502-0204-04基因芯片技術(shù)在分枝桿菌菌種鑒定和結(jié)核耐藥性檢測中的應(yīng)用及評價李曉非1,2,梁桂亮2,普冬2,楊冬梅2,趙旻1*(1.武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程系,湖北武漢430071;2.昆明市第三人民醫(yī)院檢驗科,云南昆明650000摘要:目的探討基因芯片技術(shù)在結(jié)核病快速診療中的應(yīng)用價值。方法對抗酸染色涂片陽性的肺結(jié)核患者痰標(biāo)本同時進行基因芯片菌種鑒定和B A C T E C MG I T 960培養(yǎng),對結(jié)核陽性的樣本分別用以上兩種方法檢測利福平和異煙肼的耐藥性。以培養(yǎng)法為參考方法,評價基因芯片法菌種鑒定和耐藥檢測的敏感度、特異度和符合率

2、。采用K a p p a 檢驗分析兩種方法的一致性。結(jié)果656例涂片陽性的患者中,兩種方法各檢出非結(jié)核分枝桿菌21例,符合率為100%。耐藥性檢測發(fā)現(xiàn),基因芯片對利福平的敏感度為87.8%(86/98,特異度為96.0%(410/427,符合率為94.5%(496/525,K a p p a 值為0.84,P >0.05;對異煙肼的敏感度為81.9%(96/116,特異度為91.7%(375/409,符合率為89.5%(470/525,K a p p a 值為0.71,P >0.05;兩種藥物藥敏結(jié)果總符合率為92.0%(966/1050。結(jié)論基因芯片技術(shù)能夠準確地篩選出非結(jié)核分枝

3、桿菌;對利福平和異煙肼耐藥性檢測與培養(yǎng)法有很好的符合率和高度一致性,而且能夠快速、準確地檢測結(jié)核分枝桿菌對利福平和異煙肼的耐藥性,在結(jié)核病的快速診療領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。關(guān)鍵詞:基因芯片;分枝桿菌;結(jié)核;檢測;符合率;利福平;異煙肼中圖分類號:Q 789文獻標(biāo)識碼:AA p p l i c a t i o n e v a l u a t i o n o f G e n e c h i p t e c h n o l o g y i n t h e i d e n t i f i c a t i o n o f M y c o b a c t e r i u m s p e c i e s a

4、 n d d e t e r m i n a t i o n o f a n t i -t u -b e r c u l o s i s d r u g r e s i s t a n c e L I X i a o -f e i 1,2,L I A N G G u i -l i a n g 2,P U D o n g 2,e t a l .(1.D e p a r t m e n t o f B i o m e d i c a l E n g i -n e e r i n g ,B a s i c M e d i c a l C o l l e g e o f W u h a n U n i

5、 v e r s i t y ,W u h a n ,H u b e i 430071,C h i n a ;2.D e p a r t m e n t o f c l i n i c a l l a b o r a -t o r y ,T h e t h i rd pe o p l e 's H o s p i t a l ofK u n m i n g ,K u n m i n g ,Y u n n a n 650000,C h i n a A b s t r a c t :O b j e c t i v e S t u d y o n t h e a p p l i c a t

6、i o n v a l u e o f r a p i d d i a g n o s i s a n d t r e a t m e n t o f t u b e r c u l o s i s w i t h G e n e c h i p t e c h n o l o g y .M e t h o d s M y c o b a c t e r i u m s p e c i e s o f s p u t u m s p e c i m e n s o f t u b e r c u l o s i s (p o s i t i v e a c i d f a s t s t a

7、i n w e r e i d e n t i -f i e d b y G e n e c h i p t e c h n o l o g y a n d w e r e c u l t u r e d b y B A C T E C MG I T 960.D e t e c t i o n o f t u b e r c u l o s i s ?p o s i t i v e s a m p l e s r e -s i s t a n c e t o r i f a m p i n a n d i s o n i a z i d u s i n g G e n e c h i p t

8、e c h n o l o g y a n d c u l t u r e m e t h o d w i t h B A C T E C MG I T 960.C u l t u r e m e t h o d w i t h B A C T E C MG I T 960w a s u s e d a s t h e r e f e r e n c e m e t h o d ,E v a l u a t i o n o f t h e s e n s i t i v i t y ,s p e c i f i c i t y ,c o i n c i -d e n c e r a t e a

9、 n d t h e c o n s i s t e n c y o f t w o m e t h o d s o f G e n e c h i p t e c h n o l o g y i n t h e i d e n t i f i c a t i o n o f M y c o b a c t e r i u m s p e c i e s a n d d r u g r e s i s t a n c e d e t e c t i o n ,R e s u l t s 21n o n -t u b e r c u l o s i s M y c o b a c t e r i

10、 u m w e r e d e t e c t e d b y t h e t w o m e t h o d s i n 656p a t i e n t s w i t h t h e s m e a r -p o s i t i v e t u b e r c u l o s i s ,t h e c o i n c i d e n c e r a t e w a s 100%.T h e s e n s i t i v i t y w a s 87.8%(86/98,t h e s p e c i f i c i t y w a s 96.0%(410/427,t h e c o i

11、 n c i d e n c e r a t e w a s 94.5%(496/525,K a p p a v a l u e 0.84i n t h e g e n e -c h i p d e t e c -t i n g r i f a m a n -r e s i s t a n c e M y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s .T h e s e n s i t i v i t y w a s 81.9%(96/116,t h e s p e c i f i c i t y w a s 91.7%(375/409,t h

12、e c o i n c i d e n c e r a t e w a s 89.5%(470/525,K a p p a v a l u e 0.71i n t h e g e n e -c h i p d e t e c t i n g i s o n i a z i d -r e s i s t a n c e M y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s .C o n c l u s i o n G e n e c h i p t e c h n o l o g y i s a n e f f e c t i v e m e t h

13、 o d f o r a c c u r a t e s c r e e n i n g o f n o n -t u b e r c u -l o s i s M y c o b a c t e r i u m.G e n e c h i p t e c h n o l o g y a n d c u l t u r e m e t h o d w i t h B A C T E C M G I T 960h a d a h i g h c o i n c i d e n c e r a t e a n d h i g h c o n s i s t e n c e i n t h e t

14、w o m e t h o d s d e t e c t i n g r i f a m a n -r e s i s t a n c e a n d i s o n i a z i d -r e s i s t a n c e M y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s .G e n e c h i p t e c h n o l o g y h a s w i d e a p p l i c a t i o n p r o s p e c t i n d i a g n o s i s a n d t r e a t m e n t

15、 o f t u b e r c u l o s i s p a t i e n t s ,a s i t a l l o w s f a s t a n d a c c u r a c y d e -t e c t i o n o f t h e r e s i s t a n c e t o R i f a m p i n a n d I s o n i a z i i n M yc o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s c l i n i c a l i s o l a t e s .K e y w o r d s :G e n e c

16、h i p ;M y c o b a c t e r i u m ;T u b e r c u l o s i s ;D e t e c t i o n ;C o i n c i d e n c e r a t e ;R i f a m p i n ;I s o n i a z i d (C h i n J L a b D i a gn ,2015,19:0204結(jié)核病是一種由結(jié)核分枝桿菌(MT B 感染引起的嚴重危害人類健康和生命的傳染病,是全球主要的公共衛(wèi)生問題之一,也是造成人類死亡最多的疾病之一1。結(jié)核疫情由于疫苗和藥物的使用曾一402C h i n J L a b D i a g n

17、,F e b r u a r y,2015,V o l 19,N o .2度得到較好的控制,但近年來伴隨H I V感染的流行、MT B耐藥菌株的出現(xiàn)以及人口流動的增加,全球疫情又急劇惡化。我國是全球22個結(jié)核病高負擔(dān)國家之一,結(jié)核病人數(shù)位居世界第二位,僅次于印度2。一直以來困擾結(jié)核病防治的難點:一是不能有效地檢出結(jié)核菌,不利對患者的及時正確救治;二是對患者用藥的耐藥情況不能及時檢測,不能做到針對性的聯(lián)合用藥治療。傳統(tǒng)的檢測手段已不能滿足臨床需求。隨著90年代以來生物芯片技術(shù)不斷研究,基因芯片技術(shù)也開始應(yīng)用到分枝桿菌的檢測中3,4。與傳統(tǒng)方法相比,生物芯片技術(shù)具有快速、結(jié)果可靠、重復(fù)性好、通量高

18、、可以在一個反應(yīng)中檢測成千基因表達的特點,為分枝桿菌的實驗室診斷開拓新途徑。為探討基因芯片技術(shù)在結(jié)核病快速診療中的應(yīng)用價值,筆者就我院近期檢測的情況進行以下統(tǒng)計分析。1材料和方法1.1研究對象選擇2013年1月至12月本院結(jié)核科涂陽肺結(jié)核住院患者656例納入觀察。每例患者采集清晨第一口痰2-5m l吐入無菌容器內(nèi)及時送檢,同時進行培養(yǎng)和基因芯片檢測。質(zhì)控菌株購自美國國家菌種保存中心,共18株:結(jié)核分枝桿菌H37R v (A T C C27294、結(jié)核分枝桿菌(A T C C25177、胞內(nèi)分枝桿菌(A T C C13950、鳥分枝桿菌(A T C C25291、龜分枝桿菌(A T C C357

19、52、膿腫分枝桿菌(A T C C19977、戈登分枝桿菌(A T C C14470、偶然分枝桿菌(A T C C6841、不產(chǎn)色分枝桿菌(A T C C19530、堪薩斯分枝桿菌(A T C C12478、淺黃分枝桿菌(A T C C43903、金色分枝桿菌(A T C C19527、瘰疬分枝桿菌(A T C C19981、土地分枝桿菌(A T C C l5755、草分枝桿菌(A T C C11758、潰瘍分枝桿菌(A T C C19423、蟾蜍分枝桿菌(A T C C19250、恥垢分枝桿菌(A T C C19420。1.2儀器和試劑B AC T E CMG I T960結(jié)核培養(yǎng)儀及配套試

20、劑由美國B D公司生產(chǎn);結(jié)核分枝桿菌抗原檢測試劑(膠體金法由杭州創(chuàng)新生物檢驗技術(shù)公司生產(chǎn);基因芯片檢測平臺及配套試劑:為北京博奧生物有限公司研制開發(fā)。1.3方法同一份痰標(biāo)本加入等量0.5%N-乙酰半胱氨酸和氫氧化鈉(N A L C-N a O H前處理液,漩渦振蕩液化15-20m i n,吸取1m1消化液于1.5m l離心管中,用于基因芯片檢測,剩余樣本用于結(jié)核培養(yǎng)。核酸擴增:1m l液化好的痰液轉(zhuǎn)入潔凈離心管中,12 000r p m離心5m i n,棄上清在離心管中加1m l洗液,漩渦振蕩混均后12000r p m離心5m i n,棄上清(洗液為E D T A或生理鹽水,向離心管加入80l

21、 核酸提取液,漩渦振蕩混均后轉(zhuǎn)入核酸提取管中,使用晶芯E x t r a c t o rTM36核酸快速提取振蕩5m i n 將核酸提取管置于95水浴5m i n取出核酸提取管,5000r p m離心1m i n。試劑盒B部分取出“P C R擴增試劑1、2、3”解凍搖勻后分裝18l反應(yīng)體系中加入2l模板溶液,按分枝桿菌菌種鑒定P C R擴增程序進行P C R擴增。雜交:試劑盒B部分中取出“雜交緩沖液”,50熱浴10m i n,P C R產(chǎn)物置于P C R儀中95變性5m i n,隨后立即置于冰水混合物中驟冷冰浴3m i n,取出P C R產(chǎn)物,按照9l雜交緩沖液、6lP C R產(chǎn)物的比例配制雜

22、交混合物,按照雜交盒(兩端底部各加100l蒸餾水、托架、芯片、蓋片順序裝配好雜交反應(yīng)盒,吸取13.5l 雜交混合物經(jīng)加樣孔加入芯片點陣中,蓋好盒蓋并使用金屬封條密封雜交盒,50預(yù)熱B i o M i x e rT M芯片雜交儀20m i n以上,完成后將雜交盒平穩(wěn)放入雜交儀托盤,并注意將3只或6只雜交盒全部放入,以使托盤平衡,運行分枝桿菌菌種鑒定芯片雜交程序,雜交條件為50雜交2h,轉(zhuǎn)速為5r p m。洗干機洗液配制、洗滌和干燥:從試劑盒A部分中取出洗液原液(20×S S C、10%S D S配制洗液依次將20×S S C、蒸餾水、10%S D S按照10882比例加入并混

23、合;洗液將20×S S C、蒸餾水按照199的比例混合。預(yù)熱S l i d e W a s h e rTM8芯片洗干儀,進行洗滌甩干。結(jié)果判讀:開啟掃描儀,運行分枝桿菌菌種鑒定芯片判別系統(tǒng),預(yù)熱激光10m i n。將完成洗滌、甩干的芯片插入掃描儀插槽內(nèi),詳細記錄判讀結(jié)果和芯片信息。使用結(jié)核耐藥檢測芯片判別系統(tǒng)對核酸提取、擴增結(jié)果進行判讀。1.5統(tǒng)計方法采用S P S S17.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,率的比較采用2檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。K a p p a檢驗評價兩種方法檢測結(jié)果的一致性, K a p p a值0.41-0.60具有中度一致性,0.61-0.8具有

24、高度一致性,0.8l-1.0具有最強一致性。2結(jié)果2.1檢測一般情況在所有進行培養(yǎng)的樣本中,有65例培養(yǎng)陰性52中國實驗診斷學(xué)2015年2月第19卷第2期(9.9%,65/656,38例培養(yǎng)污染(5.8%,38/656,分枝桿菌培養(yǎng)陽性并進行結(jié)核分枝桿菌(MT B 與非結(jié)核分枝桿菌(N TM 分群鑒別553例,21例菌種鑒定結(jié)果為N TM (3.8%,21/553,最后獲得可用于分析藥敏結(jié)果者532例。在進行基因芯片檢測的標(biāo)本中,有未檢測到MT B 40例(6.1%,40/656,無法判讀結(jié)果10例(1.5%,10/656,N TM 21例(3.5%,21/606,總計獲得可用于分析基因芯片結(jié)

25、果者585例。綜合培養(yǎng)藥敏結(jié)果和基因芯片結(jié)果,最終有525例患者的檢測結(jié)果進行利福平和異煙肼的藥物敏感性比較。2.2菌種鑒定檢測結(jié)果兩種方法分別檢出N TM 21例,以培養(yǎng)法為參考方法,菌種鑒定的符合率為100%。21例N TM中,胞內(nèi)分枝桿菌5例、鳥分枝桿菌2例、龜分枝桿菌和膿腫分枝桿菌3例、戈登分枝桿菌2例、偶然分枝桿菌1例、不產(chǎn)色分枝桿菌3例、堪薩斯分枝桿菌1例、淺黃分枝桿菌3例、金色分枝桿菌1例,菌種分布達9種。2.3藥物敏感性實驗結(jié)果基因芯片可同時檢測MT B 對利福平和異煙肼的耐藥性。利福平的耐藥性檢測結(jié)果:525例患者有496例基因芯片法與培養(yǎng)法結(jié)果一致。以培養(yǎng)法為參考方法,基因

26、芯片法的符合率為94.5%,敏感度為87.8%;特異度為96.0%。敏感度和特異度比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(2=0.154,P =0.695,見表1。表1基因芯片法和培養(yǎng)法檢測利福平藥物敏感性比較基因芯片MG I T 960耐藥(例敏感(例敏感度(%特異度(%符合率(%耐藥(例861787.896.094.5敏感(例12410異煙肼耐的藥性檢測結(jié)果:525例患者有470例基因芯片法與培養(yǎng)法結(jié)果一致。以培養(yǎng)法為參考方法,基因芯片法的符合率為89.5%,敏感度為81.9%,特異度為91.7%。敏感度和特異度比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(2=0.899,P =0.343,見表2。表2基因芯片法和培養(yǎng)法檢測異

27、煙肼藥物敏感性比較基因芯片MG I T 960敏感度耐藥(例敏感(例敏感度(%特異度(%符合率(%耐藥(例953481.991.789.5敏感(例213753討論B AC T E C MG I T960系統(tǒng)是目前最為理想的快速MT B 培養(yǎng)、鑒定和藥敏試驗檢測系統(tǒng)7,較傳統(tǒng)方法縮短了報告時間,但確診仍需14-28天8,大大影響了臨床的時效性和易用性,導(dǎo)致了治療的不準確和經(jīng)驗性用藥,因此篩選快速、經(jīng)濟、適用性強的技術(shù)進行結(jié)核菌及藥敏的常規(guī)檢測,對早期指導(dǎo)臨床選擇藥物、制定治療方案有重要意義。近年來N TM 感染呈上升趨勢,據(jù)全國流行病學(xué)抽樣調(diào)查結(jié)果顯示,N TM 在分枝桿菌培養(yǎng)陽性標(biāo)本中的比例由

28、1990年的4.9%增加至2000年的11.1%9,2010年增至22.9%10。N TM 與MT B 同屬抗酸桿菌,且臨床特征相似,故極易誤診誤治11,而N TM 對常規(guī)抗結(jié)核藥具有較高的耐藥性12-13,因此,一個有效的方法就是分離鑒定出N TM 菌種。本文656例抗酸染色涂片陽性的患者中,培養(yǎng)法和基因芯片法各檢出非結(jié)核分枝桿菌21例,符合率100%,與何莉等14報道的95.8%接近,說明基因芯片技術(shù)能快速、準確地篩選出非結(jié)核分枝桿菌,將大多數(shù)分枝桿菌鑒定到種,對結(jié)核病的確診有較大幫助。MTB 的耐藥性檢測是結(jié)核病治療的關(guān)鍵,主要有表型檢測法和基因型檢測法兩大類。隨著近年來新的實驗診斷技術(shù)

29、不斷出現(xiàn),基因型檢測法越來越多的應(yīng)用于結(jié)核的藥物敏感實驗7。目前商品化的基因型藥敏檢測技術(shù)主要有G e n e X p e r t 檢測系統(tǒng)、結(jié)核分枝桿菌線性探針技術(shù)及基因芯片技術(shù)等。有文獻報道15,以上方法檢測利福平耐藥性或者利福平和異煙肼的耐藥性均有較高的敏感度和特異度,但G e n e X p e r t 系統(tǒng)只能檢測利福平一種藥物的耐藥性,結(jié)核分枝桿菌線性探針技術(shù)不能進行分枝桿菌的菌種鑒定,因而在結(jié)核病的快速診療方面,基因芯片技術(shù)具有更大的優(yōu)勢。本文基因芯片法對利福平的敏感度87.8%(86/98,特異度96.0%(410/427,與培養(yǎng)法符合率94.5%(496/525,K a p

30、pa 值0.84,P >0.05;對異煙肼的敏感度81.9%(96/116,特異度91.7%(375/409,與培養(yǎng)法符合率89.5%(470/525,K a p pa 值0.71,P >0.05;兩種藥物藥敏結(jié)果總符合率為92.0%(966/1050;與劉厚明等16研究結(jié)果較為接近,說明MT B 耐藥性檢測基因芯片法和培養(yǎng)法結(jié)果高度一致,基因芯片法能準確地檢測MT B 對利福平和異煙肼的耐藥性。綜上所述,基因芯片技術(shù)檢測分枝桿菌以及MTB 對利福平和異煙肼耐藥性方面具有較高的敏602C h i n J L a b D i a g n ,F e b r u a r y,2015,V

31、 o l 19,N o .2感度和特異度,與傳統(tǒng)方法比較,具有快速、靈敏、特異性強等特點,是一種值得推廣的更高效、更快捷、更安全的結(jié)核病的實驗室診斷方法,在結(jié)核病的快速診療領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。作者簡介:李曉非(1971-,女,本科,主任技師,從事傳染病原檢測方面的研究;趙旻(1972-,男,博士學(xué)歷,副研究員,腫瘤和病毒性疾病的分子機制方面的研究。參考文獻:1蘇麗萍,連素琴,李向國,等.武威市結(jié)核病患者膳食多樣化水平及營養(yǎng)素攝入狀況調(diào)查J .現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展,2013,13(33:6566.2W o r l d H e a l t h O r g a n i z a t i o n .A

32、n t i -t u b e r c u l o s i s d r u g r e s i s t a n c e i n t h e w o r l d :f o u r t h g l o b a l r e p o r t .WH O /H TM /T B /2008.G e n e v a :W o r l d H e a l t h O r ga n i z a t i o n ,2008:394.3周珍文.分枝桿菌的實驗室診斷J .中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志,2014,37(3:239.4黃明翔.非結(jié)核分枝桿菌病的實驗室診斷技術(shù)進展J .中國防癆雜志,2013,35(7:538.7胡忠義.

33、結(jié)核病耐藥性檢測技術(shù)進展及存在的問題和對策J .中國防癆雜志,2013,35(11:865.8蘇俊華,梁桂亮,保凌,等.昆明地區(qū)結(jié)核分枝桿菌標(biāo)本培養(yǎng)檢測及耐藥情況分析J .中國防癆雜志,2012,34(1:32.9全國結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查技術(shù)指導(dǎo)組.第四次全國結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報告J .中華結(jié)核和呼吸雜志,2002,25(1:3.10全國結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查技術(shù)指導(dǎo)組,全國結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查辦公室.2010年全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報告J .中國防癆雜志,2012,34:485.11孫勤,沙巍.非結(jié)核分枝桿菌肺病與肺結(jié)核患者的臨床特征對比分析J .中國防癆雜志,2011,30(2:50.12柴華,包訓(xùn)迪.29例非結(jié)核分枝桿菌藥敏實驗分析J .臨床肺科雜志,2012,17(3:564.13齊志強,向延