人類疾病動物模型概述(2016級研究生,2016年9月)

1、人類疾病動物模型概述 中南大學基礎醫(yī)學院病理生理學系肖獻忠一、基本概念一、基本概念1、生物：指一切具有新陳代謝、可生存、生長、繁殖的生命體，包括動物、植物、微生物。2、動物：指多細胞真核生命體，是生物中的一大類群，已知有150多萬種，包括人類。3、實驗動物：是指經(jīng)專門培育、供生物醫(yī)學實驗研究使用的動物，要求來源清楚、遺傳背景明確、微生物受到控制。4、人類疾病動物模型：是指具有人類疾病模擬表現(xiàn)的實驗動物3、基因修飾動物模型（genetically modified animal models) 又稱遺傳工程動物模型，是指通過轉基因、基因敲除、基因敲入、基因敲低等生物工程技術人為改變了動物遺傳性狀

2、的動物模型，是研究人類基因功能、人類疾病及新藥研發(fā)的重要工具，反應生命科學的發(fā)展趨勢，新技術不斷產(chǎn)生，日益受到學術界的重視。 在本講座中將做重點介紹。1、基本病理過程動物模型 指模擬各種基本病理過程的動物模型。 如發(fā)熱、炎癥、休克、DIC、水電解質(zhì)代謝紊亂、酸堿失衡等。（三）、其它分類五、基因修飾動物模型的制備方法及其研究進展五、基因修飾動物模型的制備方法及其研究進展1、轉基因動物模型2、基因敲除動物模型（經(jīng)典方法、條件性敲除）3、基因敲入動物模型4、基因敲低動物模型5、基因修飾技術新進展（ZNF, TALENs, CRISPR/Cas9)1、 轉基因動物（transgenic animal)

3、 模型 三十多年來，轉基因動物技術飛速發(fā)展，轉基因兔、轉基因豬、轉基因牛、轉基因雞、轉基因魚等陸續(xù)育成。轉基因動物技術已廣泛應用于生物學、醫(yī)學、藥學、畜牧學等研究領域。 1 1、顯微注射法、顯微注射法拉針儀煅針儀體視鏡受精卵的采集受精卵的采集受精卵的消化、培養(yǎng)受精卵的消化、培養(yǎng)消化、洗滌后的受精卵消化、洗滌后的受精卵原核清晰的受精卵原核清晰的受精卵注射前注射前注射后注射后（3 3）受精卵的顯微注射）受精卵的顯微注射注射中注射中受精卵的移植受精卵的移植3、胚胎干細胞介導法 （ES細胞法）關鍵步驟ES細胞的分離培養(yǎng)ES細胞基因操作：電穿孔、顯微注射、磷酸鈣-DNA共沉淀、逆轉錄病毒感染等方法 獲取

4、囊胚期胚胎顯微操作：ES細胞注射到囊胚期胚胎內(nèi) 胚胎移植顯微注射法三種轉基因方法優(yōu)缺點比較逆轉錄病毒法逆轉錄病毒法 ESES細胞法細胞法 基因敲除動物（gene knock-out animal) 是指通過同源重組，在細胞中定點敲除某個基因，使之不能表達，并能遺傳給子代的一類動物。結合了基因工程、干細胞工程、生殖工程三大技術的優(yōu)勢，是上世紀80年代發(fā)展起來的受到全球科學家關注的一項新技術。1981年小鼠胚胎干細胞系建立（Evans MJ)； 1985年發(fā)現(xiàn)同源重組（Smithies O)；1989年首個基因敲除小鼠產(chǎn)生（Schwartzberg PL)。主要步驟：基因打靶載體構建、干細胞與生殖

5、工程操作、基因型與表型觀察20072007年獲得諾貝爾生理學或醫(yī)學獎年獲得諾貝爾生理學或醫(yī)學獎Oliver Smithies美國北卡來納大學生化與分子生物學教授，發(fā)現(xiàn)同源重組技術。Mario R. Capecchi美國猶他大學遺傳學教授，發(fā)現(xiàn)同源重組技術。Martin J. Evans英國加的夫大學遺傳學教授，發(fā)現(xiàn)胚胎干細胞建系、培養(yǎng)、操作等技術?；虼虬休d體的構建基因打靶載體的構建HSF1基因打靶載體構建示意圖基因打靶載體構建示意圖胚胎干細胞胚胎干細胞（ES) )與胚胎操作與胚胎操作基因型與表型的觀察基因型與表型的觀察FEMALE MALE+/+ -/- +/+ -/-3. HSF13. H

6、SF1基因敲除基因敲除Xiao XZ, et al. EMBO J, 18(21): 5943-52.1999條件性基因敲除（條件性基因敲除（conditional gene knockout) 條件性基因敲除主要通過Cre/loxP或者Ftp/FRT重組系統(tǒng)來實現(xiàn)。Cre/loxP系統(tǒng) Cre/loxP系統(tǒng)來源于F1噬菌體，可以介導位點特異的DNA重組。該系統(tǒng)含有兩種成分：一段長34bp的DNA序列，含有兩個13 bp的反向重復序列和一個8 bp的核心序列，稱為loxP位點；Cre重組酶，它是一種由343個氨基酸組成的單體蛋白，可以引發(fā)loxP位點的DNA重組。當一段DNA序列位于兩個lox

7、P位點之間的時候，在Cre重組酶的作用下，這段序列可被刪除(當兩個loxP位點的方向相同)，或者方向發(fā)生倒轉(當兩個loxP位點的方向相反)。 利用Cre/loxP系統(tǒng)進行條件性基因敲除，需要兩只轉基因小鼠。第一只小鼠通過同源重組技術將loxP位點分別置于目的基因的兩端；第二只是轉基因小鼠，將Cre重組酶置于某特定基因啟動子的調(diào)控之下，可以使其在某特定組織或誘導物存在的條件下表達。最后，讓這兩只小鼠進行交配，所產(chǎn)生的同時含有上述兩種基因型的子代小鼠就會在某一特定類型的組織細胞或在誘導物作用下缺失某特定基因。Cre/loxP系統(tǒng)的作用機制3、基因敲入動物、基因敲入動物（gene knockin

8、animal) 即通過同源重組技術將外源基因定點整合到宿主基因組中，且拷貝數(shù)確定，解決了傳統(tǒng)轉基因動物制備中隨機整合、拷貝數(shù)不定的缺陷。4、基因敲低動物、基因敲低動物(gene knock-down animal) 即表達RNAi的轉基因動物。通過隨機或定點敲入的方式將某種siRNA基因整合至基因組，利用RNAi機制調(diào)低動物中某種基因的表達水平。與基因敲除動物相比，制備更為簡單、快速、經(jīng)濟。經(jīng)典方法 ：經(jīng)典的基因敲除技術：經(jīng)典的基因敲除技術：由細胞自身進行隨機雙鏈斷裂和同源重組，發(fā)生幾率低(1/106 cells），再靠正負篩選來獲得同源重組細胞?；蛐揎椥录夹g：基因修飾新技術： 采用特異的D

9、NA識別域 + 核酸酶，在特定的DNA位點切斷DNA，形成雙鏈斷裂，大大改善了同源重組的效率，實現(xiàn)對基因組進行更加精確、有效的改造。實現(xiàn)染色體DNA序列的人工編輯修改u點突變：Silent，Missense，Nonsense，F(xiàn)rame shift（基因敲除）u片段刪除u片段插入目的與用途：疾病模型制備、基因功能研究、基因治療等基因修飾新技術解決傳統(tǒng)的挑戰(zhàn)基因修飾新技術解決傳統(tǒng)的挑戰(zhàn)（1）ZFN 技術技術鋅指核酸酶（Zinc-finger nucleases, ZFN）是人工改造的限制性核酸內(nèi)切酶，利用不同的鋅指結構識別特異DNA序列，利用核酸酶切斷靶DNA。鋅指結構中的兩個半胱氨酸可與另兩個

10、半胱氨酸（C）或組氨酸（H）一起與鋅離子絡合而形成指狀結構，每一個指狀結構可特異識別3-4個堿基；人工設計識別特異DNA序列的鋅指結構采用如上的通用序列，通過改變其中7個X來實現(xiàn)識別不同的三聯(lián)體堿基，TGEK是多個螺旋間的連接序列；構建成對人工鋅指結構域和FokI融合蛋白（ZFN）可以在指定區(qū)域切斷DNA雙鏈。鋅指核酸酶介導的定向染色體刪除研究人員可以利用ZFN技術進行各種基因編輯，比如基因敲除。已建立有ZFN庫，識別多種DNA序列，但還不能達到識別任意靶DNA的目的，其應用受到一定的限制。概念：概念：轉錄激活子樣效應子核酸酶(transcription activator-like effe

11、ctor nucleases，TALENs)。最初在植物病原體黃單胞菌屬中發(fā)現(xiàn)，即某些多肽能特異性結合到宿主基因的某個位點從而激活該宿主基因的表達 。與ZFNs相比，TALENs 的DNA識別序列更長，故脫靶效應的幾率較小，現(xiàn)已應用于細胞、酵母、斑馬魚、大鼠、小鼠等各類研究對象。技術原理：技術原理：表達一個重組核酸酶，在靶點識別結構域的作用下，核酸酶發(fā)揮內(nèi)切酶活性，從而打斷目標基因，完成基因敲除的過程。N-天冬酰胺天冬酰胺; I-異亮氨酸異亮氨酸; H-組氨酸組氨酸; D-天冬氨酸天冬氨酸; G-甘氨酸甘氨酸102堿基模塊單元 14 18個重復真核表達 14 18個重復特異識別指定的14 -1

12、8 個核酸序列并與之結合34氨基酸單元TALEN (TALE+FOK I) 表達質(zhì)粒表達質(zhì)粒對構建對構建 TALEN 基因敲除X 2TALEN 表達質(zhì)粒對的轉染、表達表達質(zhì)粒對的轉染、表達和靶位點切割和靶位點切割雙鏈斷裂誘發(fā)雙鏈斷裂誘發(fā)DNA損傷修復機制損傷修復機制（nonhomologous end-joining，NHEJ）。由于在此修過程中總是由于在此修過程中總是有一定的錯誤率存在。在修復中發(fā)有一定的錯誤率存在。在修復中發(fā)生移碼突變的個體即形成目標基因生移碼突變的個體即形成目標基因敲除突變體敲除突變體TALEN介導的同源重組介導的同源重組同源重組發(fā)生率升高幾個數(shù)量級同源重組發(fā)生率升高幾個

13、數(shù)量級Donor plasmidHRDonor plasmidDonor plasmid基因敲入Right armLeft arm片段刪除Right armLeft arm點突變2011年8月， Nature Biotechnology 上同時發(fā)表了用TALEN 技術進行基因敲除的4篇研究文章，另加一篇綜述。u 一篇人類干細胞 Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases u 一篇大鼠Knockout rats generated by embryo microinjection of TALENs u

14、兩篇斑馬魚 Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENsu 一篇綜述Move over ZFNTALEN技術新進展技術新進展X 2X 2X 2 TAL的核酸識別單元為34aa模塊中的雙連氨基酸（RVD） RVD與A、G、C、T有恒定的對應關系，即NI識別A，NG識別T，HD識別C，NN識別G，非常簡單明確 欲使TALEN特異識別某一核酸序列（靶點），只須按照靶點序列將

15、相應TAL單元（14 -18個）串聯(lián)克隆即可。TALE識別模塊串聯(lián)構建具專利保護的克隆構建系統(tǒng)具專利保護的克隆構建系統(tǒng)步驟一：靶點識別單元串聯(lián)步驟二：TALEN表達質(zhì)粒構建將靶點識別模塊克隆入真核表達載體，得到將靶點識別模塊克隆入真核表達載體，得到Talen質(zhì)粒對質(zhì)粒對 靶點識別模塊串接成功后需克隆入真核表達載體中。此真核表達載體含有TAL的其它必需結構域并在C端融合有FokI序列。 目前，TALEN系統(tǒng)利用FokI的內(nèi)切酶活性打斷目標基因。因FokI需形成2聚體方能發(fā)揮活性，在實際操作中需在目標基因中選擇兩處相鄰（間隔17堿基）的靶序列（14 - 18個堿基）分別進行TAL識別模塊構建。X

16、2真核表達TALEN質(zhì)粒對TALEN質(zhì)粒對共轉入細胞后，其表達的融合蛋白即可分別找到其DNA靶位點并與靶位點特異結合。此時，兩個TALEN融合蛋白中的FokI功能域形成二聚體，發(fā)揮非特異性內(nèi)切酶活性，于兩個靶位點之間打斷目標基因。步驟三步驟三. . 將將TALENTALEN質(zhì)粒對共轉入細胞中實現(xiàn)靶基因敲除質(zhì)粒對共轉入細胞中實現(xiàn)靶基因敲除內(nèi)切酶的切割誘發(fā)DNA損傷修復機制（nonhomologous end-joining，NHEJ）。由于在此修過程中總是有一定的錯誤率存在。在修復中發(fā)生移碼突變錯誤的個體即形成目標基因敲除突變體。突變體形成突變體形成PCR 酶切法酶切法 利用靶點設計時挑選的，位

17、于相鄰靶位點之間的特異性內(nèi)切酶位點，進行PCR產(chǎn)物酶切鑒定。 經(jīng)驗規(guī)律：= 2%可用，=10%很好熒光素酶檢測法熒光素酶檢測法 （按試劑盒說明書操作）（按試劑盒說明書操作） 有限稀釋法獲得單細胞克隆 PCR-酶切法鑒定 PCR測序確認（3）CRISPR/Cas9 技術技術CRISPR/Cas9系統(tǒng)最初是在細菌體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的，是細菌用來識別和摧毀噬菌體、病毒等病原體入侵的防御系統(tǒng)，近年來經(jīng)科學家改造成一種新的基因組編輯技術，即一種來源于細菌獲得性免疫的由RNA指導的Cas蛋白對靶基因進行修飾的技術，被科學雜志列為2013年年度十大科技進展之一。CRISPR規(guī)律成簇間隔短回文重復序列（clustere

18、d regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR）CasCRISPR相關蛋白（CRISPR-associated protein, Cas）crRNA來源于CRISPR 的RNA（CRISPR-derived RNA，crRNA)tracrRNA反式激活RNA (trans-activating RNA, tracrRNA)sgRNA單向導RNA(single guide RNA, sgRNA)，將crRNA 和tracrRNA兩種向導RNA融合在一起形成PAM（protospacer-adjacent motif）即原型間隔序

19、列鄰近基序，為即原型間隔序列鄰近基序，為NGGBiotechnology: Rewriting a genome，Nature 495, 5051 在CRISPR/Cas9系統(tǒng)中，由Cas9核酸酶在DNA靶位點上進行切割。首先，crRNA的RNA分子中的一部分序列與tracrRNA分子通過堿基配對結合在一起，形成嵌合RNA(tracrRNA/crRNA)，然后，crRNA的另一部分序列與靶DNA位點進行堿基配對，這種嵌合RNA能夠引導Cas9結合到這個靶位點上并進行切割。CRISPR-Cas9 技術原理示意圖技術原理示意圖CRISPR-Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)CRISPR-Cas是很多細菌和

20、大部分古生菌的天然免疫系統(tǒng)，通過對入侵的病毒和核酸進行特異性的識別，利用Cas蛋白進行切割，從而達到對自身的免疫。1987年，日本大阪大學（Osaka University）在對一種細菌編碼的堿性磷酸酶（alkaline phosphatase）基因進行研究時，發(fā)現(xiàn)在這個基因編碼區(qū)域的附近存在一段由簡單的重復序列組成的不同尋常的DNA片段。這些重復序列編碼的RNA能識別并切除外源噬菌體、質(zhì)粒DNA序列，達到防御免疫的作用。CRISPR-Cas系統(tǒng)在細菌防御免疫中的作用系統(tǒng)在細菌防御免疫中的作用CRISPR-Cas系統(tǒng)在細菌防御免疫中的作用系統(tǒng)在細菌防御免疫中的作用CRISPR-Cas系統(tǒng)賦予原

21、核細胞針對外源DNA特異性免疫, 而這種特異性是由間隔序列（spacer）決定的。在宿主防御噬菌體攻擊中，針對自然界中龐大的噬菌體種群，細菌進化了CRISPR 介導的適應性免疫。這種免疫功能的發(fā)揮是由CRISPR 間隔序列的動態(tài)性變化，即通過增加或刪除間隔序列（spacer）來實現(xiàn)的。2013以后，研究者們在包括science和nature biotechnology等著名雜志上發(fā)表多篇文章，采用CRISPR-Cas系統(tǒng)，在人類、小鼠、斑馬魚等物種上實現(xiàn)精確的基因修飾。將細菌的特異性免疫系統(tǒng)改造為新的基因修飾系統(tǒng)將細菌的特異性免疫系統(tǒng)改造為新的基因修飾系統(tǒng)CRISPR-Cas主要由兩部分組成：

22、主要由兩部分組成：識別識別切割切割CRISPR-Cas的結構的結構CRISPR結構結構 規(guī)律成簇間隔短回文重復序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats， CRISPR）是一個特殊的DNA重復序列家族, 廣泛分布于細菌和古細菌基因組中。CRISPR 位點通常由短的高度保守的重復序列(repeats) 組成, 重復序列的長度通常 2148 bp, 重復序列之間被 2672 bp 間隔序列(spacer)隔開。CRISPR就是通過這些間隔序列（space）與靶基因進行識別。CRISPR結構結構Cas家族家族Cas（CRI

23、SPR associated protein），存在于CRISPR位點附近，是一種雙鏈DNA核酸酶，能在guide RNA引導下對靶位點進行切割。它與folk酶功能類似，但是它并不需要形成二聚體才能發(fā)揮作用。CRISPR-Cas系統(tǒng)靶向要求系統(tǒng)靶向要求最主要的要求：最主要的要求：PAM（protospacer-adjacent motif）即原型間隔序列鄰近基序，為即原型間隔序列鄰近基序，為NGG。CRISPR-Cas系統(tǒng)靶向要求系統(tǒng)靶向要求 在人類基因組中，平均每在人類基因組中，平均每8bp就出現(xiàn)一個就出現(xiàn)一個NGG PAM。CRISPR-Cas系統(tǒng)靶向要求系統(tǒng)靶向要求CRISPR-Cas系

24、統(tǒng)介導基因修飾系統(tǒng)介導基因修飾sg-RNA：Cas介導基因修飾介導基因修飾 2013年年1月月29日在日在nature biotechnology上發(fā)表的上發(fā)表的efficient genome editing in zebra fish using a CRISPR-Cas system一文中，作者利用人工合成一文中，作者利用人工合成的的sgRNAs指導指導Cas9內(nèi)源性核酸酶對斑馬魚胚胎基因進行修飾。內(nèi)源性核酸酶對斑馬魚胚胎基因進行修飾。sg-RNA：Cas介導基因修飾介導基因修飾CRISPR-Cas系統(tǒng)前景分析系統(tǒng)前景分析 2013年年4月月12日在日在cell stem cell上發(fā)表的上發(fā)表的Enhanced Efficiency of Human Pluripotent Stem Cell Genome Editing through Replacing TALENs with CRISPRs一文中，作者利用一文中，作者利用TALENs和和CRISPRs對同對同一基因進行修飾，效率分別為一基因進行修飾，效率分別為0%-34%和和51%-79%。 2013年年2月月15日在日在science上發(fā)表的上發(fā)表的Multiplex Genome Engineering Us