各種培養(yǎng)基的配置及注意事1

1、各種培養(yǎng)基的配置及注意事項6-BA配置：配置時要加入少量稀酸或97%酒精，再加入蒸餾水，可適當加熱。IBA配置：配置時要加入少量稀堿，再加入蒸餾水。注意：配這兩種溶液時，若直接加蒸餾水，則不溶。（注：溶解生長素時，可用少量0.51N的NaOH或95%酒精溶解；溶解分裂素類用0.51N的HCl加熱溶解，如再加蒸餾水，易產(chǎn)生白色沉淀，此時再加熱水。）母液配置：母液配置量藥品名稱稱取量倍數(shù)母液1250mlNH4NO3KH2PO441.5g4.25g100×母液1250mlKNO3CaCl2.2H2O47.5g11g100×母液1250mlMgSO4.7H2O9.25g100

2、15;母液2500mlMnSO4.H2OZnSO4.7H2OCaCl2.6H2OCuSO4.5H2ONa2MoO4KIH3BO3535mg215mg0.625mg0.625mg6.25mg20.75mg155mg500×母液3250mlNa2.EDTAFeSO4.7H2O932.5mg695mg100×母液4500ml煙酸VB6VB1肌醇甘氨酸12.5mg12.5mg2.5mg2.5g50mg1000×MS固體培養(yǎng)基：以配1LMS固體培養(yǎng)基為準： MS固體干粉 41.5g蒸餾水 1L2g/l的6-BA 2.5ml2g/l的IBA 0.25ml注意：待溶液配好后，用

3、pH計將溶液的pH值調到5.8 6.0，煮沸至均勻無沉淀后，分裝20小瓶（即50mL/瓶），滅菌之前蓋子不要擰太緊，出鍋后再擰緊蓋子。MS液體培養(yǎng)基：以配1LMS液體培養(yǎng)基為準：母液1 5ml母液1 10ml母液1 5ml母液2 1ml母液3 5ml母液4 1ml2g/l的6-BA 0.5ml2g/l的IBA 0.1ml蔗糖 30g注意：待溶液在燒杯中混勻之后，轉移到1000ml的容量瓶中定容。LB液體培養(yǎng)基：以配1LLB液體培養(yǎng)基為準：蛋白胨（TRYPTONE） 10g酵母提取液（YEASTExTrACT） 5gNaCl 10g 注意：粉末在燒杯中溶解完全之后，轉移到1000ml的容量瓶中定

4、容。待滅菌結束后，溫度降至55左右（不燙手）時，加入Kana(50mg/L)1000Ul(在超凈臺內進行)。LB固體培養(yǎng)基：以配1LLB固體培養(yǎng)基為準：蛋白胨（TRYPTONE） 10g酵母提取液（YEASTExTrACT） 5gNaCl 10g瓊脂粉 15g注意：粉末在燒杯中溶解完全之后，轉移到1000ml的容量瓶中定容。待滅菌結束后，溫度降至55左右（不燙手）時，加入Kana(50mg/L)1000Ul(在超凈臺內進行)。 在進行到平板。組織培養(yǎng)體系的建立外植體獲得具體操作：1 將外植體（用鑷子）夾到其中一個空培養(yǎng)罐中2 倒入75%的酒精消毒30S，重復三次。3 倒入升汞消毒4min，一次

5、。4 倒入蒸餾水清洗，重復三次。5 蓋上蓋子，備用。6 點燃酒精燈，在另一只空的培養(yǎng)罐中倒入些75%的酒精（用于鐵制儀器消毒）。7 將鐵架子在酒精燈上進行消毒，鑷子和手術刀浸入培養(yǎng)罐中，然后放在酒精燈上灼燒，起殺菌作用。8 用鑷子夾住一培養(yǎng)皿在酒精燈上稍微燙下，滅菌。9 在培養(yǎng)皿中倒入少量的蒸餾水。10 用經(jīng)冷卻的鑷子將外植體夾到帶少量蒸餾水的培養(yǎng)皿中，用刀切取其腋芽，將腋芽外的殼小心剝去，再在腋芽的尖端切一刀，使其暴露生長點。11 打開培養(yǎng)基瓶子之前在酒精燈上稍微燙下，打開瓶蓋后，瓶口在酒精燈上灼燒下，以防污染。12 用鑷子將腋芽植入培養(yǎng)基中，瓶口灼燒下，旋緊蓋子。注意：鑷子和手術刀要經(jīng)常灼

6、燒，必要時可將鑷子和刀柄進行高壓滅菌，以防污染。1) 組織培養(yǎng)誘導芽再生 具體操作：1. 點燃酒精燈，從裝有酒精的培養(yǎng)罐中拿出刀和鑷子在酒精燈上灼燒。2. 用鑷子夾住一培養(yǎng)皿在酒精燈上稍微燙下，滅菌。3. 待刀和鑷子冷卻后，從一培養(yǎng)瓶中取出芽叢放在準備好的培養(yǎng)皿上。4. 用刀切取其嫩芽，并把老芽切短。5. 將嫩芽植入培養(yǎng)基中，通常是每瓶培養(yǎng)瓶中接6顆老芽或7顆嫩芽。注意點同上。2) 組織培養(yǎng)誘導根再生具體操作和注意點同上，不同是此過程只需要用到健壯的幼芽。3) 植物移栽、馴化具體操作：1. 從瓶中取出竹苗，洗凈培養(yǎng)基，2. 寄栽于育苗箱的基質上(珍珠巖砂壤土=11)，澆足定根水，定期噴灑營養(yǎng)液

7、（MS培養(yǎng)液），3. 用塑料膜調節(jié)溫度、濕度和光照，4. 統(tǒng)計成活率及竹苗生長狀況，待新發(fā)健壯根系后移往大棚。轉基因體系的建立農(nóng)桿菌培養(yǎng)具體操作：1. 挑取攜帶植物表達載體質粒的農(nóng)桿菌單菌落。2. 接種在50mg/LKana 的 LB 液體培養(yǎng)基中，28，160rpm 振蕩培養(yǎng)過夜。3. 活化過夜的農(nóng)桿菌按 1:50 的比例接種在相同的LB液體培養(yǎng)基中。4. 繼續(xù)培養(yǎng)至對數(shù)生長期至OD=0.30.6，測量時使用波長為600nm，準備感染用。 農(nóng)桿菌浸染預培養(yǎng)材料具體操作：1.5000rpm離心 20min，收集菌體。2.用 1/2MS液體培養(yǎng)基（含有50mg/L乙酰丁香酮）懸浮準備感染用。3.

8、將事先培養(yǎng)好的蘆竹嫩芽浸入含有農(nóng)桿菌菌液的液體MS液體培養(yǎng)基中。4.感染20min30min，取出蘆竹嫩芽用無菌濾紙吸去附著的菌液。共培養(yǎng)具體操作：將浸染過的蘆竹嫩芽接種在含有50mg/L乙酰丁香酮（AS）的固體MS培養(yǎng)基上，進行共培養(yǎng)。去除農(nóng)桿菌具體操作：5. 若干天后，將蘆竹從培養(yǎng)基中取出放入無菌水中沖洗，直至無菌水澄清。6. 再將蘆竹加到500mg/L羧芐青霉素（Carb）的液體MS培養(yǎng)基，洗5-10min。7. 取出蘆竹嫩芽用無菌濾紙吸去附著的液體。8. 將蘆竹接到500mg/L羧芐青霉素(Carb)和10mg/L潮霉素（Hygr）固體MS培養(yǎng)基上。培養(yǎng)具體操作：1.數(shù)天后，將蘆竹從5

9、00mg/L羧芐青霉素和10mg/L潮霉素固體MS培養(yǎng)中取出。2.將其轉接到只含有激素的固體MS培養(yǎng)基中中去。選擇具體操作： 通過觀察，選擇出抗性芽。根誘導及植株再生9. 待培養(yǎng)篩選的抗性芽長至 11.5cm 時。10. 切下并轉入含有500mg/L羧芐青霉素和10mg/L潮霉素的生根培養(yǎng)基上誘導生根。11. 獲得具有潮霉素素抗性的轉基因植株。鑒定 PCR, Southern blot 分析基本按照 Sam brook 等的方法。植物DNA 經(jīng) Eco R I 或 H ind B am H I 酶切后, 在018% 瓊脂糖凝膠上電泳過夜.電泳緩沖液為 1×TA E。DNA 片段分離開

10、后通過毛細作用轉移緩沖液為 10×SSC。Southern N分子雜交所用探針為 H ind B am H I 酶切 pROA 93 產(chǎn)生的 1 kb 片段, 此片段為N PT基因的一段編碼順序。 生物鑒定將蘆竹放入含有磷的水中通過鑒定水中磷含量的變化來測定蘆竹的聚磷效果。配置各種不同濃度培養(yǎng)基：IBA6-BA00ml0.10.002ml0.50.01ml10.02ml20.04ml50.1ml100.2ml0 0ml 0.1 0.002ml0.2 0.004ml0.5 0.01ml1 0.02ml2 0.04ml注：表格中分別表示的是6-BA與IBA之間的比值，以及每一瓶（即每瓶4

11、0ml）培養(yǎng)基中所要加的激素的量。羧芐青霉素（Carb）和 潮霉素（Hygr）的配制：羧芐青霉素（Carb）的作用：殺菌，殺死植株體外的農(nóng)桿菌。潮霉素（Hygr）的作用：選擇性，殺死體內沒有農(nóng)桿菌侵入的植株。1. 稱取固體粉末。2. 可用蒸餾水配置。3. 定容。4. 在超凈臺內用濾膜過濾，并將其分裝入EP管中，用封口膜封口，放于20下冷藏，備用。Kana的配置：卡那霉素的作用：篩選出抗性株。1. 先計算出所要配置的溶液濃度。2. 稱好Kana，用蒸餾水溶解，然后定容。3. 在操凈臺上用濾膜過濾，并將其分裝入EP管中并放于20下冷藏。乙酰丁香酮（AS）的配置：乙酰丁香酮的作用：加速農(nóng)桿菌侵染植株

12、。1稱取固體粉末。2先用甲醇或二甲基亞砜溶解，后加蒸餾水配置。3定容。4在操凈臺上用濾膜過濾，并將其分裝入EP管中并放于20下冷藏。注意：如果用甲醇配置時需加熱。加Kana的MS培養(yǎng)基配置方法：1. 先配好培養(yǎng)基。2. 分裝入培養(yǎng)瓶中，每個培養(yǎng)瓶中加40ml培養(yǎng)基。3. 培養(yǎng)基進行高壓滅菌。4. 滅好菌后，等到溫度降到5060到操凈臺上加Kana。5. 事先算好每瓶所要加的抗生素的量。6. 在加抗生素的過程中，速度要快，防止培養(yǎng)基凝固而影響實驗的結果。關于PCR：1. 引物（VP-6-F-1，VP-6-R-1）稀釋于TE（10mMTris-HCl PH8.0，1mMEDTA）溶液中，并于20儲

13、存。2，PCR反應液配置：從冰上將以下各成分加入PCR反應管中模板DNA 1ulPrimer1（20um） 1ulPrimer2（20um） 1uldNTPs(10mMeach) 1ul10×Taq Buffer 5ulTaq DNA polymerase 1uldiH2O（無菌水） 補充至50ul注意： 模板DNA分為1/1000,1/100大腸桿菌懸液以及空白對照；2 dNTPs A、T、G、C各加10ul，再加入360uldiH2O；3 反應管中溶液由多至少加入，TaqDNA polymerase最后加入。3.手指輕彈反應管，使其混勻，簡短離心，迅速放入PCR.4.PCR反應循

14、環(huán)設置 T=94 2min30個循環(huán) T=94 40S T=52 1min T=72 2.5minT=72 7min關于制膠和跑膠：5. 制膠：瓊脂糖1g溶于100ml水中，再加入100ulEB，融三次倒膠再加梳子。6. 跑膠：EB母液25mg/ml 放置于冰箱中儲存液0.5mg/ml 需避光保存使用液0.5mg/ml 加入膠中使用7. 跑電泳：電壓120V。電流自己調節(jié)，電流不斷升高，知道設備部叫為止；若還不行則降低電壓。注意：制膠于跑膠半個小時前進行。關于儀器使用PH計的使用方法：1. 調試：打開開關，溫度計測緩沖溶液的溫度，按溫度按鈕調節(jié)溫度與溫度計顯示相同，先pH計放入定位緩沖液中，待

15、讀數(shù)穩(wěn)定后，按定位鍵（pH燈光閃爍），調到6.86，按確定鍵，即可。用蒸餾水清洗干凈pH計，再將pH計放入斜率緩沖液中，待讀數(shù)穩(wěn)定后，按斜率鍵（pH燈），調到4.00，按確定鍵，調試完成。2. 使用：調試完成后，先用溫度計測量待測溶液的溫度，按溫度鍵，調節(jié)溫度至溫度計顯示的度數(shù)，按確定鍵，用蒸餾水清洗pH計后，把pH計放入待測溶液中，調節(jié)pH到所需pH值，即可。3. 注意：使用前后都要用蒸餾水清洗pH計；不用時，要保持pH計筆頭濕潤，在筆套里放一定量的KCl外參比補充液。分光光度計使用方法：（主要用于測量農(nóng)桿菌液的OD值，使用波長為600nm）打開開關，轉動波長轉鈕至所需波長，按MODE至T燈亮，按“0%T”，度數(shù)顯示為000.0，放入待測溶液，蓋蓋，拉動拉環(huán)至參考溶液管，按“100%T”，度數(shù)顯示為100.0，按MODE至ABS燈亮，