肺炎鏈球菌檢測方法及耐藥研究

1、肺炎鏈球菌檢測方法及耐藥研究     1  SP檢測方法 1.1 細(xì)菌培養(yǎng)    在臨床 實(shí)踐 中，對社區(qū)獲得性肺炎患者通過應(yīng)用常規(guī)的檢測方法來確定病原菌仍存在許多障礙。從血液或胸腔積液培養(yǎng)分離獲得SP仍然作為診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但它的陽性率僅10%30%，甚至更低2。SP可定植于健康人群的鼻咽部及不充足或不恰當(dāng)?shù)奶禈?biāo)本使得基于痰培養(yǎng)的診斷標(biāo)準(zhǔn)飽受爭議。此外，近1/3的患者進(jìn)行病原學(xué)檢測前已接受了抗生素治療，這又降低了這種傳統(tǒng)的檢測手段的敏感性。若通過一些創(chuàng)傷性操作所獲得的標(biāo)本（如支氣管灌洗液、肺穿刺獲得的肺 組織 等）

2、培養(yǎng)分離得到SP，則對病原學(xué)的診斷具有決定性意義。但是，由于創(chuàng)傷性技術(shù)需要專業(yè)人員進(jìn)行操作并且有發(fā)生并發(fā)癥的可能，因此不作為常規(guī)檢查。雖然細(xì)菌培養(yǎng)所需要等待的時間較長（一般35 d），可能出現(xiàn)假陰性的結(jié)果（后者與標(biāo)本量過少、已接受抗生素治療或不理想的實(shí)驗(yàn)室條件均有關(guān)），但由于它是進(jìn)行藥敏試驗(yàn)及對流行株進(jìn)行流行病學(xué)分析的基礎(chǔ)，因此該技術(shù)在臨床上仍有不可取代的地位。   1.2 免疫層析法    免疫層析法（ICT）是目前廣泛用于SP診斷的快速方法。其檢測的抗原為Cpolysaccharide抗原，是位于細(xì)菌細(xì)胞壁的C多糖，為SP各血清型

3、所共有。由于ICT以尿樣為檢測對象，故又稱為尿抗原檢測法。    目前世界各國采用的是美國緬因州波特蘭Binax公司生產(chǎn)的Binax NOWICT試劑盒。這是個非常簡便的方法，只需15 min便可完成。該方法推薦使用的標(biāo)本為標(biāo)準(zhǔn)的非濃縮尿樣。將拭子條浸入尿樣后置于檢測卡中，再加入6滴試劑，15 min后出現(xiàn)1條色帶的為陰性，2條色帶的為陽性結(jié)果3。該試劑盒在臨床診斷中具有較好的敏感性和特異性。據(jù)現(xiàn)有的報道敏感性為67%92%（大多為75%85%），特異性為90%100%。該試劑盒同樣可用于檢測胸腔積液、腦脊液和支氣管灌洗液。20022006年，西班牙的Jose M

4、. Porcel等人采用該試劑盒對患者的胸水進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)敏感性為70.6%，特異性為93.3%。該方法較突出的優(yōu)點(diǎn)是抗生素的使用并不影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此它不能用于評價抗生素治療效果。在感染后1月內(nèi)該試驗(yàn)均可陽性，這也造成了那些反復(fù)感染的病例被誤診的潛在可能性。特別在兒童中，由于SP的定植造成該試驗(yàn)非特異性陽性的問題已逐漸引起了關(guān)注。盡管該試驗(yàn)在SP感染的兒童中敏感性較高，但在尿抗原檢測呈陽性的病例中仍有7%15%的病例沒有SP感染的臨床證據(jù)4。    ICT雖然在SP鼻咽攜帶者中存在假陽性結(jié)果，但由于ICT標(biāo)本采集簡便，不具創(chuàng)傷性，不受先前抗生素治療干擾，

5、具有較高的敏感性和特異性，15 min便可完成檢測等優(yōu)點(diǎn)，是快速診斷SP感染的簡便方法。1.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)    聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）敏感性高，特異性強(qiáng)，實(shí)時熒光定量PCR可對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行可重復(fù)定量檢測，在擴(kuò)增的每個循環(huán)中至少收集一次熒光數(shù)據(jù)，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時監(jiān)控，從而增加PCR的敏感性和特異性。20012004年，Alban Le Monnier等5對社區(qū)獲得性肺炎患者的胸腔積液進(jìn)行SP16S rDNA基因檢測，發(fā)現(xiàn)該試驗(yàn)的敏感性為77%。在抗生素治療初期，PCR不受其干擾，因此為早期診斷提供了較可靠的依據(jù)。然而，與ICT相比，PCR是一種復(fù)雜、耗時的

6、檢測方法，還未完全標(biāo)準(zhǔn)化，從而妨礙其成為SP臨床診斷方法，主要作為實(shí)驗(yàn)研究的技術(shù)方法。 2  耐藥現(xiàn)狀及耐藥機(jī)制 2.1 內(nèi)酰胺類抗生素    在上個世紀(jì)四、五十年代，當(dāng)青霉素被應(yīng)用于臨床初期，SP對青霉素是相當(dāng)敏感的。當(dāng)時大部分菌株的青霉素MIC 0.0150.03 mg/L。上世紀(jì)60年代，在澳大利亞和新幾內(nèi)亞，部分SP出現(xiàn)了對青霉素敏感性降低的現(xiàn)象，分離出對青霉素耐藥的SP（penicillinresistant streptococcus pneumoniae, PRSP）。70年代末，南非報道了對青霉素高水平耐藥的菌株，這些菌株的青霉素MIC高

7、達(dá)24 mg/L。在美國，SP對青霉素的耐藥情況在70年代及80年代初沒有顯著的變化，持續(xù)保持在10%或更低。但在80年代末及整個90年代，SP對青霉素的耐藥性發(fā)生了戲劇性的變化，不敏感率顯著增加。有報道稱，在19932004年，耐藥菌株增加了近30倍。亞洲地區(qū)耐藥性病原監(jiān)測網(wǎng)（ANSORP）的監(jiān)測結(jié)果表明SP對青霉素的耐藥率為29.4%，不敏感率為52.4%6。20002002年兒童鼻咽部分離887株SP對青霉素耐藥率為6.4%，青霉素不敏感率39.9%7。    2001年美國臨床實(shí)驗(yàn)室國家標(biāo)準(zhǔn)委員會（National Committee for Clinic

8、al Laboratory Standards, NCCLS）判斷SP對青霉素耐藥的標(biāo)準(zhǔn)是：MIC2 mg/L為耐藥；MIC 0.121.0 mg/L為中度耐藥；0.06 mg/L為敏感。    青霉素耐藥的產(chǎn)生是由于細(xì)胞壁上一種或多種青霉素結(jié)合蛋白（PBP）的改變，這種改變同樣可以影響到PBP與整個內(nèi)酰胺類抗生素的結(jié)合8。如果抗生素在感染部位有足夠濃度的話，這種耐藥機(jī)制即可被克服。在呼吸道感染的情況下，只要給予適當(dāng)劑量的藥物，大部分的SP對內(nèi)酰胺類抗生素，比如靜脈滴注頭孢曲松和口服阿莫西林仍然保持敏感。2.2 大環(huán)內(nèi)酯類和林可霉素類抗生素  

9、  SP對大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥率在近2030年間迅速增長。Alexander Project9研究結(jié)果顯示，19982000年全球紅霉素耐藥率為24.6%。亞洲國家耐藥程度比歐美國家嚴(yán)重，ANSORP的監(jiān)測結(jié)果表明，19982001年亞洲地區(qū)對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥的SP（macrolideresistant streptococcus pneumoniae, MRSP）占59.3%10。我國北京、上海、廣州三家兒童 醫(yī)院 上呼吸道感染患兒鼻咽部SP紅霉素耐藥率為84.3%6。    SP對大環(huán)內(nèi)酯類的藥敏試驗(yàn)分為三種情況：敏感（MIC<1 mg/L

10、）、低度耐藥（MIC 132 mg/L）和高度耐藥（MIC>64 mg/L）。低度耐藥和高度耐藥的臨床特點(diǎn)即對現(xiàn)有的所有大環(huán)內(nèi)酯類藥物均出現(xiàn)耐藥，兩者不同之處在于前者對林可霉素通常敏感。兩者的耐藥機(jī)制也有所不同：低度耐藥常常由mefA基因介導(dǎo)，耐藥表型為M型（即對大環(huán)內(nèi)酯類耐藥而對林可霉素類敏感）；高度耐藥常常由ermB基因介導(dǎo)，耐藥表型為MLSB型（即對大環(huán)內(nèi)酯類、林可霉素類和鏈陽霉素B類均耐藥）。M型的耐藥機(jī)制為泵出機(jī)制，即將細(xì)胞內(nèi)的大環(huán)內(nèi)酯類藥物移至細(xì)胞外；MLSB型的耐藥機(jī)制為核糖體靶位修飾機(jī)制，主要由SP產(chǎn)生甲基酶使核糖體亞基中的腺嘌呤發(fā)生雙甲基化，從而阻止大環(huán)內(nèi)酯類、林可霉素

11、、鏈陽霉素B等抗生素與之結(jié)合。美國在20002004年對MRSP菌株的觀察性研究中發(fā)現(xiàn)，在11 576株菌株中，M表型占主導(dǎo)地位（65.7%），而MLSB表型在研究過程中由初期的9.7%上升至18.4%11。而在全球的其它地區(qū)MLSB表型仍較為流行。 3 結(jié)束語     由于耐藥SP感染大量增加，多重耐藥SP感染已成為全球面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。ICT是診斷SP感染快速、可靠的方法，并可以為治療贏得時間。因此，必須合理使用抗生素，加強(qiáng)耐藥監(jiān)測，在耐藥株高度流行區(qū)域，對高危人群使用SP多價結(jié)合疫苗以及開發(fā)新型抗生素是解決SP耐藥的有效措施。【 參考 文獻(xiàn) 】  

12、1World Health Organization. Pneumococcal conjugated vaccine for childhood immunizationWHO position paper J. Wkly Epidemiol Rec, 2007, 82: 93104.2Campbell SG, Marrie TJ, Anstey R, et al. The contribution of blood cultures to the clinical management of adult patients admitted to the hospital with comm

13、unityacquired pneumonia: a prospective observational study J. Chest, 2003, 123: 11421150.3Smith MD, Derrington P, Evans R, et al. Rapid diagnosis of bacteremic pneumococcal infections in adults by using the Binax NOW Streptococcus pneumoniae urinary antigen test: a prospective, controlled clinical e

14、valuation J. J Clin Microbiol, 2003, 41: 28102813.4Neuman MI, Harper MB. Evaluation of a rapid urine antigen assay for detection of invasive pneumococcal disease in children J. Pediatrics, 2003, 112: 12791282.5Alban LM, Etienne C, JeanRalph Z, et al. Microbiological Diagnosis of Empyema in Children:

15、 Comparative Evaluations by Culture, Polymerase Chanin Reaction, and Pneumococcal Antigen Detection in Pleural Fluids J. Clinical Infectious Dis, 2006, 42: 11351145.6Song JH, Jung SI, Ko KS, et al. High prevalence of antimicrobial resistance among clinical Streptococcus pneumoniae isolates in Asia J

16、. Antimicrob Agents Chemother, 2004, 48: 21012107.7Yao K, Shen X, Yu S, et al. Antimicrobial resistance and serotypes of nasopharyngeal strains of Streptococcus pneumoniae in Chineses children with acute respiratory infections J. J Int Med Res, 2007, 35: 253267.8Hakenbeck R, Kaminski K, Konig A, et

17、al. Penicillinbinding prot Ei ns in lactamresistant Streptococcus pneumoniae J. Microb Drug Resist, 1999, 5: 9199.9Jacobs MR, Felmingham D, Appelbaum PC, et al. The Alexander Project Group. The Alexander Project 19982000: susceptibility of pathogens isolated from communityacquired respiratory tract

18、infection to commonly used antimicrobial agents J. J Antimicrob Chemother, 2003, 52: 229246.10Song JH, Chang HH, Suh JY, et al. Macrolide resistance and genotypic characterization of Streptococcus pneumoniae in Asian countries: a study of the Asian Network for Surv EI llance of Resistant Pathogens (ANSORP) J. J Antimicrob Chemother, 2004, 53: 457463.11Jenkins SG, Brown SD, Farrell KJ. Trends in antibacterial resistan