內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的泛素化機(jī)制

1、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的泛素化機(jī)制當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)經(jīng)過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）的時(shí)候，會(huì)有一套“質(zhì)控”系統(tǒng)暫時(shí)將那些新合成的蛋白質(zhì)“扣留”下來(lái)，幫助它們成熟。只有折疊正確的蛋白質(zhì)才會(huì)被“釋放”，而那些不能成熟的蛋白質(zhì)則會(huì)被繼續(xù)“關(guān)押”，但是這樣會(huì)損害內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能。因此，為了維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，蛋白質(zhì)質(zhì)控系統(tǒng)會(huì)將這些“不合格產(chǎn)品”移交到胞質(zhì)溶膠當(dāng)中，在那里，被蛋白酶體降解掉。隨著在越來(lái)越多的病理過(guò)程當(dāng)中發(fā)現(xiàn)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)質(zhì)控系統(tǒng)功能缺陷的現(xiàn)象，我們也開(kāi)始逐漸意識(shí)到細(xì)胞內(nèi)這條作用機(jī)制的重要性。在所有人類(lèi)基因組編碼的蛋白質(zhì)當(dāng)中，大約有20%的蛋白質(zhì)被認(rèn)為是分泌性蛋白質(zhì)。這些分泌性蛋白質(zhì)在到達(dá)它們

2、的最終的目的地之前都需要先經(jīng)過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的處理，這些目的地廣泛分布在細(xì)胞各處，例如細(xì)胞膜上，各種胞內(nèi)或胞外的腔室（Exocytotic and endocytotic compartments），以及細(xì)胞外表面等等。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)不僅僅只是提供了一個(gè)“容器”，它同時(shí)還提供了眾多的分子伴侶，幫助蛋白質(zhì)折疊、成熟。不過(guò)雖然細(xì)胞提供了這些幫助，蛋白質(zhì)在合成過(guò)程當(dāng)中仍然非常容易出錯(cuò)。大約有1/3的新生蛋白質(zhì)會(huì)在翻譯過(guò)程中或者在翻譯后數(shù)分鐘之內(nèi)被降解掉。這些蛋白質(zhì)是因?yàn)樵谵D(zhuǎn)錄過(guò)程、翻譯過(guò)程、成熟過(guò)程或折疊過(guò)程中出現(xiàn)了某些錯(cuò)誤，或者各個(gè)亞基之間的合成不平衡，從而不能形成正確的構(gòu)象而被降解的。即使是成熟的蛋白質(zhì)也會(huì)因?yàn)?/p>

3、各種諸如高能輻射、化學(xué)損傷、代謝產(chǎn)物等等環(huán)境因素而被損傷。這些損傷蛋白會(huì)聚集在一起，也會(huì)出現(xiàn)功能障礙，這都會(huì)影響到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。因此，進(jìn)化機(jī)制賦予了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)控制蛋白質(zhì)質(zhì)量的功能，這套質(zhì)控系統(tǒng)可以在好幾個(gè)層面對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行監(jiān)控，維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的完好性。在蛋白質(zhì)剛剛合成時(shí)它們會(huì)通過(guò)一個(gè)特異性的N連接聚糖（N-linked glycan structure）結(jié)構(gòu)被保護(hù)起來(lái)，可以免遭降解。隨后，那些可能發(fā)生錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)會(huì)被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中甘露糖苷酶（mannosidase）生成的一種“聚糖密碼（glycan code）”所標(biāo)記（圖1）。然后，錨定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的泛素連接酶會(huì)破譯該“密碼”，需要被降解的

4、蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)運(yùn)出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，經(jīng)由泛素化途徑被26S蛋白酶體降解掉，該過(guò)程也被稱(chēng)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的降解途徑（ER-associated degradation，ERAD）。發(fā)生錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)并不是唯一一個(gè)進(jìn)入ERAD系統(tǒng)的底物，ERAD系統(tǒng)還可以調(diào)控甾醇合成途徑，它可以在甾醇過(guò)多的情況下降解掉甾醇合成途徑中的限速酶，以此來(lái)控制合成速度。圖1 蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的降解途徑。錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)被降解掉需要以下幾個(gè)步驟。首先（步驟1），附著在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的泛素連接酶與其他輔助因子一起識(shí)別出折疊錯(cuò)誤的蛋白質(zhì)。然后在步驟2所示的錯(cuò)位階段，蛋白質(zhì)經(jīng)由一目前尚不清楚的通道被轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入胞質(zhì)溶膠之中。步驟3中，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

5、的胞質(zhì)溶膠面，底物蛋白被E3泛素連接酶泛素化修飾。最后在步驟4中，在AAA+ ATP酶和Cdc48蛋白的作用下，底物蛋白從膜上被去除掉，進(jìn)入26S蛋白酶體，被降解處理。科研人員們最開(kāi)始借助生化技術(shù)和遺傳篩選的方法發(fā)現(xiàn)了一批ERAD系統(tǒng)的組成單位。不過(guò)現(xiàn)在，由于發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞對(duì)發(fā)生折疊錯(cuò)誤的糖蛋白進(jìn)行降解的途徑，大家的目光又都投向了ERAD系統(tǒng)的功能研究方向。在本文中我們將介紹內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)控系統(tǒng)是如何能夠選擇、處理出錯(cuò)的蛋白質(zhì)，但同時(shí)又不會(huì)降解掉新生蛋白的機(jī)制。因?yàn)镋RAD途徑似乎是非常保守的一條途徑，可見(jiàn)于從酵母細(xì)胞到哺乳動(dòng)物細(xì)胞等種類(lèi)眾多的真核生物細(xì)胞，因此我們選擇釀酒酵母（Saccharomy

6、ces cerevisiae）作為研究對(duì)象，來(lái)研究其中的機(jī)制，同時(shí)這也豐富了我們的知識(shí)，又進(jìn)一步擴(kuò)展了研究范圍（以往只對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行過(guò)這方面的研究）。在圖2中，我們給出了酵母細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中ERAD系統(tǒng)的組成因子，以及這些因子在細(xì)胞內(nèi)的分布情況。圖2 酵母細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的蛋白質(zhì)降解機(jī)制。分子伴侶和糖基水解酶47（glycosylhydrolase-47）家族蛋白Mns1 and Htm1能發(fā)現(xiàn)折疊錯(cuò)誤的蛋白質(zhì)，并使其與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜結(jié)合連接酶Doa10、RMA1、HRD相結(jié)合。當(dāng)?shù)孜锏鞍着c內(nèi)質(zhì)網(wǎng)胞質(zhì)溶膠面結(jié)合后就會(huì)被E3連接酶泛素化修飾。所有的泛素連接酶復(fù)合體都含有一個(gè)重要的含有指環(huán)催化結(jié)

7、構(gòu)域的E3連接酶，一個(gè)E2結(jié)合酶以及其他一些輔助因子蛋白。AAA+ ATP酶Cdc48蛋白能使泛素化修飾的底物蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上脫離下來(lái)。配體蛋白（adaptor proteins）Rad23 and Dsk2能促使泛素化修飾的底物蛋白進(jìn)入26S蛋白酶體被降解，同時(shí)，Png1蛋白能借助Rad23蛋白的作用使糖蛋白去糖基化。圖中酵母蛋白以紫色表示，哺乳動(dòng)物蛋白以綠色表示。 1. 葡聚糖與蛋白質(zhì)折疊內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)蛋白質(zhì)控系統(tǒng)最主要的作用就是將未正確折疊的蛋白質(zhì)扣留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。Hsp70伴侶蛋白以及葡聚糖依賴(lài)的分子伴侶蛋白（glycan-dependent chaperone）會(huì)與非天然蛋白結(jié)合，

8、防止其轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體，而且還可以與氧化還原酶類(lèi)（oxidoreductases）蛋白一起幫助構(gòu)象不正確的蛋白重新折疊，改變其構(gòu)象。傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為，蛋白運(yùn)送裝置只會(huì)在蛋白質(zhì)正確折疊之后才根據(jù)其氨基酸序列中的“離開(kāi)信號(hào)（exit signals）”將其轉(zhuǎn)運(yùn)出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。另一種觀點(diǎn)則認(rèn)為，在決定是否將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)時(shí)存在一個(gè)比較寬泛的標(biāo)準(zhǔn)，是依據(jù)蛋白質(zhì)的能量（級(jí)）狀態(tài)和細(xì)胞的折疊環(huán)境而定的（圖3和背景知識(shí)1）。圖3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)處理途徑。蛋白質(zhì)經(jīng)由Sec61蛋白被轉(zhuǎn)運(yùn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中之后（如圖中步驟1所示），未折疊的蛋白質(zhì)在分子伴侶的作用下可以被折疊成正確的構(gòu)象F，如圖中步驟2所示。外向轉(zhuǎn)運(yùn)因子能選擇

9、這些折疊正確的蛋白質(zhì)并將它們運(yùn)送至高爾基體，如圖中步驟3和4所示。而滯留因子則會(huì)阻止未折疊的蛋白質(zhì)離開(kāi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，如圖中步驟5所示。分子伴侶會(huì)努力幫助任何折疊發(fā)生錯(cuò)誤的蛋白質(zhì)恢復(fù)成未被折疊的狀態(tài)，使其能夠重新進(jìn)行正確的折疊，如圖中步驟6所示。在步驟7中，滯留因子會(huì)使折疊錯(cuò)誤的蛋白質(zhì)停留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，最終，這些異常蛋白質(zhì)以及一部分處于折疊中間狀態(tài)的蛋白質(zhì)會(huì)經(jīng)胞質(zhì)溶膠途徑被降解，如圖中步驟8所示。KUF和KUM表示反應(yīng)的平衡常數(shù)。 背景知識(shí)1：關(guān)于蛋白質(zhì)外向轉(zhuǎn)運(yùn)的靈活標(biāo)準(zhǔn)通常大家都會(huì)認(rèn)為外向轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制（export machinery）只會(huì)運(yùn)輸那些折疊正確、構(gòu)象天然的蛋白質(zhì)，而所有的異常蛋白質(zhì)都

10、會(huì)被降解掉。這說(shuō)明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）會(huì)使用一種固定的，統(tǒng)一的，以野生型蛋白質(zhì)的構(gòu)象為標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。但是這種理論卻無(wú)法解釋為什么有些細(xì)胞能分泌突變型蛋白質(zhì)。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中究竟是一種什么標(biāo)準(zhǔn)在進(jìn)行蛋白質(zhì)的質(zhì)量控制工作。了弄清楚由甲狀腺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（transthyretin，TTR）引起的組織特異性的淀粉樣變性疾?。╰issue-specific amyloid diseases）的發(fā)病機(jī)制，Sekijima等人證明了TTR突變體蛋白的分泌情況與“折疊穩(wěn)定性分值（folding stability score）”有關(guān)。這個(gè)分值集合了熱力學(xué)穩(wěn)定性情況（ther

11、modynamic stability），即伸展的多肽鏈與折疊狀態(tài)多肽鏈之間的Gibbs自由能差異（Gibbs free-energy difference）；和動(dòng)力學(xué)參數(shù)，比如TTR形成四聚體的速率等等。相應(yīng)的，不同組織蛋白分泌效率上的偏差也似乎是由于分子伴侶、外向轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制以及為細(xì)胞外向轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制制定各自標(biāo)準(zhǔn)的ERAD系統(tǒng)之間各自活性上的差異造成的。比如，在某種細(xì)胞中，某一特定蛋白可能會(huì)被轉(zhuǎn)運(yùn)出去，但是在另一種組織細(xì)胞中卻可能會(huì)被降解，這是因?yàn)榉肿影閭H的低活性降低了用于判斷蛋白是否被外向轉(zhuǎn)運(yùn)的“折疊穩(wěn)定性分值”的閾值。Wiseman等人在Sekijima試驗(yàn)的基礎(chǔ)之上又開(kāi)發(fā)出了一套關(guān)于蛋白質(zhì)折

12、疊外向轉(zhuǎn)運(yùn)的定量模型，即FoldEx模型，該模型將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中復(fù)雜的內(nèi)環(huán)境網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)簡(jiǎn)化成了幾條基本的代謝通路，包括易位（translocation）、不需要分子伴侶的蛋白折疊途徑和需要分子伴侶的蛋白折疊途徑、蛋白外向轉(zhuǎn)運(yùn)途徑以及ERAD途徑，每一條途徑都被看做一個(gè)獨(dú)立的單元（圖3）。上述這每一條途徑的作用都與酶的作用一樣，可以通過(guò)MichaelisMenten動(dòng)力學(xué)常數(shù)表示出來(lái)。Wiseman等人結(jié)合了幾種不同的方程，用數(shù)學(xué)的方法描述了蛋白質(zhì)以折疊平衡常數(shù)（folding equilibrium constant）為基礎(chǔ)的外向轉(zhuǎn)運(yùn)效率，該效率與熱力學(xué)穩(wěn)定性情況有關(guān)。這種理論研究的方法正確的解釋了我

13、們?cè)谠囼?yàn)中觀察到的現(xiàn)象，即在一個(gè)特定的細(xì)胞特異性環(huán)境當(dāng)中，蛋白質(zhì)折疊分子的絕對(duì)熱力學(xué)穩(wěn)定性決定了它們的外向轉(zhuǎn)運(yùn)效率。FoldEx模型同樣也解釋了為什么即使是非常穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，比如CTFR等包含多個(gè)結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)或者是多亞基組成的蛋白質(zhì)復(fù)合體，如果折疊的過(guò)慢也會(huì)被降解掉，該模型告訴我們，蛋白質(zhì)的外向轉(zhuǎn)運(yùn)效率取決于ERAD途徑與外向轉(zhuǎn)運(yùn)途徑之間的活性對(duì)比情況，也取決于蛋白質(zhì)發(fā)生錯(cuò)誤折疊的速度，這也就是說(shuō)當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)更容易發(fā)生錯(cuò)誤折疊時(shí)，蛋白質(zhì)的外向轉(zhuǎn)運(yùn)效率就會(huì)降低。FoldEx模型重點(diǎn)強(qiáng)調(diào)了“可適應(yīng)性標(biāo)準(zhǔn)（adaptable standard）”的概念，是可適應(yīng)性標(biāo)準(zhǔn)決定了某種細(xì)胞中每一種蛋白質(zhì)的外向

14、轉(zhuǎn)運(yùn)效率。該標(biāo)準(zhǔn)是由蛋白質(zhì)氨基酸序列復(fù)雜的相互作用以及蛋白質(zhì)折疊時(shí)所處的局部微環(huán)境（比如分子伴侶及幫助蛋白質(zhì)折疊的酶、代謝產(chǎn)物、外向轉(zhuǎn)運(yùn)裝置和ERAD裝置等情況）等因素所決定的，而且該標(biāo)準(zhǔn)還可以在細(xì)胞處于應(yīng)激環(huán)境時(shí)進(jìn)行調(diào)整，幫助細(xì)胞適應(yīng)相應(yīng)的環(huán)境。各種不同的蛋白質(zhì)都可以競(jìng)爭(zhēng)這些細(xì)胞裝置，結(jié)果導(dǎo)致某種蛋白的外向轉(zhuǎn)運(yùn)效率會(huì)取決于某一時(shí)刻表達(dá)的蛋白酶體的多少。FoldEx模型是第一個(gè)將蛋白質(zhì)折疊相關(guān)以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊活性、ERAD和外向轉(zhuǎn)運(yùn)裝置相關(guān)熱力學(xué)參數(shù)和動(dòng)力學(xué)參數(shù)結(jié)合起來(lái)的理論模型，該模型將會(huì)是我們未來(lái)試驗(yàn)研究中的好幫手。  大部分在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成的蛋白質(zhì)多肽都會(huì)被N連接低聚糖（

15、N-linked oligosaccharides）修飾。低聚糖糖基轉(zhuǎn)移酶（Oligosaccharyltransferase）能催化葡萄糖3-甘露糖9-N-乙酰葡糖胺酶2低聚糖（glucose3-mannose9-N-acetylglucosamine2 oligosaccharides）與進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白所含的Asn-X-Ser/Thr基序中的天冬酰胺（asparagine）之間共價(jià)連接（圖4）。這些N連接聚糖賦予了被修飾蛋白更多的親水性，同時(shí)也能起到幫助蛋白質(zhì)折疊的作用。而且，這些聚糖分子結(jié)構(gòu)本身的修飾信息也能為我們提供當(dāng)下的蛋白質(zhì)的折疊狀況信息。聚糖分子最外側(cè)的兩個(gè)葡萄糖分子會(huì)被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中

16、的葡萄糖苷酶（-glucosidases）水解切除掉，以表明該蛋白正處于折疊過(guò)程之中（圖4）。在這個(gè)階段，葡聚糖依賴(lài)的分子伴侶蛋白會(huì)與該蛋白相連。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，鈣聯(lián)接蛋白（calnexin，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的一種磷酸化的鈣結(jié)合蛋白）或鈣網(wǎng)織蛋白（calreticulin）會(huì)與單葡糖基化修飾的糖蛋白（monoglucosylated glycoproteins）相連接，幫助其成熟。當(dāng)新生蛋白與這些伴侶蛋白分子解離之后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的葡萄糖苷酶II（-glucosidase-II trims）分子會(huì)去掉殘余的葡萄糖分子，防止新生蛋白再次與鈣聯(lián)接蛋白或鈣網(wǎng)織蛋白相連。這些進(jìn)行了正確折疊獲得天然構(gòu)象的糖蛋白

17、隨后就可以離開(kāi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)了。但是那些需要更多幫助才能成熟的蛋白質(zhì)又是如何獲得正確構(gòu)象的呢？作為哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)最主要的折疊裝置，UDP葡萄糖（UDP-glucose）糖蛋白葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（glycoprotein glucosyltransferase，GT或者叫UGGT）能識(shí)別出非天然蛋白質(zhì)，并使其聚糖分子A分支重新葡萄糖基化，這樣，就可以再次與鈣聯(lián)接蛋白或鈣網(wǎng)織蛋白相連，進(jìn)行重新折疊（圖4b）。這種鈣聯(lián)接蛋白-鈣網(wǎng)織蛋白循環(huán)（calnexincalreticulin cycle）只是哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)質(zhì)控系統(tǒng)里的第一步，但是如果新生蛋白“錯(cuò)過(guò)”了這一輪成熟的機(jī)會(huì)，就只能被降解掉。圖4 在

18、酵母細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中對(duì)N連接聚糖分子的處理過(guò)程示意圖。a：在酵母細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，寡糖基轉(zhuǎn)移酶（oligosaccharyltransferase，OST）能將多萜醇載體上的葡萄糖3-甘露糖9-N-乙酰葡萄糖胺2低聚糖分子（glucose3-mannose9-N-acetylglucosamine2 oligosaccharide）轉(zhuǎn)移到底物蛋白Asn-X-Ser/Thr基序中的天門(mén)冬酰胺殘基上。在酵母細(xì)胞中葡萄糖苷酶1、2（glucosidases 1 and 2，Gls1、Gls2）能將葡萄糖3-甘露糖9-N-乙酰葡萄糖胺2低聚糖分子中最外側(cè)的兩個(gè)葡萄糖殘基去除掉，形成葡萄糖

19、1-甘露糖9-N-乙酰葡萄糖胺2低聚糖分子（glucose1-mannose9-N-acetylglucosamine2 oligosaccharide），如圖中步驟1所示。在Gls2蛋白的繼續(xù)作用下最終能形成甘露糖9-N-乙酰葡萄糖胺2低聚糖分子（mannose9-N-acetylglucosamine2 oligosaccharide），該分子能保護(hù)糖蛋白免遭降解，見(jiàn)步驟2。Mns1蛋白能去除聚糖分子B鏈，即中間鏈上最外側(cè)的甘露糖殘基，形成甘露糖8-N-乙酰葡萄糖胺2低聚糖分子（mannose8-N-acetylglucosamine2 oligosaccharide），這說(shuō)明該糖蛋白在內(nèi)

20、質(zhì)網(wǎng)中停留了很長(zhǎng)的一段時(shí)間，見(jiàn)步驟3。然后，Htm1蛋白繼續(xù)處理最右手邊的C鏈糖蛋白，形成甘露糖7-N-乙酰葡萄糖胺2低聚糖分子（mannose7-N-acetylglucosamine2 oligosaccharide），見(jiàn)步驟4；b：在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，步驟1和2與酵母細(xì)胞中發(fā)生的相同，只不過(guò)在步驟2中由葡萄糖苷酶II（glucosidase-II）完成的去除A鏈中最后一個(gè)葡萄糖殘基位點(diǎn)的反應(yīng)是可逆的。葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（Glucosyltransferase，GT）能促使那些未能獲得天然構(gòu)象的糖蛋白再次發(fā)生葡萄糖基化，見(jiàn)步驟3。如果EDEM蛋白被ERManI進(jìn)行過(guò)度的去甘露糖基化處理或者被內(nèi)質(zhì)

21、網(wǎng)降解，都會(huì)形成甘露糖5-N-乙酰葡萄糖胺2低聚糖分子（mannose5-N-acetylglucosamine2 oligosaccharide），而這就是蛋白質(zhì)應(yīng)該被降解的信號(hào)，見(jiàn)步驟4。 2. 給予降解信號(hào)那些沒(méi)能獲得天然構(gòu)象的蛋白質(zhì)必須被細(xì)胞降解，以免進(jìn)行不必要的折疊，以免內(nèi)質(zhì)網(wǎng)被這些蛋白占據(jù)?！案事短怯?jì)時(shí)器（mannose timer）”模型認(rèn)為，一旦蛋白質(zhì)上的甘露糖殘基被去掉，那么它就無(wú)法再獲得正確的構(gòu)象了。實(shí)際上，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的糖基水解酶47（glycosylhydrolase-47，GH47）家族蛋白才是體內(nèi)處理錯(cuò)誤蛋白的第一道防線。在酵母細(xì)胞中，GH47家族里有兩名成員

22、在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中被發(fā)現(xiàn)，它們分別是1,2甘露糖苷酶（1,2-mannosidase）Mns1（該蛋白也被稱(chēng)為甘露糖苷酶樣蛋白1）和甘露糖苷酶樣蛋白Htm1，該蛋白是甘露糖苷酶1（mannosidase 1）的同系物。Mns1蛋白能去除N連接聚糖B鏈上最外側(cè)的甘露糖殘基（圖4）。實(shí)際上，這種修剪作用能影響到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的所有糖蛋白，但是對(duì)糖蛋白的成熟過(guò)程和酵母細(xì)胞的存活都不會(huì)造成任何影響。不過(guò)如果細(xì)胞缺失了MNS1基因，那么對(duì)錯(cuò)誤蛋白的處理能力就會(huì)被削弱，這說(shuō)明在Mns1蛋白催化甘露糖9-N-乙酰葡糖胺酶2低聚糖(mannose9-N-acetylglucosamine2 glycan)轉(zhuǎn)變?yōu)楦事短?-N

23、-乙酰葡糖胺酶2低聚糖（mannose8-N-acetylglucosamine2 glycan）之前，糖蛋白一直都被保護(hù)起來(lái)而免遭降解。因?yàn)镸ns1蛋白是不考慮蛋白的折疊狀態(tài)，對(duì)所有蛋白“一視同仁”的，由此可見(jiàn)，僅僅只靠8甘露糖結(jié)構(gòu)是不足以促使糖蛋白降解的，一定還有其他的信號(hào)機(jī)制幫助細(xì)胞區(qū)分正常的蛋白與異常的蛋白。我們最開(kāi)始認(rèn)為Htm1蛋白只是一種凝集素蛋白（lectin）。但現(xiàn)在我們認(rèn)為，糖蛋白在經(jīng)過(guò)Mns1蛋白處理之后，Htm1蛋白可以去除掉N連接聚糖C鏈上的1,2甘露糖帽結(jié)構(gòu)（capping 1,2-mannose），不過(guò)我們目前還缺乏這方面的直接證據(jù)。因此，Mns1蛋白和Htm1蛋白

24、之間的這種序貫作用最終就形成了甘露糖7-N-乙酰葡糖胺酶2結(jié)構(gòu)（mannose7-N-acetylglucosamine2），這種結(jié)構(gòu)就是被ERAD所識(shí)別的信號(hào)。上述這種理論也可以解釋為什么細(xì)胞缺失了編碼1,3甘露糖轉(zhuǎn)移酶（1,3-mannosyltransferase，Alg3）的基因之后細(xì)胞就可以在不需要Htm1蛋白的情況下仍然能對(duì)糖蛋白進(jìn)行降解了。我們?cè)赼lg3細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，在N連接聚糖糖蛋白上有甘露糖5-N-乙酰葡糖胺酶2結(jié)構(gòu)（mannose5-N-acetylglucosamine2）結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)的末端仍然連接有由Htm1蛋白導(dǎo)致的1,6甘露糖殘基。Htm1蛋白是如何選擇底物的我們還不

25、清楚。不過(guò)Htm1蛋白可以和二硫化物異構(gòu)酶（disulphide isomerase）Pdi1蛋白一起形成復(fù)合體，因此，Htm1蛋白可能只能對(duì)與氧化還原酶（oxidoreductase）有關(guān)的Pdi1蛋白的底物發(fā)揮作用。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，我們?cè)趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)中發(fā)現(xiàn)了GH47家族蛋白中的四名成員，即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)1,2甘露糖苷酶1（ER 1,2-mannosidase-I，ERManI）和其他三個(gè)甘露糖苷酶樣蛋白EDEM1、EDEM2、EDEM3。ERManI蛋白與它在酵母細(xì)胞中的同源蛋白一樣，也能水解1,2甘露糖苷鍵，切掉B鏈上的一個(gè)甘露糖殘基。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中ERManI蛋白的豐度能影響ERAD系統(tǒng)底物的穩(wěn)定性。如

26、果使用siRNA技術(shù)敲除掉ERManI蛋白，就會(huì)影響未被切割的無(wú)唾液酸糖蛋白受體（asialoglycoprotein receptor）H2a蛋白前體的降解過(guò)程。如果過(guò)表達(dá)ERManI蛋白，則會(huì)增強(qiáng)去甘露糖基化作用（de-mannosylation），降解掉1抗胰蛋白酶（1-antitrypsin）的無(wú)效變異體蛋白（null Hongkong (NHK) variant）。不過(guò)在酵母細(xì)胞中，僅靠ERManI蛋白還不足以對(duì)糖蛋白進(jìn)行標(biāo)記，使其降解。似乎ERManI蛋白還需要與EDEM家族蛋白共同作用才能處理掉異常的糖蛋白。雖然我們過(guò)去認(rèn)為EDEM蛋白只是凝集素而已，但是現(xiàn)在已經(jīng)年有證據(jù)表明ED

27、EM家族蛋白與Htm1蛋白一樣，都是甘露糖苷酶。細(xì)胞內(nèi)EDEM1和EDEM3蛋白過(guò)表達(dá)時(shí)，連接在底物蛋白，諸如NHK、BACE451、T細(xì)胞受體亞單位上的葡聚糖分子中甘露糖殘基的數(shù)量就會(huì)減少。此外，根據(jù)我們對(duì)EDEM蛋白結(jié)構(gòu)模型的分析，我們發(fā)現(xiàn)EDEM蛋白與ERManI蛋白在結(jié)構(gòu)上具有驚人的相似性，而且還發(fā)現(xiàn)對(duì)于ERManI蛋白催化活性比較重要的氨基酸殘基都非常保守。這說(shuō)明至少EDEM1和EDEM3蛋白具有甘露糖苷酶的活性。不過(guò)我們還不清楚這些酶是如何選擇各自底物的。但是我們知道EDEM1蛋白能與鈣聯(lián)接蛋白發(fā)生相互作用，因此，它可能借此方式來(lái)與底物糖蛋白發(fā)生相互作用。 3. ERAD

28、系統(tǒng)的分類(lèi)整理功能被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)甘露糖苷酶I蛋白和Htm1蛋白處理過(guò)的折疊錯(cuò)誤的糖蛋白最終必須由泛素連接酶進(jìn)行泛素化修飾。但是未經(jīng)糖基化修飾的異常蛋白也會(huì)經(jīng)由上述途徑進(jìn)行降解，不過(guò)我們現(xiàn)在對(duì)起始過(guò)程還不清楚。背景知識(shí)2中對(duì)ERAD系統(tǒng)的主要底物進(jìn)行了歸納總結(jié)。在蛋白的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、跨膜區(qū)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域里可能出現(xiàn)的各種蛋白質(zhì)異常情況以及需要注意的出錯(cuò)情況，都使得該蛋白必須與E3連接酶不同，這些連接酶能與其它輔助因子一起形成復(fù)合體，招募固定末端折疊錯(cuò)誤的蛋白質(zhì)。 背景知識(shí)2：ERAD底物簡(jiǎn)介1抗胰蛋白酶（1-Antitrypsin，1-AT）  1抗胰蛋白酶是一種由肝細(xì)胞分泌的可溶性糖

29、基化絲氨酸蛋白酶抑制劑（serine-protease inhibitor）。NHK變異體蛋白基因具有一提前出現(xiàn)的終止密碼子。雖然NHK變異體蛋白不能進(jìn)行正常的折疊，但是它們也能部分的“逃脫”內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)質(zhì)控系統(tǒng)的監(jiān)測(cè)，被細(xì)胞分泌出來(lái)。NHK-QQQ蛋白是一種未被糖基化修飾的人工NHK蛋白。在Pi Z變異體中，蛋白質(zhì)第342位的谷氨酸突變成了賴(lài)氨酸，這會(huì)影響到蛋白質(zhì)的折疊，并使其無(wú)法分泌。在某些情況下，Pi Z蛋白會(huì)積聚在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，形成肝硬化。如果人體缺乏1抗胰蛋白酶還會(huì)導(dǎo)致肺氣腫（lung emphysema），這是由于在缺乏1抗胰蛋白酶時(shí)嗜中性白細(xì)胞分泌的彈性蛋白酶活性會(huì)增高，從而破壞了

30、肺泡間的結(jié)締組織（connective tissue）結(jié)構(gòu)。ASGPR H2a  ASGPR H2a是唾液酸糖蛋白受體（asialoglycoprotein receptor）的組成亞單位。唾液酸糖蛋白受體能以受體介導(dǎo)的胞吞作用（receptor-mediated endocytosis）清除循環(huán)中不含唾液酸的糖蛋白。BACE457  分泌酶（-secretase，BACE）在胰腺中的同工酶，它無(wú)法幫助處理淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein）。相反，BACE457自己會(huì)被降解。CD3 和TCR  屬于T細(xì)胞受體家族，能在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中組裝

31、。孤兒亞單位（Orphan subunits）會(huì)被降解。同樣，分泌型Ig-在缺乏輕鏈的情況下也會(huì)被降解。囊性纖維病電導(dǎo)調(diào)節(jié)因子（conductance regulator，CFTR）  CFTR是由上皮細(xì)胞表達(dá)的一種氯離子通道蛋白。F508突變型蛋白是最常見(jiàn)的導(dǎo)致囊性纖維病這種遺傳性常染色體隱性遺傳病的病因。F508缺失突變型蛋白只能部分影響氯離子通道的生理活性，但是該變異蛋白的成熟過(guò)程會(huì)受到很大的影響。上皮細(xì)胞由于缺乏氯離子，因此滲透壓不足，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的粘液含水量也就相應(yīng)降低。高粘度的粘液影響了患者氣道的自凈功能，導(dǎo)致持續(xù)性的氣道感染，最終引起肺部纖維性變，肺功能衰竭。羧肽酶Y（c

32、arboxypeptidase Y，CPY）  羧肽酶Y是釀酒酵母空泡中的一種可溶性絲氨酸蛋白酶，它攜帶有N連接聚糖。CPY*蛋白是CPY蛋白第255位的甘氨酸突變?yōu)榫彼岬耐蛔凅w蛋白。CPY*蛋白的C末端缺乏低聚糖分子，因此無(wú)法被ERAD途徑識(shí)別。-羥-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（HMG-CoA reductase）又名3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA reductase)  該酶是一種膜錨定蛋白質(zhì)，也是甲羥戊酸（mevalonate）代謝通路中的限速酶。它的穩(wěn)定性與細(xì)胞內(nèi)甾醇的豐度高度相關(guān)。當(dāng)甾醇含量足夠

33、高時(shí)，該酶會(huì)被降解。Ig LC NS  Ig LC NS是一種無(wú)法轉(zhuǎn)運(yùn)的免疫球蛋白輕鏈蛋白，會(huì)被ERAD途徑降解。KAI1又名CD82  KAI1蛋白屬于四次跨膜蛋白家族（tetraspanin family）。在好幾種人類(lèi)癌癥中都會(huì)發(fā)現(xiàn)KAI1蛋白表達(dá)量降低與腫瘤轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)有關(guān)。MHC I類(lèi)分子  MHC I類(lèi)分子能將細(xì)胞內(nèi)的肽段呈遞給T細(xì)胞，以便機(jī)體清除表達(dá)外源性肽段的細(xì)胞。HCMV病毒借助細(xì)胞ERAD系統(tǒng)能降解MHC I類(lèi)分子的重鏈蛋白，以防止細(xì)胞呈遞病毒來(lái)源的肽段。Pael受體（Pael receptor，Pael-R）  Pael受體是泛素連

34、接酶Parkin的底物蛋白。當(dāng)Parkin失活時(shí)，未經(jīng)折疊的Pael受體會(huì)聚集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡。這說(shuō)明Pael受體在青少年帕金森氏?。╦uvenile Parkinsons disease）這種常染色體隱性遺傳疾病中扮演了重要角色。Pdr5  Pdr5蛋白是一種ATP結(jié)合盒式轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白（ATP-binding cassette transporter），它能使釀酒酵母對(duì)多種藥物產(chǎn)生抗性。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)核糖體結(jié)合糖蛋白（Ribophorin I）  內(nèi)質(zhì)網(wǎng)核糖體結(jié)合糖蛋白是寡糖基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體（oligosaccharyltransferase complex）中錨定在膜上

35、的亞單位。如果去掉該蛋白的C末端跨膜結(jié)構(gòu)域就會(huì)形成錯(cuò)誤折疊的，可溶性的變異體蛋白R(shí)I322，該變異體蛋白只攜帶有一個(gè)N連接聚糖。甲狀腺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Transthyretin，TTR）  甲狀腺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是由肝細(xì)胞分泌的未被糖基化修飾的血清蛋白，它能起到轉(zhuǎn)運(yùn)甲狀腺素的作用。如果該蛋白發(fā)生突變，會(huì)破壞它所構(gòu)成的同源四聚體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，形成淀粉樣纖維蛋白，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞變性，器官功能衰竭。 3.1 針對(duì)各種不同異常情況的蛋白需要不同的途徑給予解決在酵母細(xì)胞中兩種E3連接酶，但是這兩種酶就足以處理大部分的底物蛋白。連接酶Doa10蛋白是由Mat-210蛋白降解而來(lái)，它主要負(fù)責(zé)處理

36、胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域發(fā)生問(wèn)題的蛋白質(zhì)，而另一種連接酶，-羥-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（HMG-CoA reductase）的降解產(chǎn)物HRD蛋白則負(fù)責(zé)處理腔內(nèi)結(jié)構(gòu)域或跨膜結(jié)構(gòu)域異常的蛋白質(zhì)。為了突出這種處理方式上的差異，有人對(duì)ERAD系統(tǒng)的概念進(jìn)行了擴(kuò)展，提出是ERAD-C負(fù)責(zé)降解胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域發(fā)生問(wèn)題的蛋白質(zhì)，ERAD-M負(fù)責(zé)降解跨膜結(jié)構(gòu)域發(fā)生問(wèn)題的蛋白質(zhì)，而ERAD-L負(fù)責(zé)降解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)結(jié)構(gòu)域發(fā)生問(wèn)題的蛋白質(zhì)。這三條處理途徑的“起點(diǎn)”不同，但“終點(diǎn)”卻都匯聚到胞質(zhì)當(dāng)中。兼有多種異常情況的蛋白質(zhì)首先會(huì)由ERAD-C途徑處理，因?yàn)樵撏緩降奶幚硭俣人坪跻绕渌麅蓷l途徑快。不過(guò)我們需要注意的是，我們上述的這三種

37、ERAD途徑只是針對(duì)酵母細(xì)胞中的蛋白質(zhì)情況而言，不一定能推廣使用。3.2 酵母細(xì)胞中ERAD系統(tǒng)的關(guān)鍵信息HRD連接酶是錨定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的蛋白復(fù)合體，它至少由5個(gè)不同的亞基組成。Hrd1/Der3蛋白具有6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，以及一個(gè)胞質(zhì)內(nèi)環(huán)-指結(jié)構(gòu)域（RING-finger domain），該結(jié)構(gòu)域可以使泛素連接酶的靶蛋白泛素化。Hrd1蛋白能與Usa1蛋白發(fā)生相互作用，而Usa1蛋白是Der1蛋白（在ER-1中被降解）的配體。HRD蛋白復(fù)合體的腔內(nèi)結(jié)構(gòu)域是由Hrd3蛋白和Yos9蛋白（酵母細(xì)胞OS-9蛋白的同系物）組成的。Yos9蛋白攜帶有甘露糖6磷酸鹽受體同源性結(jié)構(gòu)域（mannose-6 ph

38、osphate receptor homology，（MRH）domain），該結(jié)構(gòu)域能夠識(shí)別由Htm1蛋白催化產(chǎn)生的，在末端包含有1,6連接甘露糖（1,6-linked mannose）的N連接聚糖分子。如果MRH結(jié)構(gòu)域發(fā)生突變，Yos9蛋白就無(wú)法與N連接聚糖結(jié)合，結(jié)果CPY*蛋白（即第255位甘氨酸突變?yōu)榫彼岬腃PY蛋白）和其他糖蛋白發(fā)生降解，這說(shuō)明Yos9蛋白能夠?qū)惓５鞍椎淖R(shí)別過(guò)程與泛素-蛋白酶體系統(tǒng)聯(lián)系起來(lái)。但是如果去掉Yos9蛋白，或者去掉CPY*蛋白上的糖基化位點(diǎn)，卻并不足以破壞HRD連接酶與其底物之間的相互作用。那么如果不是為了與底物進(jìn)行結(jié)合，Yos9蛋白和CPY*蛋白上的聚

39、糖分子又到底起到了一種什么樣的作用呢？Yos9蛋白中的MRH結(jié)構(gòu)域可能能對(duì)所有待查蛋白進(jìn)行搜索、篩選，看看它們是否都攜帶有尚未與其他蛋白形成穩(wěn)定相互作用的甘露糖7-N-乙酰葡糖胺酶2低聚糖（mannose7-N-acetylglucosamine2 glycan）位點(diǎn)。而復(fù)合體中的其他組成蛋白質(zhì)則可以與折疊錯(cuò)誤的蛋白質(zhì)形成連接。實(shí)際上，Hrd3蛋白的確能與異常蛋白相連，而且對(duì)疏水蛋白具有較高的親和力。Hsp70蛋白分子伴侶Kar2蛋白（karyogamy 2）也能與Yos9蛋白相連，這說(shuō)明HRD連接酶的腔內(nèi)結(jié)構(gòu)域可以通過(guò)多種方式與異常蛋白發(fā)生相互作用。HRD復(fù)合體是依靠何種機(jī)制選擇出那些機(jī)體不

40、需要的異常蛋白，將其“清理”出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的呢？我們又提出了下列機(jī)制，在Kar2的作用下，非天然構(gòu)象的蛋白質(zhì)與HRD連接酶發(fā)生相互作用，最終，這些非天然構(gòu)象的蛋白質(zhì)可能會(huì)形成成熟的，具有正確折疊構(gòu)象的蛋白質(zhì)，或者仍然無(wú)法形成正確構(gòu)象。然后，Hrd3蛋白可能會(huì)通過(guò)底物蛋白中的疏水結(jié)構(gòu)與底物蛋白結(jié)合，同時(shí)，Yos9蛋白會(huì)對(duì)這些底物蛋白進(jìn)行篩查，檢查它們是否具有末端1,6連接甘露糖（1,6-linked mannose）。只有能同時(shí)與Yos9蛋白和Hrd3蛋白發(fā)生相互作用的底物蛋白才能在攜帶有甘露糖8-9聚糖分子（mannose89 glycans，這些糖基化位點(diǎn)可以被切除，幫助蛋白質(zhì)形成正確的折疊）的糖

41、蛋白的幫助下，經(jīng)由Hrd1蛋白被泛素化途徑修飾。如果在細(xì)胞內(nèi)缺乏Yos9蛋白和Hrd3蛋白的情況下過(guò)量表達(dá)Hrd1蛋白，會(huì)導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的蛋白廣泛性降解，這說(shuō)明Yos9蛋白和Hrd3蛋白能起到篩選的作用，以保證只有合適的底物才能進(jìn)入胞質(zhì)溶膠經(jīng)由泛素化途徑被降解。為了達(dá)到這個(gè)目的，Hrd1蛋白會(huì)與可溶性的E2結(jié)合酶Ubc1和Ubc7一起協(xié)同發(fā)揮作用，這些E2結(jié)合酶會(huì)通過(guò)Cue1蛋白被錨定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。在酵母細(xì)胞中第二個(gè)位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的E3連接酶是Doa10蛋白，我們是在篩選能夠降解可溶性轉(zhuǎn)錄抑制因子Mat2的蛋白因子的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)Doa10蛋白的。隨后我們又發(fā)現(xiàn)了好幾個(gè)Doa10蛋白的膜上底物蛋白，

42、因此認(rèn)為Doa10蛋白也參與了ERAD通路。Doa10蛋白在N端具有特征性的指環(huán)結(jié)構(gòu)域（RING-finger domains）以及14個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。雖然Doa10蛋白復(fù)合體的膜結(jié)構(gòu)如此復(fù)雜，但是組成Doa10蛋白復(fù)合體的亞單位還是非常簡(jiǎn)單的，我們現(xiàn)在只發(fā)現(xiàn)E2結(jié)合酶Ubc6蛋白和Ubc7蛋白是Doa10蛋白的輔因子。Ubc7蛋白是通過(guò)Cue1蛋白被錨定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的。3.3 哺乳動(dòng)物連接酶我們?cè)诓溉閯?dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了更多的參與ERAD系統(tǒng)的連接酶，要比酵母細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的連接酶多得多。有兩種與酵母細(xì)胞Hrd1蛋白同源的哺乳動(dòng)物蛋白HRD1蛋白，又名Synoviolin蛋白；和gp78蛋白，又名AM

43、FR蛋白，即腫瘤自分泌活性因子受體蛋白（tumour autocrine motility factor receptor）。HRD1蛋白與人Hrd3同源蛋白SEL1L（Lin12樣蛋白抑制蛋白）、HERP蛋白（與酵母細(xì)胞中的Usa1蛋白類(lèi)似）、Derlin 13蛋白（屬于Der1家族蛋白）和OS-9蛋白（Yos9蛋白的人類(lèi)同源蛋白，可見(jiàn)于骨肉瘤細(xì)胞）一起，形成了與酵母HRD連接酶復(fù)合體相似的哺乳動(dòng)物連接酶復(fù)合體。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)兩種OS-9蛋白，即OS-9.1蛋白及其變異蛋白OS-9.2蛋白（該蛋白相比OS-9.1蛋白缺乏55個(gè)氨基酸殘基）。這兩種蛋白都能與SEL1L蛋白發(fā)生相互作用，也能與

44、不具有正確構(gòu)象的1抗胰蛋白酶（1-antitrypsin）的變異蛋白NHK相結(jié)合。與它們的酵母同源蛋白Yos9一樣，OS-9蛋白與底物蛋白之間的結(jié)合也不需要N連接聚糖分子的參與，所以它們可以和未被糖基化修飾的NHK蛋白NHK-QQQ蛋白相結(jié)合。但是如果底物蛋白缺乏糖基化修飾，它們就無(wú)法被細(xì)胞降解。通過(guò)siRNA降低OS-9蛋白的表達(dá)水平會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)NHK蛋白的降解，增加NHK蛋白的分泌水平。而過(guò)表達(dá)OS-9蛋白則會(huì)抑制NHK蛋白的分泌，但是不會(huì)增強(qiáng)它們的降解水平。OS-9蛋白可能會(huì)起到兩種作用，生理濃度水平的OS-9蛋白可以與SEL1L蛋白協(xié)作，將構(gòu)象不正確的異常蛋白降解；而過(guò)量的高水平的OS

45、-9蛋白卻無(wú)法與HRD連接酶發(fā)生相互作用降解異常蛋白。Yos9蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的另一個(gè)同系物（orthologue）就是XTP3-B蛋白，即XTP3反式激活蛋白B（XTP3-transactivated protein B），也被稱(chēng)為Erlectin蛋白。XTP3-B蛋白具有兩個(gè)MRH結(jié)構(gòu)域，能與SEL1L蛋白發(fā)生相互作用。與OS-9蛋白一樣，XTP3-B蛋白也能與NHK蛋白及其非糖基化的變異體蛋白相結(jié)合。如果過(guò)量表達(dá)XTP3-B蛋白會(huì)影響其底物蛋白的降解過(guò)程，不過(guò)通過(guò)siRNA技術(shù)減少XTP3-B蛋白的表達(dá)量卻沒(méi)有對(duì)NHK蛋白的穩(wěn)定性造成任何影響。我們還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)XTP3-B蛋白的最適底物

46、，XTP3-B蛋白也可以使未成熟的蛋白質(zhì)滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，并防止它們聚集，這一點(diǎn)與OS-9蛋白過(guò)表達(dá)時(shí)的情況一樣。HRD1蛋白能避免細(xì)胞在遭受應(yīng)急刺激信號(hào)時(shí)進(jìn)入凋亡途徑，這說(shuō)明它在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)異常蛋白的泛素化修飾過(guò)程中起到了非常廣泛的作用。在目前為止發(fā)現(xiàn)的所有HRD連接酶的底物蛋白中，有一些是名為RI332的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)核糖體結(jié)合糖蛋白（Ribophorin）的截短體蛋白和折疊錯(cuò)誤蛋白，有一些是未組裝的分泌型Ig單鏈蛋白以及未糖基化的Ig輕鏈蛋白變異體蛋白。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，這種異常Ig輕鏈蛋白處于一種完全氧化的狀態(tài)，具有兩個(gè)二硫鍵（disulphide bonds），而部分還原時(shí)只具有一個(gè)二硫鍵。只有這種部分還

47、原的異常Ig輕鏈蛋白能與Derlin-1蛋白和HERP蛋白發(fā)生相互作用，這表明在完全氧化的Ig輕鏈蛋白被連接酶招募之前，已經(jīng)有一個(gè)二硫鍵被還原了。人巨細(xì)胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）基因編碼產(chǎn)物特異性小區(qū)域蛋白11（unique short region protein 11，US11）也能與HRD連接酶復(fù)合體的組成單位SEL1L蛋白和Derlin-1蛋白相互合作，降解MHC I類(lèi)分子重鏈蛋白。Gp78蛋白和人HRD1蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域具有超過(guò)50%的序列同源性。與需要Cue1幫助才能與Ubc7發(fā)生相互作用的Hrd1蛋白不同，gp78蛋白除了環(huán)指結(jié)構(gòu)域之外還具有G

48、2BR結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域可以與UBE2G2進(jìn)行結(jié)合，因此可以直接招募酵母細(xì)胞中Ubc7蛋白的同系物E2 UBE2G2蛋白，即E2結(jié)合酶E2G2。在gp78蛋白的底物蛋白中有一個(gè)底物是1抗胰蛋白酶的變異體Pi Z蛋白，還有T細(xì)胞受體orphan亞單位，比如TCR和Cd3等。而且，gp78蛋白還能泛素化修飾HMG-CoA還原酶，這說(shuō)明ERAD系統(tǒng)在固醇代謝途徑中的作用非常保守。gp78蛋白還有另一個(gè)具有非常重要醫(yī)療價(jià)值的底物，即KAI1蛋白，該蛋白具有四個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，能夠抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。如果通過(guò)siRNA降低gp78蛋白的表達(dá)水平，會(huì)增加細(xì)胞內(nèi)KAI1蛋白的含量，降低腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。Doa10蛋白

49、在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中最有可能的同系物就是TEB4蛋白。這兩種蛋白都有相同的跨膜結(jié)構(gòu)域和N末端的指環(huán)結(jié)構(gòu)域。不過(guò)TEB4蛋白可以使其自身泛素化，但是我們還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)它的底物蛋白。除了這些與酵母細(xì)胞連接酶相似的連接酶之外，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中還存在一些酵母細(xì)胞中沒(méi)有的ERAD連接酶。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中有一種名為攜帶有膜錨定結(jié)構(gòu)的指環(huán)蛋白1（RING-finger protein with membrane anchor 1，RMA1），該蛋白是一種在擬南芥（Arabidopsis）到人類(lèi)中都廣泛存在、非常保守的泛素連接酶。RMA1蛋白能與UBE2J1蛋白相互作用，如果過(guò)表達(dá)RMA1蛋白會(huì)降低細(xì)胞內(nèi)囊性纖維化病跨膜傳導(dǎo)

50、調(diào)節(jié)蛋白（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR）的水平。RMA1蛋白最主要的作用是在CFTR蛋白翻譯過(guò)程中或翻譯剛剛完成之后檢測(cè)CFTR蛋白N末端結(jié)構(gòu)域的折疊情況。翻譯完成之后，胞質(zhì)內(nèi)的E3連接酶CHIP蛋白會(huì)促使RMA1蛋白解離，繼續(xù)檢測(cè)CFTR蛋白的折疊情況。CHIP蛋白含有一在結(jié)構(gòu)上與指環(huán)結(jié)構(gòu)域非常類(lèi)似的U盒子（U-box）結(jié)構(gòu)域，它是一三角形四肽（tetratricopeptide）重復(fù)結(jié)構(gòu)域，能與Hsp70蛋白和Hsp90蛋白發(fā)生相互作用。CHIP蛋白這種能與分子伴侶蛋白和泛素連接酶蛋白相結(jié)合的活性表明CHI

51、P蛋白能監(jiān)控Hsp70蛋白介導(dǎo)的蛋白折疊過(guò)程，并能降解那些發(fā)生了不可逆的錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)。另一個(gè)能與RMA1蛋白發(fā)生相互作用的蛋白是B細(xì)胞受體相關(guān)蛋白31（B-cell receptor-associated protein 31，BAP31）。BAP31蛋白是一種膜內(nèi)在蛋白質(zhì)（integral membrane protein），它也參與了對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)膜蛋白的分選工作。BAP31蛋白能與Sec61孔蛋白、E3連接酶RMA1蛋白、Derlin-1蛋白等發(fā)生相互作用。如果通過(guò)siRNA技術(shù)抑制BAP31蛋白的表達(dá)則能夠穩(wěn)定CFTR蛋白，BAP31蛋白還能起到分子伴侶的作用，幫助新合成的CFTR蛋白

52、折疊，還能幫助區(qū)分各種不能由RMA1蛋白折疊以及由Derlin-1蛋白降解的變異蛋白。泛素連接酶蛋白的變異體蛋白Parkin與青少年帕金森氏病（juvenile Parkinsons disease）有關(guān)。如果表達(dá)缺陷型的Parkin蛋白可以導(dǎo)致Pael-R蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中聚集，繼而導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元變性，形成帕金森氏病。在體外，Parkin蛋白可以泛素化修飾Pael-R蛋白，不過(guò)效率非常低，但是在CHIP蛋白的幫助下可以大大提高此泛素化修飾效率。胞質(zhì)內(nèi)的SCF復(fù)合體是由Skp1蛋白、Cul1蛋白、Roc1蛋白（又名Rbx1蛋白）以及F-Box等蛋白組成的泛素連接酶復(fù)合體。在大量的F-Box蛋白

53、中有兩個(gè)蛋白能夠決定SCF連接酶的底物特異性，這兩個(gè)蛋白是神經(jīng)元特異性的蛋白Fbs1和Fbs2，它們都是能夠識(shí)別糖基側(cè)鏈的F-Box蛋白。Fbs1蛋白和Fbs2蛋白都含有糖基化位點(diǎn)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，能與N連接聚糖分子中最內(nèi)側(cè)的糖基化位點(diǎn)相結(jié)合。我們目前還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)SCF復(fù)合體的底物，但它們可以清除那些可能是從經(jīng)典的ERAD途徑中“逃脫”的糖蛋白胞質(zhì)溶膠或者是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脂質(zhì)雙分子膜破裂時(shí)“泄露”出來(lái)的糖蛋白。3.4 跨越內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)在折疊發(fā)生錯(cuò)誤的蛋白質(zhì)被泛素化修飾以及降解之前，它們必須能夠跨越內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)。這種外向轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程包括轉(zhuǎn)位（dislocation）和逆移位（retrotranslocation）

54、兩種過(guò)程。但是我們現(xiàn)在還不清楚蛋白質(zhì)是如何被轉(zhuǎn)運(yùn)出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的，可能是通過(guò)Sec61易位子（translocon）以一種類(lèi)似于轉(zhuǎn)入過(guò)程（import process）的方式來(lái)完成的，也可能是通過(guò)形成脂質(zhì)小體（lipid droplet）的方式來(lái)完成的。HRD連接酶將發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜兩側(cè)的重要事件聯(lián)系了起來(lái)。這兩個(gè)重要事件分別是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)側(cè)發(fā)生的底物蛋白募集事件和在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)胞質(zhì)側(cè)發(fā)生的底物蛋白質(zhì)泛素化修飾事件。因此，底物蛋白質(zhì)的外向運(yùn)輸事件可能是通過(guò)連接酶中的某種“管道”完成的?？赡蹾RD復(fù)合體本身就能將異常的蛋白質(zhì)“排出”到胞質(zhì)當(dāng)中。與HRD連接酶共同發(fā)揮作用的還有Derlin家族蛋白，這些Derl

55、in家族蛋白也是最有可能起到轉(zhuǎn)運(yùn)作用的蛋白質(zhì)。有3個(gè)Derlin家族蛋白與酵母Der1蛋白具有一定程度的同源性，這3個(gè)蛋白可以一起組成異源復(fù)合體，同時(shí)MHC I類(lèi)重鏈分子也參與了該復(fù)合體的形成。Derlin-1蛋白能與HCMV病毒的US11蛋白發(fā)生相互作用。當(dāng)我們使用抑制劑抑制蛋白酶體活性的時(shí)候，我們發(fā)現(xiàn)Derlin-1蛋白與去糖基化的重鏈分子結(jié)合在一起。而胞質(zhì)中的N聚糖酶（N-glycanase）能去除掉MHC I類(lèi)重鏈分子上的糖基化位點(diǎn)。因此，Derlin-1蛋白肯定是在重鏈分子被轉(zhuǎn)運(yùn)至胞質(zhì)中之后或者在轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程之中才與其結(jié)合的。我們還發(fā)現(xiàn)具有各種不同功能的ATP酶，比如AAA+-ATPas

56、e p97蛋白（即酵母細(xì)胞中的Cdc48蛋白）等能夠與Derlin-1蛋白和Derlin-2蛋白發(fā)生相互作用，這也都說(shuō)明Derlin蛋白能夠起到轉(zhuǎn)運(yùn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中異常蛋白的作用。我們?cè)谙旅孢€將討論到，Cdc48蛋白能促使ERAD系統(tǒng)底物錨定到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。Derlin-1蛋白不參與US2蛋白介導(dǎo)的重鏈分子降解過(guò)程，因此它可能還會(huì)起到其他的作用，或者在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中還存在其他的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。3.5 底物蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)上釋放出來(lái)并被降解破壞異常蛋白穿越內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的過(guò)程需要有一種“力”來(lái)指引轉(zhuǎn)運(yùn)的方向。而且，底物蛋白必須從膜結(jié)構(gòu)中釋放出來(lái)才能進(jìn)入蛋白酶體。轉(zhuǎn)運(yùn)和釋放過(guò)程都需要能量，而且這兩個(gè)過(guò)程可能是偶聯(lián)在一起

57、的。還有一部分能量需要參與底物蛋白的泛素化修飾過(guò)程，該過(guò)程也是底物蛋白易位的先決條件。另一個(gè)需要能量的過(guò)程是由Cdc48蛋白（在人類(lèi)細(xì)胞中是p97蛋白）介導(dǎo)的。Cdc48蛋白這種AAA ATP酶可以形成同源六聚體（homohexamers），在泛素蛋白融合降解蛋白1（ubiquitin fusion degradation 1，Ufd1）和核定位蛋白4（nuclear protein localization 4，Npl4）等輔助因子的共同作用下使異常蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上解離下來(lái)。不過(guò)這其中的具體分子機(jī)制我們暫時(shí)還不清楚。根據(jù)“分子鉗（molecular ratchet）”模型，ATP水解循環(huán)可以

58、導(dǎo)致Cdc48蛋白復(fù)合體內(nèi)部構(gòu)象改變，從而促使結(jié)合在p97蛋白N末端的底物蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上釋放下來(lái)。而另一種模型則認(rèn)為，在Cdc48蛋白復(fù)合體富含精氨酸的環(huán)狀結(jié)構(gòu)形成的富含胍基（guanidyl）的環(huán)境中會(huì)產(chǎn)生一個(gè)“變性圈（denaturation collar）”結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)可以通過(guò)變性作用使蛋白打開(kāi)折疊。Cdc48蛋白復(fù)合體需要固定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上才能對(duì)底物蛋白施加作用。結(jié)果，Cdc48蛋白復(fù)合體以一種需要泛素化修飾底物蛋白的方式與膜錨定蛋白Ubx2的泛素蛋白調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域X（ubiquitin regulatory X，UBX）發(fā)生相互作用。在哺乳動(dòng)物中具有與Cdc48蛋白復(fù)合體類(lèi)似功能的蛋白可

59、能是UBXD2或ERASIN蛋白。當(dāng)?shù)孜锏鞍妆环核鼗揎棽膬?nèi)質(zhì)網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)上解離下來(lái)之后，它們會(huì)在輻射敏感蛋白23（radiation sensitive 23，Rad23）和Kar1蛋白抑制蛋白（ominant suppressor of Kar1，Dsk2）的作用下被轉(zhuǎn)運(yùn)至蛋白酶體。這些同源性適配體蛋白的C末端都具有泛素相關(guān)基序（ubiquitin-associated motif，UBA），能與多泛素蛋白鏈相結(jié)合，同時(shí)也在N端具有一泛素樣結(jié)構(gòu)域（ubiquitin-like domain，UBL），能指引適配體蛋白和底物蛋白進(jìn)入蛋白酶體，蛋白酶體可以通過(guò)Rpn10和Rpn13亞單位識(shí)別多泛素化修飾的底物蛋白。此外，Dsk2蛋白和Rad23蛋白還可能保護(hù)多泛素蛋白側(cè)鏈免遭泛素蛋白水解酶的降解作用。在這條經(jīng)典的途徑中，E3連接酶能多泛素化修飾底物。在酵母細(xì)胞中還有第二條途徑，底物蛋白首先在連接酶的作用下被單泛素化修飾或者被雙泛素化修飾，然后在U-Box蛋白Ufd2和Cdc48蛋白的作用下延長(zhǎng)泛素鏈。Cdc48蛋白能限制Ufd2蛋白對(duì)泛素鏈的延長(zhǎng)作用，因?yàn)閁fd2蛋白能添加4至6個(gè)泛素蛋白