白血病患兒巨細(xì)胞病毒感染的PCR與抗原檢測(cè)方法比較

1、    白血病患兒巨細(xì)胞病毒感染的PCR 與抗原檢測(cè)方法比較        摘要：目的對(duì)不同種類(lèi)標(biāo)本應(yīng)用PCR檢測(cè)巨細(xì)胞病毒（cytomegalovirus，CMV）DNA，并與外周血白細(xì)胞CMV抗原檢測(cè)比較，以了解PCR方法在診斷白血病患兒活動(dòng)性CMV感染時(shí)的意義。方法實(shí)驗(yàn)組為31例白血病患兒，對(duì)照組為31例免疫功能正常兒童，兩組兒童的年齡、性別無(wú)差異。應(yīng)用PCR方法檢測(cè)血清、尿液和腦脊液CMV DNA，間接免疫熒光方法檢測(cè)外周血白細(xì)胞CMV抗原，ELISA方法檢

2、測(cè)血清抗CMV IgG。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組CMV感染率為100%（31/31例CMV IgG陽(yáng)性），對(duì)照組CMV感染率為83.9%（26/31例CMV IgG陽(yáng)性），兩者之間無(wú)差異（P=1）。實(shí)驗(yàn)組檢測(cè)CMV抗原，有9例陽(yáng)性且均發(fā)生了活動(dòng)性CMV感染，活動(dòng)性感染率為29.1%，對(duì)照組活動(dòng)性感染率為0%，兩者之間差異有非常顯著性（P=0.002）。與CMV抗原檢測(cè)相比，PCR方法檢測(cè)尿、血清和腦脊液CMV DNA診斷白血病兒童活動(dòng)性CMV感染的敏感性為(88.9100)%，特異性為(68.281.8)%。結(jié)論白血病患兒易發(fā)生活動(dòng)性CMV感染。在診斷CMV感染時(shí)，應(yīng)用PCR方法檢測(cè)CMV DNA的敏感性較

3、高，但要注意區(qū)分活動(dòng)性感染和潛伏性感染。關(guān)鍵詞：巨細(xì)胞病毒； 白血?。?抗原，病毒； 聚合酶鏈反應(yīng)Cytomegalovirus infection in children with leukemia: PCR assay for detecting CMV-DNA and CMV antigenemia assayAN Jing（Virology Laboratory, Pediatric Research Institute, Beijing Children's Hospital, The Capital University of Medical Sciences, Beiji

4、ng,P.R.China）SHEN Kunling（Virology Laboratory, Pediatric Research Institute, Beijing Children's Hospital, The Capital University of Medical Sciences, Beijing,P.R.China）WU Minyuan, et al（Virology Laboratory, Pediatric Research Institute, Beijing Children's Hospital, The Capital University of

5、Medical Sciences, Beijing,P.R.China）Abstract：ObjectiveTo evaluate the incidence and clinical course of CMV infection in leukemia children, and to compare PCR assay for detecting CMV DNA and antigenemia assay for detecting CMV antigen in peripheral blood leukocytes. MethodsTotally 31 leukemia childre

6、n and 31 immunocompetent children as a control group were involved in the study. PCR assay was used for detecting CMV DNA in serum, urine and cerebrospinal fluid, indirect immunofluorescence assay for detecting CMV antigen in peripheral blood leukocytes, and ELISA for detecting anti-CMV IgG. Results

7、Twenty-seven out of thirty-one leukemia children had anti-CMV IgG before chemotherapy. The rest 4 patients were found seroconverted after chemotherapy. CMV infection rate was 100% in leukemia children compared with 83.9%(26/31) in control group. There was no difference in CMV infection rate between

8、two groups (P=1). Active CMV infection was diagnosed in 29.1%(9/31) leukemia children while none in control group. Active CMV infection rate showed significant difference between two groups (P=0.002). The sensitivity and specificity of PCR for detecting CMV DNA in urine, serum and cerebrospinal flui

9、d versus the antigenemia assay were 88.9%-100% and 68.2%-81.8%, respectively. ConclusionsActivation of CMV infection in leukemia children are rather common. PCR assay on urine, serum and cerebrospinal fluid can be useful for diagnosing CMV infection for its high sensitivity, but it should be noticed

10、 that the active CMV infection and the latent CMV infection cannot be easily differentiated.Key words：Cytomegalovirus; Leukemia; Antigen, viral; Polymerase chain reaction巨細(xì)胞病毒（cytomegalovirus，CMV）主要對(duì)免疫抑制和缺陷者致病，常引起多種臨床癥狀，死亡率高。白血病患兒由于疾病本身以及化療和輸血等因素，易發(fā)生活動(dòng)性CMV感染1。由于預(yù)防性治療可有效控制免疫損害病人活動(dòng)性CMV 感染的發(fā)生率和嚴(yán)重性2，因此早

11、期診斷活動(dòng)性CMV感染就顯得尤為重要。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR ）技術(shù)已廣泛用于診斷CMV感染。這一技術(shù)簡(jiǎn)便、快速，適用于多種標(biāo)本。但CMV感染有一主要特點(diǎn)是潛伏感染的存在，病毒在原發(fā)感染之后，常潛伏于宿主體內(nèi)，檢測(cè)到CMV DNA不易區(qū)分潛伏性感染和活動(dòng)性感染，給臨床監(jiān)測(cè)和治療病人帶來(lái)困難3。本研究對(duì)白血病患兒進(jìn)行觀察，應(yīng)用PCR技術(shù)檢測(cè)患兒尿液、血清和腦脊液CMV DNA，并同時(shí)與外周血白細(xì)胞CMV抗原檢測(cè)相比較，以了解PCR技術(shù)檢測(cè)不同標(biāo)本CMV DNA對(duì)活動(dòng)性CMV感染的診斷意義。材料與方法研究對(duì)象：共觀察1997年3月1日10月31日期間收治于北京兒童醫(yī)院血液病房的初診為白血病的31例患

12、兒。年齡212歲，<3歲者有7例，36歲8例，612歲16例。男孩16例，女孩15例。25例患急性淋巴細(xì)胞性白血?。╝cute lymphoblastic leukemia，ALL）； 2 例患急性髓細(xì)胞性白血?。╝cute myeloblastic leukemia，AML）；4例患淋巴肉瘤白血?。╨ymphosarcoma）。對(duì)照組為31例免疫功能正常的兒童（19例脊柱側(cè)彎和其他骨科疾患兒童及12例急性支氣管炎患兒），兩組兒童的年齡、性別均無(wú)差異。標(biāo)本收集：根據(jù)白血病患兒的化療方案4，分別于新入院尚未接受免疫抑制劑治療時(shí)、誘導(dǎo)緩解期治療結(jié)束時(shí)和庇護(hù)所治療期結(jié)束時(shí)取標(biāo)本各1次。另外，當(dāng)

13、患兒出現(xiàn)持續(xù)高熱（>39）1 w，肺炎，黃疸、肝腫大、肝區(qū)疼痛、 肝功能異常及肝炎，皮疹或與化療不相符合的嚴(yán)重粒細(xì)胞缺乏癥1時(shí)加取標(biāo)本1次。每個(gè)患兒共取標(biāo)本3次或更多。每次取尿液、血清、腦脊液和抗凝血（提取白細(xì)胞）各1份。對(duì)照組兒童中骨科疾患兒童在新入院未接受治療前取標(biāo)本1次，急性支氣管炎患兒在疾病好轉(zhuǎn)，即將出院前取標(biāo)本1次，每次取尿液、血清和抗凝血（提取白細(xì)胞）各1份。PCR方法檢測(cè)CMV DNA：選用CMV即刻早期基因（immediate-early gene）來(lái)設(shè)計(jì)引物，引物序列為：引物1：5-GTGACCAAGGCCACGACGTT-3，引物2：5-CTGCCAGGACATCTT

14、TCTC-3，擴(kuò)增產(chǎn)物為167bp5（由京師公司開(kāi)發(fā)）。主要步驟包括：1.標(biāo)本預(yù)處理：取尿液、血清或腦脊液25l，加25l裂解液（含2.5%NP40和1.0%-巰基乙醇水溶液），100水浴10 min，15 000r/min 10 min，取上清備用。2.PCR擴(kuò)增條件：取2.6l 10×buffer（含500mmol/L KCl、100mmol/L Tris-HCl, pH 8.3、15mmol/L MgCl2和0.01%明膠），加入dNTP，使每種dNTP 的終濃度為 2mmol/L，再加入引物，使每種引物的終濃度為 100pmol/L，加雙蒸水至23l ，組成PCR反應(yīng)混合物，

15、加Taq酶1U，加預(yù)處理的標(biāo)本上清（或陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照）2l，使反應(yīng)總體積為26l，混勻后加2滴石蠟油，使兩界面清晰，置入PCR儀，按下列條件擴(kuò)增：94 30 s，55 30 s，72 30 s，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)。3.結(jié)果判定：取擴(kuò)增后的 PCR產(chǎn)物10l加樣于2%瓊脂糖凝膠上，電泳（由陰極至陽(yáng)極）至24cm處。紫外燈下觀察，167bp處出現(xiàn)光帶者判為陽(yáng)性（見(jiàn)1）1PCR檢測(cè)CMV DNA的結(jié)果Fig 1. The results of PCR assay for CMV DNA detection1. Marker（from top to bottom:1000 bp，750 bp，500

16、bp，300 bp，150 bp，50 bp）;2.Positive control; 3.Negative control; 4.Positive CSF sample; 5.Negative CSF sample 外周血白細(xì)胞CMV IEA檢測(cè)：間接免疫熒光法檢測(cè)外周血白細(xì)胞CMV即刻-早期抗原（immediate-early antigen，IEA）。抗CMV IEA單抗購(gòu)于美國(guó)杜邦公司，為針對(duì)72 000U的CMV IEA的單抗。異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的第二抗體（羊抗鼠IgG）購(gòu)于華美公司。經(jīng)棋盤(pán)滴定法確定CMV單抗的稀釋度為116，二抗的稀釋度為120 。陽(yáng)性對(duì)照片為CMV

17、AD 169 株感染的人胚肺成纖維細(xì)胞涂片，陰性細(xì)胞片為未接種CMV的人胚肺成纖維細(xì)胞涂片，均由北京生物制品研究所病毒室提供。具體實(shí)驗(yàn)方法參考Bein G等6文獻(xiàn)所述而制訂。間接法ELISA檢測(cè)CMV IgG：本研究采用德國(guó)Human公司出售的檢測(cè)血清CMV IgG的ELISA試劑盒，具體方法略。診斷標(biāo)準(zhǔn)：CMV感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考1994年全國(guó)小兒巨細(xì)胞病毒感染學(xué)術(shù)會(huì)議通過(guò)的“巨細(xì)胞病毒感染診斷試行標(biāo)準(zhǔn)”7而制訂?；顒?dòng)性CMV感染：各實(shí)驗(yàn)室檢查中，病毒抗原檢測(cè)為陽(yáng)性，伴有或不伴有其它檢測(cè)陽(yáng)性，且出現(xiàn)與CMV感染相關(guān)的臨床癥狀和體征，包括：持續(xù)高熱（>39）1周，肺炎，黃疸、肝腫大、肝區(qū)疼

18、痛、肝功能異常及肝炎，皮疹或與化療不相符合的嚴(yán)重粒細(xì)胞缺乏癥1。結(jié)果1.白血病患兒的CMV感染狀況：實(shí)驗(yàn)組兒童在接受化療前共有27/31例抗CMV IgG檢測(cè)為陽(yáng)性，另4/31例接受化療后出現(xiàn)抗CMV IgG轉(zhuǎn)陽(yáng)，CMV感染率為100%。對(duì)照組有26/31例抗CMV IgG為陽(yáng)性，CMV感染率為83.9%，兩者之間經(jīng)2檢驗(yàn)差異無(wú)顯著性 （2=0，P=1）。實(shí)驗(yàn)組兒童有9例診斷為活動(dòng)性CMV感染，感染率為29.1%，對(duì)照組無(wú)1例出現(xiàn)活動(dòng)性CMV感染，感染率為0%。兩者之間經(jīng)2檢驗(yàn)差異有非常顯著性（2=8.319，P=0.002）。2.不同實(shí)驗(yàn)室方法的檢測(cè)結(jié)果：表1列舉了對(duì)白血病患兒和對(duì)照組兒童應(yīng)

19、用免疫熒光方法檢測(cè)CMV抗原、PCR 方法檢測(cè) CMV DNA和ELISA方法檢測(cè)血清CMV IgG的結(jié)果。其中，有9/31例白血病患兒在觀察期間CMV抗原檢測(cè)為陽(yáng)性，且均發(fā)生活動(dòng)性CMV感染，表現(xiàn)為多種上述臨床疾病，且表現(xiàn)對(duì)抗生素治療無(wú)效。對(duì)照組兒童無(wú)1例CMV抗原檢測(cè)為陽(yáng)性。表1對(duì)白血病患兒和對(duì)照組患兒應(yīng)用不同方法檢測(cè)CMV的結(jié)果Table 1. The results of CMV detection with different methods in leukemia and control patientsGroupCase number of patients positive b

20、yCMV-AgdetectionUrine CMVPCRSerum CMVPCRCSF CMVPCRSerologyLeukemia916151231Control031-26檢測(cè)白血病患兒血清CMV DNA，共有15例陽(yáng)性，與CMV抗原檢測(cè)相一致的有8例。其余7例中，4例患兒在觀察期間出現(xiàn)發(fā)熱，2例合并肺炎、1例合并肝功能異常，這4例患兒在觀察期間CMV抗原檢測(cè)始終為陰性，但在血清、尿液和腦脊液中均檢測(cè)出CMV DNA；其余3例陽(yáng)性患兒僅1次檢測(cè)血清CMV DNA為陽(yáng)性，其它檢測(cè)（包括CMV抗原、尿液和腦脊液CMV DNA檢測(cè)）均為陰性，臨床未出現(xiàn)上述疾病表現(xiàn)。對(duì)照組兒童有1例血清CMV D

21、NA檢測(cè)為陽(yáng)性，同時(shí)CMV IgG檢測(cè)陽(yáng)性，無(wú)其它檢測(cè)陽(yáng)性，無(wú)相應(yīng)臨床感染表現(xiàn)。檢測(cè)白血病患兒尿液CMV DNA，共有16例陽(yáng)性。與CMV抗原檢測(cè)相一致的有9例。其余7例中，4例患兒在觀察期間出現(xiàn)上述感染表現(xiàn)（詳見(jiàn)血清CMV DNA檢測(cè)結(jié)果）；其余3例陽(yáng)性患兒僅1次檢測(cè)尿液CMV DNA為陽(yáng)性，其它檢測(cè)（包括CMV抗原、血清和腦脊液CMV DNA檢測(cè)）均為陰性，臨床未出現(xiàn)上述疾病表現(xiàn)。對(duì)照組兒童有3例尿液CMV DNA檢測(cè)為陽(yáng)性，均為CMV IgG陽(yáng)性者，無(wú)其它檢測(cè)陽(yáng)性，無(wú)相應(yīng)臨床感染表現(xiàn)。檢測(cè)白血病患兒腦脊液CMV DNA，共有12例陽(yáng)性。與CMV抗原檢測(cè)相一致的有8例。其余4例患兒在觀察期

22、間出現(xiàn)上述感染表現(xiàn)（詳見(jiàn)血清CMV DNA檢測(cè)結(jié)果）。對(duì)照組兒童未檢測(cè)腦脊液標(biāo)本。如表2所示，以外周血白細(xì)胞CMV抗原檢測(cè)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，衡量PCR方法在診斷白血病患兒活動(dòng)性CMV感染時(shí)的敏感性和特異性。其中，PCR方法檢測(cè)尿液CMV DNA在診斷白血病患兒活動(dòng)性CMV感染時(shí)的敏感性為100%（9/9），特異性為68.2%（15/22）；血清CMV DNA檢測(cè)的敏感性為88.9%（8/9），特異性為68.2%（15/22）；腦脊液CMV DNA檢測(cè)的敏感性為88.9%（8/9），特異性為81.8%（18/22）。 表2應(yīng)用間接免疫熒光方法檢測(cè)CMV抗原和應(yīng)用PCR方法檢測(cè)CMV DNA的結(jié)果比較T

23、able 2. Comparison between the results of indirect immunofluoresence(IIF) assay for CMV Ag detection and PCR assay for CMV DNA detection IIF assay forCMV AgdetectionPCR assayCMV DNAin urineCMV DNAin serumCMV DNAin CSF+-+-+-+9908181-22715715418Account1615151612193.不同檢測(cè)方法陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)的時(shí)間與臨床疾病的關(guān)系：9例活動(dòng)性CMV感染患兒

24、中，有5例在出現(xiàn)臨床表現(xiàn)前CMV抗原檢測(cè)即表現(xiàn)為陽(yáng)性（-30 d-5 d，平均為-11 d），在出現(xiàn)臨床表現(xiàn)后30 d，9例患兒CMV抗原檢測(cè)均轉(zhuǎn)為陰性。此時(shí)，患兒的臨床疾病已好轉(zhuǎn)。9例患兒中的7例在出現(xiàn)臨床表現(xiàn)前尿液CMV DNA檢測(cè)為陽(yáng)性（-30 d-2 d，平均為-21 d），在出現(xiàn)臨床表現(xiàn)后70 d，仍有4例患兒尿液CMV DNA檢測(cè)為陽(yáng)性。此時(shí)，患兒的臨床疾病均已好轉(zhuǎn)。9例患兒均在出現(xiàn)臨床表現(xiàn)后血清CMV DNA檢測(cè)才出現(xiàn)陽(yáng)性（最早1例為+5 d），在出現(xiàn)臨床表現(xiàn)后70 d，仍有1例患兒血清CMV DNA檢測(cè)為陽(yáng)性。此時(shí)，患兒的臨床疾病均已好轉(zhuǎn)。9例患兒中僅1例在出現(xiàn)臨床表現(xiàn)前7 d

25、腦脊液CMV DNA檢測(cè)為陽(yáng)性，在出現(xiàn)臨床表現(xiàn)后60 d，仍有1例患兒腦脊液CMV DNA檢測(cè)為陽(yáng)性。此時(shí)，患兒的臨床疾病已好轉(zhuǎn)。4.不同實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法的相關(guān)性：本研究中對(duì)白血病患兒連續(xù)觀察3個(gè)月以上，2列舉了化療不同時(shí)期應(yīng)用免疫熒光方法檢測(cè)CMV抗原和PCR方法檢測(cè)CMV DNA的結(jié)果。CMV抗原檢測(cè)、尿液CMV DNA檢測(cè)、血清CMV DNA檢測(cè)和腦脊液CMV DNA檢測(cè)的結(jié)果在總體趨勢(shì)上呈一致性，均表現(xiàn)為誘導(dǎo)緩解治療期陽(yáng)性檢出率最高，這一時(shí)期活動(dòng)性CMV感染的發(fā)生也最多（共有7例發(fā)生）。除尿液CMV DNA檢測(cè)在用藥前陽(yáng)性率偏高外，其它檢測(cè)均呈現(xiàn)一致的變化。2化療不同時(shí)期應(yīng)用不同方法檢測(cè)

26、CMV為陽(yáng)性的結(jié)果Fig 2. The results of CMV detection with different methods during different periods of chemotherapy討論白血病患兒由于疾病本身及接受免疫抑制劑治療造成免疫力低下，易發(fā)生活動(dòng)性CMV感染1。本研究中共有29.1%(9/31例)表現(xiàn)為活動(dòng)性CMV感染，與已往對(duì)骨髓移植8等免疫抑制和缺陷病人的研究結(jié)果是一致的。就目前的研究而言，各種不同的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)在診斷活動(dòng)性CMV 感染時(shí)各有優(yōu)缺點(diǎn)。外周血白細(xì)胞CMV抗原檢測(cè)是目前較為公認(rèn)的診斷活動(dòng)性CMV感染的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)，其技術(shù)簡(jiǎn)便、費(fèi)時(shí)少、可

27、定量檢測(cè)、診斷的敏感性和特異性都很高9。自1985年P(guān)CR技術(shù)問(wèn)世以來(lái)，已得到廣泛的應(yīng)用。對(duì)不同種類(lèi)的標(biāo)本，如：尿液、血清、腦脊液等，檢測(cè)CMV DNA在診斷活動(dòng)性CMV感染時(shí)的意義已有許多報(bào)道。這一技術(shù)簡(jiǎn)便、快速、適用于多種標(biāo)本，但由于不能區(qū)分潛伏性感染和活動(dòng)性感染，對(duì)臨床診斷活動(dòng)性CMV感染有一定的局限性。本研究中共有16例白血病患兒在觀察期間尿液CMV DNA陽(yáng)性，但僅有9例出現(xiàn)活動(dòng)性感染，其診斷活動(dòng)性CMV感染的特異性?xún)H為68.2%，敏感性卻100%，說(shuō)明發(fā)生活動(dòng)性CMV感染的白血病患兒常出現(xiàn)尿液排毒。比較CMV抗原檢測(cè)和尿液、血清及腦脊液CMV DNA檢測(cè)，結(jié)果表明不同實(shí)驗(yàn)室方法，不

28、同標(biāo)本在檢測(cè)結(jié)果上一致率較高。對(duì)于發(fā)生活動(dòng)性CMV感染的患兒，除CMV抗原檢測(cè)為陽(yáng)性外，均伴有不同標(biāo)本CMV DNA的陽(yáng)性。由此表明，活動(dòng)性CMV感染時(shí)會(huì)出現(xiàn)病毒尿癥、病毒血癥，并可能侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)。因此，如果用PCR方法從多處檢測(cè)出CMV DNA則更支持活動(dòng)性CMV感染的診斷。此外，本研究中有4例患兒在觀察期間出現(xiàn)發(fā)熱、肺炎和肝功能異常等CMV感染常見(jiàn)的臨床表現(xiàn)，這4例患兒在觀察期間CMV抗原檢測(cè)始終為陰性，但在血清、尿液和腦脊液中均檢測(cè)出CMV DNA，這是否提示CMV抗原檢測(cè)在診斷活動(dòng)性CMV感染時(shí)存在一定的假陰性？而多處標(biāo)本的CMV DNA陽(yáng)性可用于明確診斷活動(dòng)性CMV感染？從預(yù)測(cè)活

29、動(dòng)性CMV感染的時(shí)間來(lái)看，CMV抗原檢測(cè)有其優(yōu)越性，可在活動(dòng)性感染出現(xiàn)臨床表現(xiàn)前數(shù)日至數(shù)周即為陽(yáng)性。尿液CMV DNA檢測(cè)為陽(yáng)性，由于不能排除潛伏性感染時(shí)的排毒，對(duì)臨床的指導(dǎo)意義較差。血清和腦脊液CMV DNA陽(yáng)性出現(xiàn)較晚，多在臨床出現(xiàn)感染表現(xiàn)之后，一般而言，只有當(dāng)CMV大量復(fù)制并播散，才可在血清和腦脊液中檢測(cè)出來(lái)，這一點(diǎn)與本研究的結(jié)果是一致的?？傊?，白血病患兒易發(fā)生活動(dòng)性CMV感染，其臨床表現(xiàn)多樣。對(duì)接受化療的白血病患兒應(yīng)密切監(jiān)測(cè)CMV感染。目前尚無(wú)明確的診斷活動(dòng)性CMV感染的實(shí)驗(yàn)室方案。應(yīng)用PCR方法檢測(cè)CMV DNA診斷活動(dòng)性CMV感染的敏感性較高，但特異性尚不理想。由于不能區(qū)分活動(dòng)性和

30、潛伏性CMV感染，不應(yīng)根據(jù)單一的CMV DNA陽(yáng)性結(jié)果來(lái)診斷活動(dòng)性CMV感染。但這一方法操作簡(jiǎn)便、快速，適用于尿液、血清和腦脊液等多種標(biāo)本，適合臨床實(shí)驗(yàn)室推廣。發(fā)生活動(dòng)性CMV感染的患兒多出現(xiàn)尿液、血清和腦脊液等多部位的排毒，因此，對(duì)多部位檢測(cè)CMV DNA，綜合分析檢測(cè)結(jié)果，如同時(shí)從多部位標(biāo)本中檢測(cè)出CMV DNA，則比較支持活動(dòng)性CMV感染的診斷。作者單位：安菁（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院兒科研究所病毒室）申昆玲（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院兒科研究所病毒室）吳敏媛（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院兒科研究所病毒室）江載芳（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院兒科研究所病毒室）參考文獻(xiàn)：1Rokic

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