蛋白純化和GST沉降技術(shù)

1、蛋白純化和GST沉降技術(shù)【原理】細(xì)菌表達(dá)的谷胱甘肽s轉(zhuǎn)移酶（GST）融合蛋白主要用于蛋白的親和純化，也可以將GST融合蛋白作為探針，與溶液中的特異性搭檔蛋白結(jié)合，然后根據(jù)谷胱甘肽瓊脂糖球珠能夠沉淀GST融合蛋白的能力來(lái)確定相互作用的蛋白。一般在得到目標(biāo)蛋白的抗體前，或發(fā)現(xiàn)抗體干擾蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)之間的相互作用時(shí)，可以啟用GST沉降技術(shù)。該方法只是用于確定體外的相互作用?！緫?yīng)用】1）確定融合（或探針）蛋白與未知（或靶）蛋白間的新的相互作用2）證實(shí)探針蛋白與已知蛋白質(zhì)間可疑的相互作用【方法】一、GST融合蛋白的純化1、菌種的活化：按1%的量在螺旋管中活化所需菌種，一般50ul的凍存菌接入5ml的LB

2、中，37C220rpm培養(yǎng)2、活化的菌種轉(zhuǎn)接1%接種于5mlLB中，37C220rpm培養(yǎng)至Ot>0.4-0.6之問(wèn)，即到達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)時(shí)期（大約34小時(shí)）3、取1ml菌液測(cè)定Ogg,至O>0.40.6之間，則取誘導(dǎo)前1ml,其余的按1/1000加入誘導(dǎo)劑IPTG，低溫小量誘導(dǎo)30C200rpm，誘導(dǎo)過(guò)夜（小于16hr）4、次日取誘導(dǎo)后1ml,誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后各1ml,12000rpm,離心2mins,棄上清，加適量的1*PBS,重懸菌液，再加1*loadingbuffer,混勻，沸水煮10mins,12000rpm,離心2mins,SDS-PAGE電泳考馬氏亮蘭染色5、如果考染結(jié)果顯示

3、GST融合蛋白（GST-X）誘導(dǎo)出來(lái)，則做大量誘導(dǎo)6、菌種活化后按1%轉(zhuǎn)接種于100mlLB中，30C200rpm擴(kuò)大培養(yǎng)至OK0.40.6之間，即到達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)時(shí)期（大約3小時(shí)）7、取1ml菌液測(cè)定ODfi,至OK0.40.6之間，按1/10000加入誘導(dǎo)劑IPTG,低溫誘導(dǎo)20C180rpm,制冷系數(shù)0.5,誘導(dǎo)過(guò)夜8、次日50ml離心管收菌，4c5000rpm5mins離心，每瓶100ml重復(fù)離心收于同一離心管中，大型離心機(jī)提前預(yù)冷9、每100ml菌液沉淀加入10mlA液重懸10、超聲破碎。大探頭，冰浴，頻率5-10o超聲23s停23s,1520次一個(gè)循環(huán)，重新混勻，冰探頭，至菌液清亮為止

4、11、超聲后的細(xì)菌裂解液加入到50ml干凈離心管中，4c11000rpm10mins離心12、平衡Agrose-beads.每個(gè)干凈EP管中加50ulAgrose-beads。再加1mlA液，4c旋轉(zhuǎn)23mins后4c3000rpm/600g5mins離心,吸棄上清，重復(fù)3次13、吸取菌液離心上清到50ml干凈離心管，將平衡好的Agrose-beads力口入4c旋轉(zhuǎn)4小時(shí)左右14、4C3000rpm/600g10mins離心。移液管吸棄上清，留有1ml左右時(shí)用移液器槍頭混勻X-GST-beads,轉(zhuǎn)移至1.5ml進(jìn)口EP管中，用A液反復(fù)洗50ml離心管多次至將全部珠子轉(zhuǎn)移至EP管中。3000r

5、pm/600g,5mins,離心，棄上清15、A液洗滌X-GST-beads,每次1m14c旋轉(zhuǎn)10mins后4c3000rpm/600g,5mins,離心,吸棄上清，重復(fù)3次16、 最后向X-GST-bead中加入100ulA液，4c保存17、 考染定量：取2ulGST-beads加入10ul1*loadingbuffer混勻，沸水煮樣10mins。12000rpm5mins離心后取上泊上樣（SDS-PAG丘下膠后，考馬氏亮蘭染色（新考染液23mins,舊的考染液1030mins）,脫色2h左右二、GSTPulldown1、轉(zhuǎn)染細(xì)胞24小時(shí)后，IPbuffer裂解，超聲破碎。大探頭，冰浴，頻

6、率510。超聲23s停23s,1520次一個(gè)循環(huán)，重新混勻，冰探頭，至菌液清亮為止，12000rpm,離心2mins,取上清作樣品，取部分作Input,剩下的作GSTPulldown2、根據(jù)定量結(jié)果取X-GST-beads加入到IPbuffer平衡，4c旋轉(zhuǎn)23mins后4c3000rpm/600g5mins離心，吸棄上清，重復(fù)3次。然后將平衡后的珠子于600ulcelllysis結(jié)合孵育4hS夜3、4C,3000rpm/600g,5mins離心后吸回裂解上清，IPbuffer洗珠子，4c旋轉(zhuǎn)10mins后，4c3000rpm/600g5mins離心,23次。最后用微量上樣器將全部IPbuff

7、er吸棄。4、向X-GST-beads其中力口入30ul1*loadingbuffer.細(xì)胞裂解液Input50ul中加入50ul2*loadingbuffer.沸水10mins。12000rpm5mins離心后取上清上樣進(jìn)行SDS-PAGE5、電泳后進(jìn)行WesternBlot來(lái)確定沉降的蛋白中是否有目的蛋白；也可以將膠考馬氏亮蘭染色觀察特異沉降的蛋白帶，進(jìn)一步做質(zhì)譜分析確定沉降的蛋白。【注意事項(xiàng)】1）該實(shí)驗(yàn)設(shè)立GST對(duì)照，反應(yīng)均在4cC進(jìn)行2）沸水煮樣以前的離心速度不要超過(guò)3000rpm,否則可能將beads離碎了。3）在檢測(cè)時(shí)如果發(fā)現(xiàn)GST對(duì)照組也有目的蛋白時(shí)，則表明有非特異的結(jié)合，這是我

8、們應(yīng)當(dāng)在GSTPulldown的第三步多洗幾次。4）GST對(duì)照蛋白的量和實(shí)驗(yàn)組的蛋白的應(yīng)該一樣，最好是對(duì)照的量比實(shí)驗(yàn)組的多一點(diǎn)【舉例】inputGSTy-gst+GSTpulldown驗(yàn)證兩種已知蛋白質(zhì)的相互作用inputGSTx-gstY-GFP+X-GFP*Y-GFPX-GFPAnti-GFPAnti-GFPIncubationwithCellLysateorProteinMixtureAntibodyCoupledResin.SpinandwashcT3EluteCoupledAntibody,AntigenJ；三二'二V5ProteinInteracting.withAntig

9、enAnalyze圖2免疫共沉淀（co-IP）示意圖（1）原理1）當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來(lái)。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X,那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來(lái)。這種方法常用于測(cè)定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合，也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔（圖2）02）缺點(diǎn)：可能檢測(cè)不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)相互作用（2）方法1）轉(zhuǎn)染后24-48h可收獲細(xì)胞，加入適量細(xì)胞裂解緩沖液（含蛋白酶抑制劑），冰上裂解30min,細(xì)胞裂解液于4°C,取少量裂解液以備Westernblot分析做Input,剩余的裂解液以最大轉(zhuǎn)

10、速離心10min后取上清，2）取10仙lproteinA瓊脂糖珠，用適量裂解緩沖液（一般1ML/管）平衡3次，每次3,000rpm離心5min,3）將預(yù)處理過(guò)的10仙lproteinA瓊脂糖珠加入到細(xì)胞裂解液中4°C緩慢搖晃孵育1h,進(jìn)行預(yù)沉淀。4）3000rpm離心后收集上清，將沉淀?xiàng)壢ィ锨鍌溆茫?）加1Ng相應(yīng)的抗體加入到4）的上清液中，4°C緩慢搖晃孵育1h（也可過(guò)夜），6）取10仙lproteinA/G瓊脂糖珠，用適量裂解緩沖液（一般1ML/管）平衡3次，每次3,000rpm離心5min,7）將預(yù)處理過(guò)的10履proteinA/G瓊脂糖珠加入到和抗體孵育過(guò)的細(xì)胞裂

11、解液中，4°C緩慢搖晃孵育2-4h,使抗體與proteinA/G瓊脂糖珠偶連，8）免疫沉淀反應(yīng)后，在4°C以3,000rpm速度離心5min,將瓊脂糖珠離心至管底。將上消小心吸去，瓊脂糖珠用1ml裂解緩沖液洗34次。最后加入15仙l-30膜的1XSDS上樣緩沖液，沸水煮10分鐘,9）SDS-PAGE,Westernblotting質(zhì)譜儀分析。（3）注意的問(wèn)題1）細(xì)胞裂解采用溫和的裂解條件，不能破壞細(xì)胞內(nèi)存在的所有蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)相互作用，多采用非離子變性劑（NP40或ThtonX-100）。每種細(xì)胞的裂解條件是不一樣的，通過(guò)經(jīng)驗(yàn)確定。一般如果相互作用很弱時(shí)可以考慮將鹽濃度盡量降低，同時(shí)可以考慮加入錢鏈劑。不能用高濃度的變性劑（0.2%SDS）,細(xì)胞裂解液中要加各種酶抑制劑，如商品化的cocktail。2）使用明確的抗體，可以將幾種抗體共同使用，抗體的用量參考抗體使用說(shuō)明書。3）使用對(duì)照抗體：?jiǎn)慰寺】贵w：正常小鼠