2022年大腸桿菌的培養(yǎng)

1、大腸桿菌種子液的制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方：液體培養(yǎng)基牛肉膏 3.0g蛋白胨 10.0g氯化鈉 5.0g水 1000ml固體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基的根底上再參加1.52.0的瓊脂1 試管斜面與平板的制備（1） 稱量 按培養(yǎng)基配方比例依次準確稱取蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉、瓊脂、水放入燒杯中。（2） 熔化 在上述燒杯中先參加少于所需要量的水，用玻璃棒攪勻，然后，在石棉網上加熱使其溶解，藥品完全溶解后，補充水到所需的總體積。將稱量好的1.8瓊脂放入已溶的藥品中，再加熱熔化，最后補充所損失的水分。（3） 調PH 在未調PH前，先用精細PH試紙測量培養(yǎng)基的原始PH，如果偏酸，用滴管向培養(yǎng)基中逐滴參加1mol

2、/L NaOH,邊加邊攪拌，并隨時用PH試紙測基PH直到PH到達。反之用1mol/L HCl進展調節(jié)。（4） 分裝 將培養(yǎng)基分裝入三個試管中和三角燒瓶中。其試管裝量不超過管高的1/5，三角燒瓶的量不超過1/2加塞 培養(yǎng)基分裝完畢后，在試管口和三角燒瓶口上塞上棉塞。（5） 包扎 加塞后，將全部試管用麻繩捆好，再在棉塞外包一層牛皮紙，其外再用一道麻繩扎好。用記號筆注明培養(yǎng)基名稱、配制日期。（6） 滅菌 將上述培養(yǎng)基以0.1Mpa,121,15min高壓蒸氣滅菌。（7） 倒平板 ，取三個已消毒的培養(yǎng)皿，在無菌操作臺上用三角燒瓶中的培養(yǎng)基倒制三個平板培養(yǎng)基，冷卻。（8） 擱置斜面 將滅菌的試管培養(yǎng)基冷

3、卻至50左右，將試管口端擱在玻璃棒上，擱置的斜面長度以不超過試管總長的一半為宜。2 接種大腸桿菌斜面種子(1) 取實驗室儲藏的大腸桿菌BL21種子， 在酒精燈附近，用接種環(huán)在已制備好的斜面上接種上大腸桿菌。 (2) 將接種好的斜面放入37的恒溫培養(yǎng)箱子中培養(yǎng)24h。3 制備平板種子 (1) 在無菌條件下，取一支保存的大腸桿菌的斜面，用無菌生理鹽水將菌種沖洗下來，再用無菌生理鹽水將其梯度稀釋為1倍，10倍，100倍和1000倍，用移液槍分別吸取各梯度的溶液涂布平板(每個梯度涂布三個平板，每次吸取溶液100ul)，然后在37培養(yǎng)箱中過夜。12 次日，挑取生長狀態(tài)好，特征明顯的單個菌落，接種于新鮮滅

4、菌的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中37，170r/min恒溫振蕩培養(yǎng)18h作種子培養(yǎng)液。其后的實驗中，每次實驗前從種子培養(yǎng)液中吸取2ml菌液接種于新鮮滅菌的液體培養(yǎng)基中，37，170r/min恒溫振蕩培養(yǎng)使用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 組成成分：牛肉膏 3g,蛋白胨 10g,Nacl 5g,瓊脂 1520g,水1000mL,PH7.47.6。 具體配置步驟： 1.稱藥品 按實際用量計算后,按配方稱取各種藥品放入大燒杯中.牛肉膏可放在小燒杯或外表皿中稱量,用熱水溶解后倒入大燒杯;也可放在稱量紙上稱量,隨后放入熱水中,牛肉膏使與稱量紙別離,立即取出紙片.蛋白胨極易吸潮,故稱量時要迅速. 2.加熱溶解 在燒杯中參

5、加少于所需要的水量,然后放在石棉網上,小火加熱,并用玻棒攪拌,待藥品完全溶解后再補充水分至所需量.假設配制固體培養(yǎng)基,那么將稱好的瓊脂放入己溶解的藥品中,再加熱融化,此過程中,需不斷攪拌,以防瓊脂糊底或溢出,最后補足所失的水分. 3. 調pH 檢測培養(yǎng)基的pH,假設pH偏酸,可滴加lmol/L NaOH,邊加邊攪拌,并隨時用pH試紙檢測,直至到達所需pH范圍.假設偏堿,那么用lmol/L HCl進展調節(jié).pH的調節(jié)通常放在加瓊脂之前.應注意pH值不要調過頭,以免回調而影響培養(yǎng)基內各離子的濃度. 4.過濾 液體培養(yǎng)基可用濾紙過濾,固體培養(yǎng)基可用4層紗布趁熱過濾,以利培養(yǎng)的觀察.但是供一般使用的培

6、養(yǎng)基,這步可省略. 5.分裝 按實驗要求,可將配制的培養(yǎng)基分裝入試管或三角瓶內.分裝時可用漏斗以免使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上而造成污染. 分裝量:固體培養(yǎng)基約為試管高度的l/5,滅菌后制成斜面.分裝入三角瓶內以不超過其容積的一半為宜.半固體培養(yǎng)基以試管高度的1/3為宜,滅菌后垂直待凝. 6.加棉塞 試管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脫脂棉)制作的棉塞.棉塞的形狀,大小和松緊度要適宜,四周緊貼管壁,不留縫隙,才能起到防止雜菌侵入和有利通氣的作用.要使棉塞總長約3/5塞入試管口或瓶口內,以防棉塞脫落.有些微生物需要更好的通氣,那么可用8層紗布制成通氣塞.有時也可用試管帽或塑料塞代替棉塞. 7.包扎

7、加塞后,將三角瓶的棉塞外包一層牛皮紙或雙層報紙,以防滅菌時冷凝水沾濕棉塞.假設培養(yǎng)基分裝于試管中,那么應以5支或7支在一起,再于棉塞外包一層牛皮紙,用繩扎好.然后用記號筆注明,培養(yǎng)基名稱,組別,日期. 8.滅菌 將上述培養(yǎng)基于121.3濕熱滅菌20min.如因特殊情況不能及時滅菌,那么應故入冰箱內暫存. 9.無菌檢查 將滅菌的培養(yǎng)基放入37溫箱中培養(yǎng)2448h,無菌生長即可使用,或貯存于冰箱或清潔的櫥內,備用. 大腸桿菌的培養(yǎng)： 37攝氏度，恒溫培養(yǎng)48到72小時，因為接種時和具體培養(yǎng)條件的不同，其生長一般都在2天外才能長出明顯的菌落。 菌落特征：乳白色，圓形，菌落邊緣整齊，外表光滑，外表和反

8、面顏色一致。 大腸桿菌 / 大腸菌群顯色培養(yǎng)基是青島海博生物公司改進的培養(yǎng)基，用于食品、水、牛奶、冰激凌和肉制品中大腸桿菌和大腸菌群的快速檢測。大腸桿菌顯藍色至紫色，大腸菌群顯紅色。 成份 (g/L) 特殊營養(yǎng)物質 28.19 混合顯色劑 0.31 瓊脂 13.0 pH 6.8 ± 0.2 25 此配方可以進展改進或增加營養(yǎng)成份以獲得最正確的結果。 注意 此培養(yǎng)基僅供實驗室使用。 用法 稱取本品 41.5g 參加 1000ml 蒸餾水，加熱溶解并不停攪拌，煮沸不要超過 1 分鐘。取 1ml 制備好的樣品液參加直徑為 9cm 無菌平皿中心，傾入冷卻至 45-50 培養(yǎng)基約 15ml ，

9、混勻，凝固后，再參加一層培養(yǎng)基進展履蓋?；蚶鋮s至 45-50 時，傾入無菌平皿，瓊脂完全凝固后，在 37 的培養(yǎng)箱中倒置放置 1-2 小時，參加適當稀釋度的樣品液 1ml ，涂布于培養(yǎng)基上， 36 ± 1 培養(yǎng) 18 24h 。 貯存 制備好的平板應立即使用，應防止光線直接照射?？菰锱囵B(yǎng)基應放置于陰暗枯燥處， 保存溫度 2-8 ，注意避光保存。失效 枯燥培養(yǎng)基超過保質期、結塊和顏色變化都不能使用。 操作步驟 1 、按國家標準、 SN 標準、 FDA 標準或其它方法制備樣品液 2 、取樣品液 1ml 參加 冷卻至 45-50 顯色培養(yǎng)基中混勻或 涂布于平板上 3 、 36 ±

10、 1 培養(yǎng) 18 24h ，選用有 30 200 個菌落的平板，計數平板上出現的典型大腸菌群和大腸桿菌菌落。大腸桿菌典型菌落為藍色至紫色，大腸菌群為粉紅色菌落，其它細菌為無色或黃色菌落。 總大腸菌群 = 藍色菌落 + 紫色菌落 + 粉紅色菌落 大腸桿菌 = 藍色菌落 + 紫色菌落 4 、對可疑大腸桿菌菌落可劃線接種到營養(yǎng)瓊脂平板上， 36 ± 1 培養(yǎng) 12-16 小時，挑取單菌落做大腸桿菌全套生化試驗 ( 本公司有生化鑒定管套裝 20 支 x3 種 ) 質量控制 1 、外觀 此枯燥培養(yǎng)基的粉末均勻，具有良好的流動性，呈淡紅色。制備好的平板呈透明粉紅色固體培養(yǎng)基。 2 、微生物試驗 在 36 ± 1 培養(yǎng) 18 24h 小時： 質控菌株 ATCC 生長情況 菌落顏色 單增李氏菌 27853 -/+ 無色 金黃色葡萄球菌 25923 -/+ 無色 大腸桿菌 25922 + 藍色 沙門氏菌 + 無色 大腸菌群 + 粉紅色 方法的局限性 本培養(yǎng)基鑒定 大腸菌群 / 大腸桿菌，少數情況下可能會出現假陽性，但不會出現假陰性，有時可能需做其它補充試驗。 典型特征大腸桿菌典型菌落為藍色至紫色，大腸菌群為粉