第二代高通量測(cè)序的三大巨頭比拼

1、第二代高通量測(cè)序的三大巨頭比拼(之一)第二代高通量測(cè)序準(zhǔn)確率，延長(zhǎng)度都明顯優(yōu)于第一代高通量測(cè)序，更重要的是，價(jià)格比第一代大幅度降低，使得高通量測(cè)序的產(chǎn)業(yè)化成為現(xiàn)實(shí)。第二代高通量測(cè)序儀的三大代表是Illumina公司的Solexa基因組分析儀(IlluminaGenomeAnalyzer),羅氏公司(Roche)的454測(cè)序儀(RochGSFLXsequencer)和ABI的SOLiD測(cè)序儀(ABISOLiDse-quencer)。摘要：第二代高通量測(cè)序準(zhǔn)確率，延長(zhǎng)度都明顯優(yōu)于第一代高通量測(cè)序，更重要的是，價(jià)格比第一代大幅度降低，使得高通量測(cè)序的產(chǎn)業(yè)化成為現(xiàn)實(shí)。一、Illumina公司的Sole

2、xa基因組分析儀Illumina公司的新一代測(cè)序儀GenomeAnalyzer最早由Solexa公司研發(fā)，利用其專利核心技術(shù)"DNA簇"和可逆性末端終結(jié)(reversibleterminator)”,實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化樣本制備及基因組數(shù)百萬(wàn)個(gè)堿基大規(guī)模平行測(cè)序。GenomeAnalyzer作為新一代測(cè)序技術(shù)平臺(tái)，具有高準(zhǔn)確性，高通量，高靈敏度，和低運(yùn)行成本等突出優(yōu)勢(shì)，可以同時(shí)完成傳統(tǒng)基因組學(xué)研究(測(cè)序和注釋)以及功能基因組學(xué)(基因表達(dá)及調(diào)控，基因功能，蛋白/核酸相互作用)研究。1、GenomeAnalyzer技術(shù)的基本原理：Solexa方法是利用單分子陣列測(cè)試genotyping,

3、此種測(cè)序法首先將DNA從細(xì)胞中提取，然后將其打斷到約100200bp大小，再將接頭連接到片段上，經(jīng)PCR擴(kuò)增后制成Library。隨后在含有接頭的芯片(flowcell)上將已加入接頭的DNA片段綁定在flowcell上，經(jīng)反應(yīng)，將不同片段擴(kuò)增。在下一步反應(yīng)中，四種熒光標(biāo)記的染料應(yīng)用邊合成邊測(cè)序的原理，在每個(gè)循環(huán)過(guò)程里，熒光標(biāo)記的核昔和聚合酶被加入到單分子陣列中。互補(bǔ)的核昔和核甘酸片斷的第一個(gè)堿基配對(duì)，通過(guò)酶加入到引物上。多余的核昔被移走。這樣每個(gè)單鏈DNA分子通過(guò)互補(bǔ)堿基的配對(duì)被延伸，利用生物發(fā)光蛋白，比如螢火蟲的熒光素酶，可通過(guò)堿基加到引物后端時(shí)所釋放出的焦磷酸鹽來(lái)提供檢測(cè)信號(hào)。針對(duì)每種堿

4、基的特定波長(zhǎng)的激光激發(fā)結(jié)合上的核昔的標(biāo)記，這個(gè)標(biāo)記會(huì)釋放出熒光。熒光信號(hào)被CCD采集，CCD快速掃描整個(gè)陣列檢測(cè)特定的結(jié)合到每個(gè)片斷上的堿基。通過(guò)上述的結(jié)合，檢測(cè)可以重復(fù)幾十個(gè)循環(huán)，這樣就有可能決定核甘酸片斷中的幾十個(gè)堿基。Solexa的這種方法，可在一個(gè)反應(yīng)中同時(shí)加入4種核昔的標(biāo)簽，采用邊合成邊測(cè)序(SBS-sequencingbysynthesis),可減少因二級(jí)結(jié)構(gòu)造成的一段區(qū)域的缺失。并具有所需樣品量少，高通量，高精確性，擁有簡(jiǎn)單易操作的自動(dòng)化平臺(tái)和功能強(qiáng)大等特點(diǎn)，此反應(yīng)可以同時(shí)檢測(cè)上億個(gè)核甘酸片斷，因此在同一個(gè)芯片或幾個(gè)芯片上花費(fèi)很少(只需常規(guī)方法的1%)的成本就可測(cè)試全基因組。2、

5、Solexa高通量測(cè)序技術(shù)特點(diǎn)：1)可擴(kuò)展的超高通量：GenomeAnalyzer系統(tǒng)目前每次運(yùn)行后可獲得超過(guò)20GB的高品質(zhì)過(guò)濾數(shù)據(jù)。這個(gè)技術(shù)的可擴(kuò)展性保證了更高的數(shù)據(jù)密度和輸出，能用更少的經(jīng)費(fèi)完成更復(fù)雜的項(xiàng)目。到今年底，通量還有望上升到95GB,相當(dāng)于人類基因組的30倍覆蓋度。2）需要樣品量少：GenomeAnalyzer系統(tǒng)需要的樣品量低至100ng,能應(yīng)用在很多樣品有限的實(shí)驗(yàn)（比如免疫沉淀、顯微切割等）中。這也是很多研究人員所考慮的因素。3）簡(jiǎn)單、快速、自動(dòng)化：GenomeAnalyzer系統(tǒng)提供了最簡(jiǎn)單和簡(jiǎn)潔的工作流程。即使是最小的實(shí)驗(yàn)室也能像大型基因組中心一樣進(jìn)行大規(guī)模的實(shí)驗(yàn)。制備

6、樣品文庫(kù)可以在幾小時(shí)內(nèi)完成，一個(gè)星期內(nèi)就能得到高精確度的數(shù)據(jù)。ClusterStation可以說(shuō)是GenomeAnalyzer的核心。由獨(dú)立軟件控制的自動(dòng)生成DNA簇的過(guò)程可以在5小時(shí)之內(nèi)（30分鐘手工操作）完成。這個(gè)自動(dòng)化的流程不需要進(jìn)行EmulsionPCR,減少了手工操作誤差和污染可能性，也不需要機(jī)器人操作或潔凈室?？焖俚膶?shí)驗(yàn)流程使GenomeAnalyzer的能力增至最大，而自動(dòng)化步移降低了項(xiàng)目的時(shí)間和費(fèi)用。4）新穎的測(cè)序化學(xué)技術(shù)：GenomeAnalyzer通過(guò)合成測(cè)序來(lái)支持大規(guī)模并行測(cè)序。利用新穎的可逆熒光標(biāo)記終止子，可以在DNA鏈延伸的過(guò)程中檢測(cè)單個(gè)堿基摻入。由于四個(gè)可逆終止子d

7、NTP在每個(gè)測(cè)序循環(huán)都存在，自然的競(jìng)爭(zhēng)減少了摻入的誤差。5）單個(gè)或配對(duì)末端支持：GenomeAnalyzer系統(tǒng)支持單個(gè)片段或配對(duì)末端文庫(kù)。文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程簡(jiǎn)單，減少了樣品分離和制備的時(shí)間。制備基因組DNA的單個(gè)片段或配對(duì)末端文庫(kù)需要6個(gè)小時(shí)，只有3個(gè)小時(shí)需要手工操作。2X50個(gè)堿基或更長(zhǎng)的讀長(zhǎng)增加了比對(duì)基因組的能力，并拓展了在其他方面的應(yīng)用。3、實(shí)驗(yàn)流程1）文庫(kù)制備將基因組DNA打成幾百個(gè)堿基（或更短）的小片段，在片段的兩個(gè)末端加上接頭（adapter）o2）產(chǎn)生DNA簇利用專利的芯片，其表面連接有一層單鏈引物，DNA片段變成單鏈后通過(guò)與芯片表面的引物堿基互補(bǔ)被一端固定”在芯片上。另外一端（5&

8、#39;或3'）隨機(jī)和附近的另外一個(gè)引物互補(bǔ)，也被固定”住，形成橋（bridge）。反復(fù)30輪擴(kuò)增，每個(gè)單分子得到了1000倍擴(kuò)增，成為單克隆DNA簇。DNA簇產(chǎn)生之后，擴(kuò)增子被線性化，測(cè)序引物隨后雜交在目標(biāo)區(qū)域一側(cè)的通用序列上。3）測(cè)序GenomeAnalyzer系統(tǒng)應(yīng)用了邊合成邊測(cè)序（SequencingBySynthesis）的原理。加入改造過(guò)的DNA聚合酶和帶有4種熒光標(biāo)記的dNTP。這些核甘酸是何逆終止子"，因?yàn)?'羥基末端帶有可化學(xué)切割的部分，它只容許每個(gè)循環(huán)摻入單個(gè)堿基。此時(shí)，用激光掃描反應(yīng)板表面，讀取每條模板序列第一輪反應(yīng)所聚合上去的核甘酸種類。之后，

9、將這些基團(tuán)化學(xué)切割，恢復(fù)3'端粘性，繼續(xù)聚合第二個(gè)核甘酸。如此繼續(xù)下去，直到每條模板序列都完全被聚合為雙鏈。這樣，統(tǒng)計(jì)每輪收集到的熒光信號(hào)結(jié)果，就可以得知每個(gè)模板DNA片段的序列。目前的配對(duì)末端讀長(zhǎng)可達(dá)到2X50bp,更長(zhǎng)的讀長(zhǎng)也能實(shí)現(xiàn)，但錯(cuò)誤率會(huì)增高。讀長(zhǎng)會(huì)受到多個(gè)引起信號(hào)衰減的因素所影響，如熒光標(biāo)記的不完全切割。4）數(shù)據(jù)分析自動(dòng)讀取堿基，數(shù)據(jù)被轉(zhuǎn)移到自動(dòng)分析通道進(jìn)行二次分析4、GenomeAnalyzer系統(tǒng)得到國(guó)內(nèi)外大型研究機(jī)構(gòu)的認(rèn)可GenomeAnalyzer系統(tǒng)之所以如此暢銷，關(guān)鍵在于其技術(shù)上的優(yōu)勢(shì)。根據(jù)去年底的數(shù)據(jù)，GenomeAnalyzer已售出約200臺(tái)，估計(jì)是市場(chǎng)占

10、有率最廣的。前不久，華大基因再添置了12臺(tái)，準(zhǔn)備放在香港和深圳的實(shí)驗(yàn)室，至此華大基因已經(jīng)有29臺(tái)GenomeAnalyzer。而著名的麻省理工學(xué)院和哈佛大學(xué)Broad研究院擁有47臺(tái)Illumina測(cè)序儀。眾多實(shí)驗(yàn)室之所以選擇Illumina,看中的無(wú)疑是GenomeAnalyzer的高性價(jià)比。上個(gè)月，Illumina將GenomeAnalyzerII升級(jí)到GenomeAnalyzerIIx,距年底實(shí)現(xiàn)單次運(yùn)行獲得95GB數(shù)據(jù)的宏偉目標(biāo)又近了一步。GenomeAnalyzerIIx有兩個(gè)核心特征：其一是更大的試劑冷卻器，支持超過(guò)100個(gè)測(cè)序循環(huán)，進(jìn)一步提升了系統(tǒng)的易用性和自動(dòng)化；其二是全新的流

11、動(dòng)池支架，讓每輪運(yùn)行所得的高質(zhì)量數(shù)據(jù)增加20%。依靠系統(tǒng)軟件和試劑的改進(jìn)，GenomeAnalyzerIIx現(xiàn)在能夠支持100bp以上的配對(duì)末端讀長(zhǎng)，并在每次運(yùn)行中產(chǎn)生超過(guò)20GB的高質(zhì)量數(shù)據(jù)。第二代高通量測(cè)序的三大巨頭比拼(之二)摘要：羅氏公司(Roche)的454測(cè)序儀結(jié)合了DNA擴(kuò)增的乳膠系統(tǒng)(emulsionsystem)和皮升級(jí)焦磷酸(pyrophosphate)為基礎(chǔ)的測(cè)序方法焦磷酸測(cè)序(pyrosequencing)方法。二、羅氏公司(Roche)的454測(cè)序儀(RochGSFLXsequencer)羅氏2005年，在國(guó)際頂級(jí)的學(xué)術(shù)期刊Nature»上，來(lái)自454生命科

12、學(xué)公司的Margulies等人發(fā)表文章介紹了一種快速簡(jiǎn)單的測(cè)序方法：結(jié)合了DNA擴(kuò)增的乳膠系統(tǒng)(emulsionsystem)和皮升級(jí)焦磷酸(pyrophosphate)為基礎(chǔ)的測(cè)序方法焦磷酸測(cè)序(pyrosequencing)方法。這是一種依靠生物發(fā)光進(jìn)行DNA序列分析的新技術(shù)；在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，熒光素酶和雙磷酸酶的協(xié)同作用下，將引物上每一個(gè)dNTP的聚合與一次熒光信號(hào)釋放偶聯(lián)起來(lái)。通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)釋放的有無(wú)和強(qiáng)度，就可以達(dá)到實(shí)時(shí)測(cè)定DNA序列的目的。此技術(shù)不需要熒光標(biāo)記的引物或核酸探針，也不需要進(jìn)行電泳；具有分析結(jié)果快速、準(zhǔn)確、靈敏度高和自動(dòng)化的特點(diǎn)。1、GSFLX系統(tǒng)的工作

13、流程GSFLX系統(tǒng)的流程概括起來(lái)，就是“一個(gè)片段=一個(gè)磁珠=一條讀長(zhǎng)(Onefragment=Onebead=Oneread)”。1 )樣品輸入并片段化：GSFLX系統(tǒng)支持各種不同來(lái)源的樣品，包括基因組DNA、PCR產(chǎn)物、BAC、cDNA、小分子RNA等等。大的樣品例如基因組DNA或者BAC等被打斷成300800bp的片段；對(duì)于小分子的非編碼RNA或者PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，這一步則不需要。短的PCR產(chǎn)物則可以直接跳到步驟3)。2 )文庫(kù)制備：借助一系列標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)，將A和B接頭(3'和5'端具有特異性)連接到DNA片段上。接頭也將用于后續(xù)的純化，擴(kuò)增和測(cè)序步驟。具有A、B接頭

14、的單鏈DNA片段組成了樣品文庫(kù)。3 ）一個(gè)DNA片段=一個(gè)磁珠：?jiǎn)捂淒NA文庫(kù)被固定在特別設(shè)計(jì)的DNA捕獲磁珠上。每一個(gè)磁珠攜帶了一個(gè)獨(dú)特的單鏈DNA片段。磁珠結(jié)合的文庫(kù)被擴(kuò)增試劑乳化，形成油包水的混合物，這樣就形成了只包含一個(gè)磁珠和一個(gè)獨(dú)特片段的微反應(yīng)器。4 ）乳液PCR擴(kuò)增：每個(gè)獨(dú)特的片段在自己的微反應(yīng)器里進(jìn)行獨(dú)立的擴(kuò)增，而沒(méi)有其他的競(jìng)爭(zhēng)性或者污染性序列的影響。整個(gè)片段文庫(kù)的擴(kuò)增平行進(jìn)行。對(duì)于每一個(gè)片段而言，擴(kuò)增后產(chǎn)生了幾百萬(wàn)個(gè)相同的拷貝。隨后，乳液混合物被打破，擴(kuò)增的片段仍然結(jié)合在磁珠上。5 ）一個(gè)磁珠=一條讀長(zhǎng)：攜帶DNA的捕獲磁珠隨后放入PTP板中進(jìn)行后繼的測(cè)序。PTP孔的直徑（29

15、um）只能容納一個(gè)磁珠（20um）。然后將PTP板放置在GSFLX中，測(cè)序開始。放置在四個(gè)單獨(dú)的試劑瓶里的四種堿基，依照T、A、C、G的順序依次循環(huán)進(jìn)入PTP板，每次只進(jìn)入一個(gè)堿基。如果發(fā)生堿基配對(duì)，就會(huì)釋放一個(gè)焦磷酸。這個(gè)焦磷酸在ATP硫酸化酶和螢光素酶的作用下，經(jīng)過(guò)一個(gè)合成反應(yīng)和一個(gè)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，最終將螢光素氧化成氧化螢光素，同時(shí)釋放出光信號(hào)。此反應(yīng)釋放出的光信號(hào)實(shí)時(shí)被儀器配置的高靈敏度CCD捕獲到。有一個(gè)堿基和測(cè)序模板進(jìn)行配對(duì)，就會(huì)捕獲到一分子的光信號(hào)；由此一一對(duì)應(yīng)，就可以準(zhǔn)確、快速地確定待測(cè)模板的堿基序列。這也就是大名鼎鼎的焦磷酸測(cè)序。6 ）數(shù)據(jù)分析：GSFLX系統(tǒng)在10小時(shí)的運(yùn)行當(dāng)中

16、可獲得100多萬(wàn)個(gè)讀長(zhǎng)，讀取超過(guò)4-6億個(gè)堿基信息。GSFLX系統(tǒng)提供兩種不同的生物信息學(xué)工具對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，適用于不同的應(yīng)用：達(dá)400MB的從頭拼接和任何大小基因組的重測(cè)序。GSFLX系統(tǒng)的準(zhǔn)確率在99%以上。其主要限制來(lái)自同聚物，也就是相同堿基的連續(xù)摻入，如AAA或GGG。由于沒(méi)有終止元件來(lái)阻止單個(gè)循環(huán)的連續(xù)摻入，同聚物的長(zhǎng)度就需要從信號(hào)強(qiáng)度中推斷出來(lái)。這個(gè)過(guò)程就可能產(chǎn)生誤差。因此，454測(cè)序平臺(tái)的主要錯(cuò)誤類型是插入-缺失，而不是替換。2、454GS測(cè)序系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)數(shù)據(jù)高效獲取10小時(shí)內(nèi)可得到超過(guò)1000000條的序列，平均讀長(zhǎng)高達(dá)450bp!極大的拓展研究思路，大量的高讀長(zhǎng)的序列，為研

17、究者提供更廣闊的思路！獲取等量數(shù)據(jù)，比傳統(tǒng)方法的花費(fèi)大大降低，454Titanium系統(tǒng)，可以幫助您：1 ）獲取各個(gè)物種的基因組序列草圖2 ）大規(guī)模PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序3 ）尋找基因組中，Sanger測(cè)序法不能發(fā)現(xiàn)的稀有突變4 ）開放閱讀框（ORF）的鑒定，不同生物間的同源性分析，基因組結(jié)構(gòu)概況分析5 ）鑒定不同菌株的保守區(qū)域，突變熱點(diǎn)和基因插入或者缺失，了解藥物抗性的遺傳基礎(chǔ)6）識(shí)別微生物產(chǎn)生的藥物前體有關(guān)的基因或者途徑，比較致病性和非致病性微生物的區(qū)別作為發(fā)展抗微生物藥物的遺傳學(xué)基礎(chǔ)7）進(jìn)行病毒基因組、microRNA、SAGE文庫(kù)、cDNA文庫(kù)和BAC文庫(kù)的測(cè)序第二代高通量測(cè)序的三大巨頭比

18、拼（之三）摘要：第二代高通量測(cè)序的三大巨頭比拼（之三）ABI的SOLiD測(cè)序儀三、ABI的SOLiD測(cè)序儀（ABISOLiDse-quencer）SOLiD全稱為supportedoligoligationdeletion,SOLiD系統(tǒng)是一個(gè)端到端的新一代基因組研究方案，包含測(cè)序組件、化學(xué)組件、計(jì)算集群和數(shù)據(jù)存儲(chǔ)組件。這個(gè)平臺(tái)基于通過(guò)寡核甘酸連接和檢測(cè)進(jìn)行測(cè)序。它的獨(dú)特之處在于以四色熒光標(biāo)記寡核甘酸的連續(xù)連接合成為基礎(chǔ)，取代了傳統(tǒng)的聚合酶連接反應(yīng)，可對(duì)單拷貝DNA片段進(jìn)行大規(guī)模擴(kuò)增和高通量并行測(cè)序。與聚合酶測(cè)序方法不同的是，SOLiD系統(tǒng)利用專利的逐步連接（stepwiseligation）

19、技術(shù)來(lái)產(chǎn)生高質(zhì)量的數(shù)據(jù)，可應(yīng)用于全基因組測(cè)序、染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）、微生物測(cè)序、數(shù)字核型分析、臨床測(cè)序、基因型分析、基因表達(dá)分析和小分子RNA的發(fā)現(xiàn)等等。就通量而言，SOLiD3系統(tǒng)是革命性的，目前SOLiD3單次運(yùn)行可產(chǎn)生50GB的序列數(shù)據(jù)，相當(dāng)于17倍人類基因組覆蓋度。而其無(wú)以倫比的準(zhǔn)確性、系統(tǒng)可靠性和可擴(kuò)展性更讓它從其他新一代測(cè)序平臺(tái)中脫穎而出。為什么SOLiD能輕松實(shí)現(xiàn)貌似不可能的任務(wù)？讓生物通帶你從測(cè)序原理入手，一探究竟。1、SOLiD工作流程1）文庫(kù)制備SOLiD系統(tǒng)能支持兩種測(cè)序模板：片段文庫(kù)（fragmentlibrary）或配對(duì)末端文庫(kù)（mate-pairedlibr

20、ary）。使用哪一種文庫(kù)取決于你的應(yīng)用及需要的信息。片段文庫(kù)就是將基因組DNA打斷，兩頭加上接頭，制成文庫(kù)。如果你想要做轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、RNA定量、miRNA探索、重測(cè)序、3',5'-RACE、甲基化分析、ChIP測(cè)序等，就可以用它。如果你的應(yīng)用是全基因組測(cè)序、SNP分析、結(jié)構(gòu)重排/拷貝數(shù)，則需要用配對(duì)末端文庫(kù)。配對(duì)末端文EcoP15酶切，使中間接庫(kù)是將基因組DNA打斷后，與中間接頭連接，再環(huán)化，然后用頭兩端各有27bp的堿基，再加上兩端的接頭，形成文庫(kù)。2）乳液PCR/微珠富集在微反應(yīng)器中加入測(cè)序模板、PCR反應(yīng)元件、微珠和引物，進(jìn)行乳液PCR（EmulsionPCR）。PCR完

21、成之后，變性模板，富集帶有延伸模板的微珠，去除多余的微珠。微珠上的模板經(jīng)過(guò)3'修飾，可以與玻片共價(jià)結(jié)合。看到這里，是不是有一種似曾相識(shí)的感覺(jué)呢？那就對(duì)了，此步驟與454的GSFLX基本相同。不過(guò)SOLiD系統(tǒng)的微珠要小得多，只有1um。乳液PCR最大的特點(diǎn)是可以形成數(shù)目龐大的獨(dú)立反應(yīng)空間以進(jìn)行DNA擴(kuò)增。其關(guān)鍵技術(shù)是“注水到油”，基本過(guò)程是在PCR反應(yīng)前，將包含PCR所有反應(yīng)成分的水溶液注入到高速旋轉(zhuǎn)的礦物油表面，水溶液瞬間形成無(wú)數(shù)個(gè)被礦物油包裹的小水滴。這些小水滴就構(gòu)成了獨(dú)立的PCR反應(yīng)空間。理想狀態(tài)下，每個(gè)小水滴只含一個(gè)DNA模板和一個(gè)P1磁珠，由于水相中的P2引物和磁珠表面的P1

22、引物所介導(dǎo)的PCR反應(yīng)，這個(gè)DNA模板的拷貝數(shù)量呈指數(shù)級(jí)增加，PCR反應(yīng)結(jié)束后，P1磁珠表面就固定有拷貝數(shù)目巨大的同來(lái)源DNA模板擴(kuò)增產(chǎn)物。3）微珠沉積3'修飾的微珠沉積在一塊玻片上。在微珠上樣的過(guò)程中，沉積小室將每張玻片分成1個(gè)、4個(gè)或8個(gè)測(cè)序區(qū)域。SOLiD系統(tǒng)最大的優(yōu)點(diǎn)就是每張玻片能容納更高密度的微珠，在同一系統(tǒng)中輕松實(shí)現(xiàn)更高的通量。4）連接測(cè)序這一步可就是SOLiD的獨(dú)門秘笈了。它的獨(dú)特之處在于沒(méi)有采用慣常的聚合酶，而用了連接酶。SOLiD連接反應(yīng)的底物是8堿基單鏈熒光探針混合物。連接反應(yīng)中，這些探針按照堿基互補(bǔ)規(guī)則與單鏈DNA模板鏈配對(duì)。探針的5'末端分別標(biāo)記了CY5

23、、TexasRed、CY3、6-FAM這4種顏色的熒光染料。探針3'端15位為隨機(jī)堿基，可以是ATCG四種堿基中的任何一種堿基，其中第1、2位構(gòu)成的堿基對(duì)是表征探針染料類型的編碼區(qū)，下圖的雙堿基編碼矩陣規(guī)定了該編碼區(qū)16種堿基對(duì)和4種探針顏色的對(duì)應(yīng)關(guān)系，而35位的“n”表示隨機(jī)堿基，68位的“z”指的是可以和任何堿基配對(duì)的特殊堿基。單向SOLiD測(cè)序包括五輪測(cè)序反應(yīng)，每輪測(cè)序反應(yīng)含有多次連接反應(yīng)。第一輪測(cè)序的第一次連接反應(yīng)由連接引物“n”介導(dǎo)，由于每個(gè)磁珠只含有均質(zhì)單鏈DNA模板，所以這次連接反應(yīng)摻入一種8堿基熒光探針，SOLiD測(cè)序儀記錄下探針第1、2位編碼區(qū)顏色信息，隨后的化學(xué)處理

24、斷裂探針3'端第5、6位堿基間的化學(xué)鍵，并除去68位堿基及5'末端熒光基團(tuán)，暴露探針第5位堿基5'磷酸，為下一次連接反應(yīng)作準(zhǔn)備。因?yàn)榈谝淮芜B接反應(yīng)使合成鏈多了5個(gè)堿基，所以第二次連接反應(yīng)得到模板上第6、7位堿基序列的顏色信息，而第三次連接反應(yīng)得到的是第11、12位堿基序列的顏色信息幾個(gè)循環(huán)之后，引物重置，開始第二輪的測(cè)序。由于第二輪連接引物n-1比第一輪錯(cuò)開一位，所以第二輪得到以0,1位起始的若干堿基對(duì)的顏色信息。五輪測(cè)序反應(yīng)反應(yīng)后，按照第0、1位，第1、2位.的順序把對(duì)應(yīng)于模板序列的顏色信息連起來(lái)，就得到由“0,1,2,3”組成的SOLiD原始顏色序列。5）數(shù)據(jù)分析S

25、OLiD測(cè)序完成后，獲得了由顏色編碼組成的SOLiD原始序列。理論上來(lái)說(shuō)，按照“雙堿基編碼矩陣”，只要知道所測(cè)DNA序列中任何一個(gè)位置的堿基類型，就可以將SOLiD原始顏色序列“解碼”成堿基序列。但由于雙堿基編碼規(guī)則中雙堿基與顏色信息的簡(jiǎn)并特性（一種顏色對(duì)應(yīng)4種堿基對(duì)），前面堿基的顏色編碼直接影響緊跟其后堿基的解碼，所以一個(gè)錯(cuò)誤顏色編碼就會(huì)引起“連鎖解碼錯(cuò)誤"，改變錯(cuò)誤顏色編碼之后的所有堿基。和其它所有測(cè)序儀一樣，測(cè)序錯(cuò)誤在所難免，關(guān)鍵是對(duì)測(cè)序錯(cuò)誤的評(píng)價(jià)和后續(xù)處理。由于SOLiD系統(tǒng)采用了雙堿基編碼技術(shù)，在測(cè)序過(guò)程中對(duì)每個(gè)堿基判讀兩遍，從而減少原始數(shù)據(jù)錯(cuò)誤，提供內(nèi)在的校對(duì)功能。這樣，雙保險(xiǎn)確保了SOLiD系統(tǒng)原始?jí)A基數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度大于99.94%，而在15X覆蓋率時(shí)的準(zhǔn)確度可以達(dá)到99.999%,是目前新一代基因分析技術(shù)中準(zhǔn)確度最高的。為避免“連鎖解碼錯(cuò)誤”的發(fā)生，SOLiD數(shù)據(jù)分析軟件不直接將SOLiD原始顏色序列解碼成堿基序