免疫學(xué)檢驗室內(nèi)質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)操作程序

1、廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬南海婦產(chǎn)兒童醫(yī)院廣東省佛山市南海區(qū)婦幼保健院文件編號NHFY-MI-JY-SH-001版 本A/0檢驗操作管理手冊頁 碼5/5免疫學(xué)檢驗室內(nèi)質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)操作程序生效日期2005-6-11.0目的：室內(nèi)質(zhì)量控制IQC是由實驗室的工作人員采用一系列的方法，連續(xù)的評價實驗室工作的可靠程度，確立報告能否發(fā)出。旨在檢測、控制本室常規(guī)工作的精密度，并檢測其準(zhǔn)確度的改變，提高本室常規(guī)工作中批間、批內(nèi)標(biāo)本檢測的一致性。2.0分析前質(zhì)控: 2.1人員培訓(xùn): 實驗是人操作的，因此檢驗人員需經(jīng)過培訓(xùn)，熟練掌握本專業(yè)如下幾方面的技術(shù)知識：2.1.1 檢驗工程的根本原理 ELISA原理；2.1.2

2、臨床意義；2.1.3熟悉檢測技巧，了解易出過失的環(huán)節(jié)及難點；2.1.4熟悉檢測試劑性能包括試劑盒組成，包被片段及其組成；2.1.5熟悉檢測儀器的原理及性能；掌握數(shù)據(jù)處理的能力和質(zhì)量控制知識。2.1.6某些特殊工程的檢測如抗HIV等需經(jīng)有關(guān)部門組織的專門培訓(xùn)班，考試合格后持證上崗。2.2 室內(nèi)質(zhì)控血清： 采用衛(wèi)生部或省臨床檢驗中心制備的質(zhì)控血清2.3試劑盒選擇 衛(wèi)生部規(guī)定乙肝試劑，丙肝試劑，艾滋病試劑，梅毒試劑及血型試劑必須使用經(jīng)衛(wèi)生部生物制品檢定所檢定合格，并貼有防偽標(biāo)簽的產(chǎn)品。2.4試劑盒評價:試劑評價需要有權(quán)威的血清考核盤Panel進(jìn)行檢測，價格昂貴，操作繁瑣，一般實驗室不易開展，可以通過

3、以下信息，了解試劑質(zhì)量。2.4.1根據(jù)該試劑生物制品鑒定所的批批檢定報告，了解其質(zhì)量水平，按照質(zhì)量方案選擇靈敏度高的或特異性高的試劑；2.4.2通過詢問試劑包被物的組成，如原料來源基因工程或合成多肽，片段的組合按比例混合或化學(xué)合成，片段的長短等判斷試劑的優(yōu)劣；2.4.3參考室間質(zhì)評報告中對試劑的評價結(jié)果，了解不同試劑的質(zhì)控成績。2.4.4根據(jù)權(quán)威部門發(fā)布的試劑評價結(jié)果，了解市場上試劑的質(zhì)量優(yōu)劣。2.5儀器質(zhì)控:2.5.1移液器：ELISA加樣量小5-100l，其準(zhǔn)確性直接影響實驗結(jié)果，利用稱重法檢查：吸取刻度指示量的水，萬分之一天平稱重后計算吸量是否準(zhǔn)確，一般應(yīng)在±10%以內(nèi)；2.5

4、.2水浴箱：經(jīng)常檢查水浴箱溫度計所示的溫度和水中或溫箱內(nèi)實測溫度是否一致，允許有±1的誤差；2.5.3洗板機(jī)：每個廠家設(shè)置洗板后的殘留液有各自的規(guī)定一般不超過2ul ，人工扣板時，墊紙不濕，定期檢查管孔是否堵塞；2.5.4酶標(biāo)儀：經(jīng)常維護(hù)其光學(xué)局部，防止濾光片霉變，定期檢測校正，使其保持良好的工作性能。酶標(biāo)儀的主要性能指標(biāo)有：測讀速度、讀數(shù)的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、精確度和可測范圍、線性等等。優(yōu)良的酶標(biāo)儀的讀數(shù)一般可精確到0.001，準(zhǔn)確性為±1%，重復(fù)性達(dá)0.5%。2.6標(biāo)本的采集和保存2.6.1標(biāo)本采集時應(yīng)盡量防止溶血，因紅細(xì)胞破裂可釋放過氧化物酶活性物質(zhì)干擾立可讀方法的結(jié)果，

5、以HRP為標(biāo)記的ELISA測定中，溶血標(biāo)本會增加非特異性顯色造成假陽性。2.6.2長菌的標(biāo)本同樣的道理也易產(chǎn)生假陽性，因菌體中可能含有內(nèi)源性HRP也會產(chǎn)生假陽性反響。2.6.3抗凝不完全的標(biāo)本因纖維蛋白元的干擾而造成假陽性，建議盡量不用抗凝血尤其是不使用用肝素抗凝劑。2.6.4標(biāo)本在冰箱中保存時間過長易導(dǎo)致血清IgG聚合，使間接法的試劑本底加深，一般血清置4冰箱5天內(nèi)完成測試。如需保存一周以上那么要-20冰凍保存，凍結(jié)血清融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，融解時應(yīng)上下顛倒充分混勻，同時防止氣泡?？缮舷骂嵉够旌停灰诨靹蚱魃蠌?qiáng)烈振蕩。反復(fù)凍融會使抗體效價跌落，如需保存作屢次檢測，宜少量分裝冰存

6、。2.6.5 ELISA的靈敏度>1ng/ml水平上,標(biāo)本間的污染要盡量防止，尤其不應(yīng)與生化試驗用同一管標(biāo)本。 3.0分析中質(zhì)控：ELISA實驗的結(jié)果受操作影響很大，每個步驟包括加樣，溫育，洗滌，顯色，酶標(biāo)儀讀數(shù)均應(yīng)認(rèn)真負(fù)責(zé)才能充分發(fā)揮ELISA的高靈敏，強(qiáng)特異的優(yōu)點。因此,應(yīng)建立實驗工程的標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)。3.1 加樣3.1.1 加樣應(yīng)用微量移液器加樣槍按規(guī)定的量參加微孔板底部，防止加在孔壁上部，不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。3.1.2每次加樣應(yīng)更換吸嘴，做到一人一吸頭，以免發(fā)生交叉污染;干吸頭預(yù)先在血清中抽吸三次。3.1.3樣本稀釋，目的是為了減少非特異性反響，所以一定要先加稀釋液后

7、加樣本，特別注意加樣后要在微量振蕩器上振蕩30秒鐘，同時注意防止液體溢出。如后面操作步驟中加二種以上試劑時均需振蕩混勻。3.1.4如用滴瓶滴加試劑應(yīng)先將滴瓶搖勻并擠去第一滴有氣泡的試劑后加樣。3.2 溫育3.2.1抗原抗體反響需要在一定溫度下37°C，經(jīng)過一定的時間才能到達(dá)反響的平衡點3.2.2 ELISA邊緣效應(yīng)是由溫育形成的。所以溫育一般采用能使反響液溫度迅速到達(dá)平衡的水浴法。水要浸至板條的1/3處。3.2.3反響板不宜疊放，注意溫育的溫度和時間應(yīng)按規(guī)定控制，一個人操作時，一次不宜多于兩塊板同時測定。 3.3 洗滌3.3.1手工洗滌一般采用浸泡方法：1甩去孔內(nèi)反響液； 2用洗滌液

8、過洗一遍即注滿孔后即甩去；3微孔重新注滿洗液后浸泡2-3分鐘，間歇搖動；4甩去孔內(nèi)液體，拍板，用紙吸干。重復(fù)以上操作至少5次。注意各種試劑盒的洗滌液盡量不要混用。3.3.2洗板機(jī)洗板一定要預(yù)先把板架放平，使洗板機(jī)上的每個放液和吸液纖孔都能一致地插入孔底，將孔內(nèi)液體全部吸干，同時要設(shè)置一定的浸泡時間。如出現(xiàn)機(jī)洗后拍板有較多殘留液時應(yīng)再用手工洗2次以上。關(guān)機(jī)前要用蒸溜水沖洗管道，防止堵孔。3.4 顯色3.4.1 HRP催化底物的一步呈色反響，同樣需要一定的時間和溫度，3.4.2一定要按照說明書規(guī)定的時間溫度一般為37°C，10-15分鐘恒定反響后終止3.4.3 或根據(jù)臨界值質(zhì)控血清吸光度

9、值達(dá)0.2左右使的時間而恒定反響時間.3.5 酶標(biāo)儀判讀結(jié)果3.5.1顯色反響終止后應(yīng)立刻比色30分鐘內(nèi)。3.5.2常見的顯色系統(tǒng)有OPD和TMB二種，以后者最為常見，而TMB酸不易終止因此必須盡快比色以免影響結(jié)果。OPD終止后顯棕色，測定波長為490nm；TMB終止后顯黃色，測定波長為450nm，二種底物的校正波長均用630nm。3.5.3使用雙波長的優(yōu)點可以消除反響板條上的劃痕手印的干擾。同時要注意反響板應(yīng)用紙吸干后才能置酶標(biāo)儀中比色，否那么吸光度易出現(xiàn)負(fù)值或損壞濾光片。4.0分析后質(zhì)控：4.1報告方式4.1.1定性試驗：國內(nèi)外為便于統(tǒng)一計算，一律按S/COV方式報告，S為標(biāo)本A值，COV

10、即Cut Off值或COV1 夾心法和間接法以S/COV1為陽性；競爭法與中和法以S/COV1為陽性2 COV的計算公式以試劑盒說明書的為準(zhǔn)常見的有：A COV=2.1×N當(dāng)N缺乏0.05時按0.05計，此公式由P/N>2.1換算而來，常用于夾心法。B COV=0.5×N，從抑止率公式換算而來，常用于競爭，中和法。C COV=N+CC為常數(shù)，用于間接法。D) COV=C×P+NC為常數(shù)，用于間接法。此公式最客觀，但對廠家要求很高，陰陽性對照測定值要根本恒定。4.1.2定量分析：嚴(yán)禁用定性試劑盒做定量分析。1 用量的系列標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果以絕對量或單位

11、表示。ELISA的標(biāo)準(zhǔn)曲線每次都要和待測標(biāo)本做在同一塊板上。2 現(xiàn)有的ELISA定量試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線只有在較窄的濃度范圍內(nèi)成直線，要得到精確的結(jié)果實屬不易。4.2記錄 4.2.1所有實驗的原始資料均應(yīng)存檔；所有的記錄均應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)登記在冊；原始登記表應(yīng)記錄試劑來源、批號；質(zhì)控血清的來源及測定值并注明是否在控；簽上實驗者姓名及審核者姓名。4.2.2如試驗結(jié)果對臨床診斷有決定意義，其樣本應(yīng)保存，至少與病歷保存期一致4.3定性試驗ELISA定性試驗的臨床意義在于是否檢出病原體，與檢出量無關(guān)，因此QC要保證試驗的靈敏度和特異性。生化的質(zhì)控圖方法僅能觀察靈敏度而無法監(jiān)控特異性。建議使用臨界值血清界定法：將試劑盒

12、所設(shè)的陰陽性對照作為內(nèi)對照指示反響；另設(shè)臨界值、高值質(zhì)控血清，正常人血清作為外對照，與標(biāo)本同時檢測，臨界值S/C.O1，高值質(zhì)控血清S/C.O10，正常人血清A值在0.050.07之間。陽性質(zhì)控血清失控臨界值為靈敏度，高值為"HOOK"效應(yīng)監(jiān)控應(yīng)重做陰性標(biāo)本；陰性對照失控應(yīng)重做陽性標(biāo)本。以表格式記錄每塊板的外對照實驗結(jié)果，作為QC資料存檔。4.4定量試驗ELISA定量試驗常見于腫瘤因子如AFP，CEA，CA系列，激素類，免疫球蛋白類，這些物質(zhì)在體內(nèi)有一定的量正常范圍，超出這個量才呈病理情況，故需定量測定。定量試驗的質(zhì)控方法可參考生化方式。4.5"即刻性"質(zhì)控在開始進(jìn)行質(zhì)控時，只