免疫學檢驗室內(nèi)質(zhì)量控制的標準操作程序

1、廣州中醫(yī)藥大學附屬南海婦產(chǎn)兒童醫(yī)院廣東省佛山市南海區(qū)婦幼保健院文件編號NHFY-MI-JY-SH-001版 本A/0檢驗操作管理手冊頁 碼5/5免疫學檢驗室內(nèi)質(zhì)量控制的標準操作程序生效日期2005-6-11.0目的：室內(nèi)質(zhì)量控制IQC是由實驗室的工作人員采用一系列的方法，連續(xù)的評價實驗室工作的可靠程度，確立報告能否發(fā)出。旨在檢測、控制本室常規(guī)工作的精密度，并檢測其準確度的改變，提高本室常規(guī)工作中批間、批內(nèi)標本檢測的一致性。2.0分析前質(zhì)控: 2.1人員培訓: 實驗是人操作的，因此檢驗人員需經(jīng)過培訓，熟練掌握本專業(yè)如下幾方面的技術(shù)知識：2.1.1 檢驗工程的根本原理 ELISA原理；2.1.2

2、臨床意義；2.1.3熟悉檢測技巧，了解易出過失的環(huán)節(jié)及難點；2.1.4熟悉檢測試劑性能包括試劑盒組成，包被片段及其組成；2.1.5熟悉檢測儀器的原理及性能；掌握數(shù)據(jù)處理的能力和質(zhì)量控制知識。2.1.6某些特殊工程的檢測如抗HIV等需經(jīng)有關(guān)部門組織的專門培訓班，考試合格后持證上崗。2.2 室內(nèi)質(zhì)控血清： 采用衛(wèi)生部或省臨床檢驗中心制備的質(zhì)控血清2.3試劑盒選擇 衛(wèi)生部規(guī)定乙肝試劑，丙肝試劑，艾滋病試劑，梅毒試劑及血型試劑必須使用經(jīng)衛(wèi)生部生物制品檢定所檢定合格，并貼有防偽標簽的產(chǎn)品。2.4試劑盒評價:試劑評價需要有權(quán)威的血清考核盤Panel進行檢測，價格昂貴，操作繁瑣，一般實驗室不易開展，可以通過

3、以下信息，了解試劑質(zhì)量。2.4.1根據(jù)該試劑生物制品鑒定所的批批檢定報告，了解其質(zhì)量水平，按照質(zhì)量方案選擇靈敏度高的或特異性高的試劑；2.4.2通過詢問試劑包被物的組成，如原料來源基因工程或合成多肽，片段的組合按比例混合或化學合成，片段的長短等判斷試劑的優(yōu)劣；2.4.3參考室間質(zhì)評報告中對試劑的評價結(jié)果，了解不同試劑的質(zhì)控成績。2.4.4根據(jù)權(quán)威部門發(fā)布的試劑評價結(jié)果，了解市場上試劑的質(zhì)量優(yōu)劣。2.5儀器質(zhì)控:2.5.1移液器：ELISA加樣量小5-100l，其準確性直接影響實驗結(jié)果，利用稱重法檢查：吸取刻度指示量的水，萬分之一天平稱重后計算吸量是否準確，一般應在±10%以內(nèi)；2.5

4、.2水浴箱：經(jīng)常檢查水浴箱溫度計所示的溫度和水中或溫箱內(nèi)實測溫度是否一致，允許有±1的誤差；2.5.3洗板機：每個廠家設置洗板后的殘留液有各自的規(guī)定一般不超過2ul ，人工扣板時，墊紙不濕，定期檢查管孔是否堵塞；2.5.4酶標儀：經(jīng)常維護其光學局部，防止濾光片霉變，定期檢測校正，使其保持良好的工作性能。酶標儀的主要性能指標有：測讀速度、讀數(shù)的準確性、重復性、精確度和可測范圍、線性等等。優(yōu)良的酶標儀的讀數(shù)一般可精確到0.001，準確性為±1%，重復性達0.5%。2.6標本的采集和保存2.6.1標本采集時應盡量防止溶血，因紅細胞破裂可釋放過氧化物酶活性物質(zhì)干擾立可讀方法的結(jié)果，

5、以HRP為標記的ELISA測定中，溶血標本會增加非特異性顯色造成假陽性。2.6.2長菌的標本同樣的道理也易產(chǎn)生假陽性，因菌體中可能含有內(nèi)源性HRP也會產(chǎn)生假陽性反響。2.6.3抗凝不完全的標本因纖維蛋白元的干擾而造成假陽性，建議盡量不用抗凝血尤其是不使用用肝素抗凝劑。2.6.4標本在冰箱中保存時間過長易導致血清IgG聚合，使間接法的試劑本底加深，一般血清置4冰箱5天內(nèi)完成測試。如需保存一周以上那么要-20冰凍保存，凍結(jié)血清融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，融解時應上下顛倒充分混勻，同時防止氣泡。可上下顛倒混和，不要在混勻器上強烈振蕩。反復凍融會使抗體效價跌落，如需保存作屢次檢測，宜少量分裝冰存

6、。2.6.5 ELISA的靈敏度>1ng/ml水平上,標本間的污染要盡量防止，尤其不應與生化試驗用同一管標本。 3.0分析中質(zhì)控：ELISA實驗的結(jié)果受操作影響很大，每個步驟包括加樣，溫育，洗滌，顯色，酶標儀讀數(shù)均應認真負責才能充分發(fā)揮ELISA的高靈敏，強特異的優(yōu)點。因此,應建立實驗工程的標準操作程序(SOP)。3.1 加樣3.1.1 加樣應用微量移液器加樣槍按規(guī)定的量參加微孔板底部，防止加在孔壁上部，不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。3.1.2每次加樣應更換吸嘴，做到一人一吸頭，以免發(fā)生交叉污染;干吸頭預先在血清中抽吸三次。3.1.3樣本稀釋，目的是為了減少非特異性反響，所以一定要先加稀釋液后

7、加樣本，特別注意加樣后要在微量振蕩器上振蕩30秒鐘，同時注意防止液體溢出。如后面操作步驟中加二種以上試劑時均需振蕩混勻。3.1.4如用滴瓶滴加試劑應先將滴瓶搖勻并擠去第一滴有氣泡的試劑后加樣。3.2 溫育3.2.1抗原抗體反響需要在一定溫度下37°C，經(jīng)過一定的時間才能到達反響的平衡點3.2.2 ELISA邊緣效應是由溫育形成的。所以溫育一般采用能使反響液溫度迅速到達平衡的水浴法。水要浸至板條的1/3處。3.2.3反響板不宜疊放，注意溫育的溫度和時間應按規(guī)定控制，一個人操作時，一次不宜多于兩塊板同時測定。 3.3 洗滌3.3.1手工洗滌一般采用浸泡方法：1甩去孔內(nèi)反響液； 2用洗滌液

8、過洗一遍即注滿孔后即甩去；3微孔重新注滿洗液后浸泡2-3分鐘，間歇搖動；4甩去孔內(nèi)液體，拍板，用紙吸干。重復以上操作至少5次。注意各種試劑盒的洗滌液盡量不要混用。3.3.2洗板機洗板一定要預先把板架放平，使洗板機上的每個放液和吸液纖孔都能一致地插入孔底，將孔內(nèi)液體全部吸干，同時要設置一定的浸泡時間。如出現(xiàn)機洗后拍板有較多殘留液時應再用手工洗2次以上。關(guān)機前要用蒸溜水沖洗管道，防止堵孔。3.4 顯色3.4.1 HRP催化底物的一步呈色反響，同樣需要一定的時間和溫度，3.4.2一定要按照說明書規(guī)定的時間溫度一般為37°C，10-15分鐘恒定反響后終止3.4.3 或根據(jù)臨界值質(zhì)控血清吸光度

9、值達0.2左右使的時間而恒定反響時間.3.5 酶標儀判讀結(jié)果3.5.1顯色反響終止后應立刻比色30分鐘內(nèi)。3.5.2常見的顯色系統(tǒng)有OPD和TMB二種，以后者最為常見，而TMB酸不易終止因此必須盡快比色以免影響結(jié)果。OPD終止后顯棕色，測定波長為490nm；TMB終止后顯黃色，測定波長為450nm，二種底物的校正波長均用630nm。3.5.3使用雙波長的優(yōu)點可以消除反響板條上的劃痕手印的干擾。同時要注意反響板應用紙吸干后才能置酶標儀中比色，否那么吸光度易出現(xiàn)負值或損壞濾光片。4.0分析后質(zhì)控：4.1報告方式4.1.1定性試驗：國內(nèi)外為便于統(tǒng)一計算，一律按S/COV方式報告，S為標本A值，COV

10、即Cut Off值或COV1 夾心法和間接法以S/COV1為陽性；競爭法與中和法以S/COV1為陽性2 COV的計算公式以試劑盒說明書的為準常見的有：A COV=2.1×N當N缺乏0.05時按0.05計，此公式由P/N>2.1換算而來，常用于夾心法。B COV=0.5×N，從抑止率公式換算而來，常用于競爭，中和法。C COV=N+CC為常數(shù)，用于間接法。D) COV=C×P+NC為常數(shù)，用于間接法。此公式最客觀，但對廠家要求很高，陰陽性對照測定值要根本恒定。4.1.2定量分析：嚴禁用定性試劑盒做定量分析。1 用量的系列標準品，繪制標準曲線，結(jié)果以絕對量或單位

11、表示。ELISA的標準曲線每次都要和待測標本做在同一塊板上。2 現(xiàn)有的ELISA定量試劑盒標準曲線只有在較窄的濃度范圍內(nèi)成直線，要得到精確的結(jié)果實屬不易。4.2記錄 4.2.1所有實驗的原始資料均應存檔；所有的記錄均應標準登記在冊；原始登記表應記錄試劑來源、批號；質(zhì)控血清的來源及測定值并注明是否在控；簽上實驗者姓名及審核者姓名。4.2.2如試驗結(jié)果對臨床診斷有決定意義，其樣本應保存，至少與病歷保存期一致4.3定性試驗ELISA定性試驗的臨床意義在于是否檢出病原體，與檢出量無關(guān)，因此QC要保證試驗的靈敏度和特異性。生化的質(zhì)控圖方法僅能觀察靈敏度而無法監(jiān)控特異性。建議使用臨界值血清界定法：將試劑盒

12、所設的陰陽性對照作為內(nèi)對照指示反響；另設臨界值、高值質(zhì)控血清，正常人血清作為外對照，與標本同時檢測，臨界值S/C.O1，高值質(zhì)控血清S/C.O10，正常人血清A值在0.050.07之間。陽性質(zhì)控血清失控臨界值為靈敏度，高值為"HOOK"效應監(jiān)控應重做陰性標本；陰性對照失控應重做陽性標本。以表格式記錄每塊板的外對照實驗結(jié)果，作為QC資料存檔。4.4定量試驗ELISA定量試驗常見于腫瘤因子如AFP，CEA，CA系列，激素類，免疫球蛋白類，這些物質(zhì)在體內(nèi)有一定的量正常范圍，超出這個量才呈病理情況，故需定量測定。定量試驗的質(zhì)控方法可參考生化方式。4.5"即刻性"質(zhì)控在開始進行質(zhì)控時，只