大腸桿菌DH5a感受態(tài)的制備,質(zhì)粒驗(yàn)證

1、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5a的制備，質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及提取一實(shí)驗(yàn)?zāi)康?, 了解和掌握大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備方法的原理和操作技術(shù)。2, 了解和掌握質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的原理和操作步驟。3,掌握堿裂解法提取質(zhì)粒的原理和方法，以及提取過程中各試劑的作用。二實(shí)驗(yàn)原理1,大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備的原理感受態(tài)是細(xì)菌細(xì)胞具有的能接受外源DNA的一種特殊生理狀態(tài)，將正在生長(zhǎng)的大腸桿菌處于0c的CaCl2低滲溶液中，會(huì)膨脹成球形，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，此時(shí)的細(xì)胞呈現(xiàn)出感受態(tài)。2,質(zhì)粒轉(zhuǎn)化原理在0c下外源DNA可吸附到感受態(tài)細(xì)胞表面，短時(shí)間的熱刺激可誘導(dǎo)細(xì)胞吸收DNA轉(zhuǎn)化了質(zhì)粒DNA的大腸桿菌經(jīng)培養(yǎng)可以使質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因得

2、到表達(dá)，因此，轉(zhuǎn)化了質(zhì)粒的大腸桿菌細(xì)胞可以在含有相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基上涂布生長(zhǎng)，而沒有轉(zhuǎn)化的細(xì)胞則無法生長(zhǎng)。3,質(zhì)粒提取原理質(zhì)粒的分離是利用質(zhì)粒DNAW染色體DNA在變性與復(fù)性中的差異來達(dá)到的目的。當(dāng)菌體在NaOHffiSDS容液中裂解時(shí)，蛋白質(zhì)與DN儂生變性，由于染色體DNAf質(zhì)粒DNA拓樸構(gòu)型不同，染色體DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開，而共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒DNA的氫鍵雖被斷裂，但兩條互補(bǔ)鏈彼此相盤繞仍會(huì)緊密地結(jié)合在一起。當(dāng)加入中和液后，溶液pH調(diào)恢復(fù)至中性，在高鹽濃度的情況下，染色體DNA之間交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)斗結(jié)構(gòu)并與蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等形成沉淀；不同的是，質(zhì)粒DNAM性迅速而準(zhǔn)確，保持可溶狀態(tài)而留在上清

3、中。這樣，通過離心可沉淀大部分細(xì)胞碎片、染色體DNARNA蛋白質(zhì)。除去沉淀后上清中的質(zhì)粒可用酚氯仿抽提進(jìn)一步純化質(zhì)粒DNA三儀器，材料及試劑儀器：恒溫培養(yǎng)箱，離心機(jī)，恒溫?fù)u床，超凈工作臺(tái)，高壓滅菌鍋，電泳儀，水浴鍋等材料：大腸桿菌DH5a菌株，大腸桿菌BL21菌株，pCM領(lǐng)粒試齊J:SolutionI,SolutionII,SolutionIII,1mol/LCaCl2,TE緩沖3夜,70%Z.醇，酚：氯仿(1:1)等。四實(shí)驗(yàn)步驟1,試劑的準(zhǔn)備SolutionI:1,量取下列溶液，置于1L燒杯中。1MTris-HCL(pH8.0)25mL20mL45mL910ml0.5MEDTA(pH8.0)

4、20%Glucose(1.11M)dH2O2,tWj溫tWj壓火菌后，4c保存。SolutionII:1,量取下列溶液，置于500mL燒杯中。10%SDS50mL2NNaOH50mL2,加滅菌水定容至500mL,充分混勻。SolutionIII:1,量取下列溶液，置于500mL燒杯中。KOAc147gCH3COOH57.5g2 ,加入300ml去離子水后攪拌溶解。3 ,加去離子水將溶液定容至500。4 ,高溫高壓火菌后，4c保存。LB培養(yǎng)基：1,稱取下列試劑，置于1L燒杯中。Tryptone10gYeastExtract5gNaCl10g2,加入約800ml的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙狻?,滴加5

5、NNaOH償00.2ml）,調(diào)節(jié)pH值至7.0。4,加去離子水將培養(yǎng)基定容至1L。5 ,高溫高壓火菌后，4c保存。10XTEBuffer:1,量取下列溶液，置于1L燒杯中。1 MTris-HClBuffer（pH8.0）100ml500mMEDTA（pH8.0）20ml2 ,向燒杯中加入約800ml去離子水，均勻混合。3,將溶液定容至1L后，高溫高壓滅菌。4,室溫保存。2感受態(tài)細(xì)胞制備1）從-80C冰柜中取出一支凍存的大腸桿菌DH5a菌株，在冰塊上解凍后，于事先照過紫外的超凈臺(tái)中，用無菌接種環(huán)輕輕蘸取菌種后，在無抗平板上分區(qū)劃線，將菌種迅速放回-80C保存。平板做好標(biāo)記后，于37c培養(yǎng)約16小

6、時(shí),該細(xì)菌菌落在LB培養(yǎng)基上為1-2mm的透明的淡黃色菌落，有特殊的臭味。2）在照過紫外的超凈臺(tái)中，用滅菌的牙簽挑取單個(gè)菌落，接種入裝有1mlLB培養(yǎng)液的1.5mlEP管中，封口膜封好，于37c恒溫?fù)u床培養(yǎng)10-12小時(shí)，直至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。3）將該時(shí)期的細(xì)菌懸液轉(zhuǎn)接于100mlLB液體培養(yǎng)液中，37C,220rpm,震蕩擴(kuò)大培養(yǎng)約3h,測(cè)細(xì)菌OD600,以0.3-0.4之間最佳。4）將擴(kuò)大培養(yǎng)后的培養(yǎng)物在冰上冷卻10min,轉(zhuǎn)入50ml離心管，4C,4000rmp離心10min。5）倒凈上清液，流盡殘余液體，加入10ml預(yù)冷的0.1mol/L的CaCl2溶液（使細(xì)菌膨脹成球形，外源DNA分子在此

7、條件下易形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸復(fù)合物粘附在細(xì)菌表面）輕輕懸浮細(xì)胞，冰浴30min。6）4C,4000rmp離心10min。7）棄去上清，加入2ml預(yù)冷的15%甘油的0.1mol/L的CaCl2溶液再次懸浮細(xì)胞，即制成了感受態(tài)細(xì)胞懸液。8）每個(gè)1.5mlEP管分裝200科的感受態(tài)細(xì)胞，-70C保存。3轉(zhuǎn)化1）將感受態(tài)細(xì)胞從-70C拿出，放冰塊上解凍。2）在超凈工作臺(tái)中，取空質(zhì)粒1科加去離子水9d稀釋，加入到100科感受態(tài)細(xì)胞中，冰上放置30min。3）42C,熱激60s（促進(jìn)細(xì)胞對(duì)DNA的吸收），迅速再在冰上放置3min。4）加入不含Amp的LB培養(yǎng)液890聞37c振搖1h,使細(xì)菌恢復(fù)正常

8、生長(zhǎng)狀態(tài)，并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗性基因（Amp）。5）從每管中取100科培養(yǎng)液鋪至LBAmp培養(yǎng)板，并涂布均勻。6）室溫放置20min,使液體吸收，37c倒置培養(yǎng)16h。7）挑取單個(gè)菌落，接種于加有Amp的2mlLB培養(yǎng)液中，37C,220rpm,震蕩培養(yǎng)約16h。4質(zhì)粒提?。▔A裂解法）1）力口1.5ml培養(yǎng)物于離心管中，4C,12000rmp/min離心30s。2）倒去上清液，倒置于吸水紙上干燥。3）加入100科l4預(yù)冷的SolutionI重懸，用手劇烈震蕩15s。（低濃度的葡萄糖溶液使細(xì)胞處于低滲狀態(tài)而細(xì)胞膨脹；葡萄糖的作用是增加溶液的粘度，減少抽提過程中的機(jī)械剪切作用，防止破壞DNA。EDT

9、A的作用是螯合掉Mg2+、Ca2+等二價(jià)金屬離子，防止DNA酶對(duì)質(zhì)粒分子的降解作用。Tris?Cl能使溶菌液維持溶菌作用的最適PH范圍）。4）緩慢加入200科新配制的SolutionII,上下顛倒5次。（SDS的作用：破壞細(xì)胞膜；解聚核蛋白并與蛋白質(zhì)分子結(jié)合使之變性。NaOH（pH>12）的作用：破壞氫鍵，使DNA分子變性）。5）加入150科用冰預(yù)冷的SolutionIII,蓋緊管口，上下顛倒10次，放冰上3-5分鐘。（：由KAc與HAc組成，是pH值為5.5的高鹽溶液。能中和溶液II的堿性，使DNA復(fù)性。K+離子會(huì)與SDS形成溶解度很低的鹽并與蛋白質(zhì)形成沉淀而除去。溶液中的染色體DNA

10、也會(huì)與蛋白質(zhì)-SDS形成相互纏繞的大分子物質(zhì)，很容易與小分子的質(zhì)粒DNA分離）。6）4C,12000rmp/min離心5min,吸上清400科夥到另一離心管中。7）加等量酚：氯仿（各200m（使蛋白質(zhì)變性，并使液相和有機(jī)相分離），震蕩15min。8）4C,12000rmp/min離心2min,將上清液移到另一離心管，切勿吸到下層溶液，取300dl即可。9）加入2倍體積的無水乙醇（奪取DNA外的水合層使DNA聚合而沉淀），室溫放置2min,4C,12000rmp/min離心5min,上下顛倒5次使其反應(yīng)充分。10）棄去上清，將離心管倒置于吸水紙上。11）加入1ml70%乙醇（與無水乙醇的作用類似

11、，同時(shí)可以清洗DNA,溶解與DNA一起沉淀下來的離子。），用槍頭把沉淀吸起來，4C,12000rmp/min離心2min。12）棄上清，倒置于吸水紙上。13）各加入1科lRNase（降解RNA污染物），30科lTE14）封口膜封上，37c孵育1h。5瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果用微量分光光度計(jì)測(cè)質(zhì)粒濃度，濃度在2000ng/科時(shí)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。1）制備瓊脂糖凝膠：稱取0.8g瓊脂糖，加入100ml1>TAE緩沖液，置微波爐中加熱至完全融化，取出搖勻，即為瓊脂糖凝膠液，冷卻至50-60C后倒入到放有梳子的有機(jī)玻璃內(nèi)槽中，形成一層均勻的膠面，凝固后，拔出梳子，放入加有電泳緩沖液的電泳槽中。2）加樣：第一孔加入6IMarker其余幾孔加入混有l(wèi)oadingbuffer的質(zhì)粒。3）電流80mA,電壓110V,電泳40min。4）電泳結(jié)束后看結(jié)果。五結(jié)果分析M12345678910M:2000DNAmarker2,5,8孔為轉(zhuǎn)化入BL21細(xì)菌的質(zhì)粒。1,3,4,6,7,9,10孔為轉(zhuǎn)化入DH5a細(xì)胞的質(zhì)粒。正常質(zhì)粒是閉合的雙鏈DNA。在提取過程或電泳