杜仲水提物對四氯化碳所致小鼠肝損傷的保護(hù)作用

1、杜仲水提物對四氯化碳所致小鼠肝損傷的保護(hù)作用 作者：周程艷 余海平 陶志彬 高艷山 邊洪榮【摘要】 目的研究杜仲水提物對CCl4所致小鼠肝損傷的保護(hù)作用。方法采用0.08%CCl4造成小鼠急性肝損傷，檢測ALT，AST，SOD的活性和MDA，GSH-Px的水平。將肝大葉HE染色，觀察杜仲水提物對小鼠肝臟組織病的影響。結(jié)果杜仲水提物能明顯降低CCl4所致的肝損傷小鼠肝脾指數(shù)的升高(P0.01)和血清中ALT、AST活性的升高(P0.01);亦能降低肝組織中MDA 的水平，增加肝組織中SOD的活性和GSH-Px的水平(P0.01)。結(jié)論杜仲水提物具有顯著的抗肝損傷的作用。 【關(guān)鍵詞】 杜仲; 四氯

2、化碳; 肝損傷Abstract：ObjectiveTo study the protective effect of the water extract from Eucommia ulmoides against liver injury in mice induced by Carbon Tetrachlitied(CCl4).MethodsMouse model with liver injury was induced by 0.08% CCl4.Activities of ALT,AST,SOD were examined ,and levels of MDA,GSH were de

3、termined.ResultsThe water extract from Eucommia ulmoides could remarkably resist the increase of ALT,AST(P0.01),decrease MDA level(P0.01),and improve SOD activtity and GSH-PX level(P0.01).ConclusionThe water extract from Eucommia ulmoides has remarkable protective effect against liver injury in mice

4、.Key words：Eucommia ulmoides Oliver; Carbon tetrachlotide(CCl4); Liver-injury杜仲Eucommia ulmoides Oliver又名絲連皮、扯絲皮等，杜仲科杜仲屬落葉喬木，為我國特有樹種。神農(nóng)本草經(jīng)、本草綱目均把杜仲列為中上品，并明確記載了其功效：“主治腰脊疼，補中，益精氣，堅筋骨，強志，除陰下癢濕，小便余瀝，安胎，久服輕身不老”1 。本文實驗研究杜仲水提物對CCl4造成的肝損傷小鼠的影響，并初步探討其作用機(jī)制，為杜仲的進(jìn)一步開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。此實驗尚屬首次。1 材料與儀器1.1 藥品谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)

5、氨酶(AST)試劑盒(批號 20080327);超氧化物歧化酶(SOD)測試盒、丙二醛(MDA)測試盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測試盒和考馬斯亮藍(lán)蛋白測定試劑盒(批號 20080414);以上試劑盒均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。聯(lián)苯雙酯，為浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠產(chǎn)品，批號 070806;四氯化碳(CCl4，分析純)，為天津市藥通化學(xué)試劑有限公司，批號 20060215;實驗時用花生油配成0.08% CCl4溶液。試劑標(biāo)準(zhǔn)樣品： Pb，As，Hg，Cd，Al標(biāo)準(zhǔn)液，均為1 mg/ml(計量院計量所，批號20080102)。1.2 動物清潔級昆明種鼠，雌雄各半，體重1822 g

6、。由河南省實驗動物中心提供，合格證號：SCXK豫20050001。1.3 儀器Biofuge strutos型高速低溫離心機(jī)(Kendro Laboratory products)。JY92-2D型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝科器研究所)。YKH-I型液體快速混合器(江西醫(yī)療器械廠)。TU-1800紫外分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)。RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)。DK-8D數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市醫(yī)療儀器廠)。儀器美國PE一5000原子吸收分光光度計， Pb，As，Hg，Cd，Al空心陰極燈。2 方法22.1 杜仲皮的采制和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)鑒定杜仲，于河北省唐山市郊區(qū)2008-

7、03-25自行采制剝?nèi)。瑯潺g為20年，刮去粗皮，堆置“發(fā)汗”至內(nèi)皮呈紫褐色，曬干，存放在通風(fēng)良好的陰面標(biāo)本室備用。經(jīng)華北煤炭醫(yī)學(xué)院藥劑學(xué)教研室韓剛鑒定為杜仲科植物杜仲Prismatomeris tetrandra (Rox -b.) K. Schum. 的樹皮。因此次采集的植物為野生生長，沒用過任何農(nóng)藥，因此無任何農(nóng)藥殘留。筆者參照2005版本中國藥典記載的高效液相色譜法對其有效成分進(jìn)行了測定，本品含松脂醇二葡萄糖苷(C32H42O16)為0.25%，完全符合藥典要求。并對其進(jìn)行了5種重金屬元素的含量測定，含As 0.007 57gg-1，含Pb0.044 6gg-1，含Hg 0.007gg-

8、1，含Cd 0.013 0gg-1，含Al0.005 464gg-1，亦完全符合中國藥典要求。因此得出結(jié)論，本次采集的杜仲，完全符合中國藥典要求，可以入藥使用。2.2 杜仲水提物的制備及其質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)將杜仲皮粉碎成粗粉，用水加熱提取兩次，合并提取液，濾過，濃縮至所需濃度，于4冰箱保存?zhèn)溆?。通過，所提取物占生藥的比率為6.67%。杜仲水提物成分群主要為各種多糖和黃酮類。筆者參照2005版本中國藥典記載的高效液相色譜法，對水提物中的標(biāo)志性成分松脂醇二葡萄糖苷進(jìn)行了測定，結(jié)果含松脂醇二葡萄糖苷(C32H42O16)為3.58%。2.3 杜仲水提物對CCl4致小鼠肝損傷的影響小鼠60只，雌雄各半，隨機(jī)

9、分為6組，每組10只，即正常組，模型組，陽性組，中藥高劑量組、中劑量組、低劑量組。各組每天ig，給藥容量為20 mlkg-1d-1，連續(xù)10 d。正常組和模型組給予蒸餾水，陽性組給予聯(lián)苯雙酯0.60 g/kg，中藥高、中、低劑量組分別給予杜仲水提液163.80，81.90，40.95 g生藥/kg。末次給藥后禁食不禁水，8 h后，除正常組外，其余各組均腹腔注射(ip)0.08%CCl4花生油溶液0.1 ml/10g，12 h后眼球取血，分離血清。2.4 檢測指標(biāo)檢測血清中的ALT，AST的活性;取肝臟、脾臟稱量，計算肝指數(shù)、脾指數(shù);取一部分肝臟用生理鹽水制成10%的肝勻漿，用于檢測肝組織中的S

10、OD的活性、MDA和GSH-Px的水平。將肝大葉用10%福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，HE染色，然后評分。2.5 數(shù)據(jù)處理各組實驗數(shù)據(jù)均以 s表示，采用統(tǒng)計軟件SPSS13.0進(jìn)行組間t檢驗，P0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。3 結(jié)果3.1 杜仲水提物對小鼠肝臟、脾臟系數(shù)的影響結(jié)果見表1。與正常組比較，模型組小鼠肝脾重量明顯增加，肝脾指數(shù)顯著升高(P0.01)。與模型組比較，杜仲水提物各劑量組小鼠肝脾指數(shù)顯著降低(P0.01)，并呈現(xiàn)劑量依賴性。結(jié)果提示，杜仲水提物能明顯對抗CCl4致肝損傷小鼠肝脾指數(shù)的升高。表1 杜仲水提物對CCl4致肝損傷小鼠的肝脾重量及肝脾指數(shù)的影響與正常對照組比較，*P0.01

11、;與模型對照組比較，P0.01;與中藥高劑量組比較，P0.01;與中藥中劑量組比較，#P0.01;n=101 3.2 杜仲水提物對小鼠血清中ALT，AST的影響結(jié)果見表2。常規(guī)分離血清，按照說明書的要求測試ALT，AST的活性。與正常組比較，模型組小鼠血清中ALT，AST活性顯著升高(P0.01)，提示造模成功。與模型組比較，杜仲水提物各劑量組大鼠血清中ALT、AST活性的顯著降低(P0.01)，并呈現(xiàn)劑量依賴性。結(jié)果提示杜仲水提物能顯著對抗CCl4導(dǎo)致的肝損傷小鼠血清中ALT，AST的活性升高。表2 杜仲水提物對CCl4致小鼠肝損傷血清中ALT，AST活性的影響3.3 杜仲水提物對小鼠肝組織

12、中SOD活性，MDA、GSH-Px水平的影響結(jié)果見表3。與正常組比較，模型組小鼠肝組織中SOD活性、GSH-Px水平顯著降低(P0.01)，MDA水平顯著增加(P0.01)，提示造模成功。與模型組比較，杜仲水提物各劑量組小鼠肝組織中MDA的含量顯著降低(P0.01)， 而肝組織中的SOD的活力和GSH-Px的水平顯著增強(P0.01);并且杜仲水提物各劑量組效果呈現(xiàn)劑量依賴性。結(jié)果提示,杜仲水提物能顯著的對抗CCl4導(dǎo)致的肝損傷小鼠肝組織中MDA的升高，同時能顯著對抗肝組織中SOD的活力和GSH-Px的水平的降低。3.4 杜仲水提物對小鼠肝臟組織病的影響見圖1。肝組織病理檢查結(jié)果表明，正常對照

13、組：小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清楚，肝細(xì)胞正常，未見明顯病理改變。模型對照組：小鼠肝細(xì)胞有較多點狀壞死，肝細(xì)胞體積明顯增大，廣泛水腫，部分肝細(xì)胞脂肪變性;肝血竇受壓，變窄;間質(zhì)及匯管區(qū)有不等量的炎性細(xì)胞浸潤;與正常組比較有顯著性差異，提示造模成功。陽性對照組：小鼠肝細(xì)胞水腫不明顯，偶見點狀壞死，匯管區(qū)少量炎細(xì)胞浸潤。杜仲水提物各劑量組：各給藥組小鼠肝細(xì)胞病變明顯好轉(zhuǎn)，其中高劑量組效果最好，小鼠肝細(xì)胞水腫不明顯，可見肝細(xì)胞再生現(xiàn)象，偶伴有點狀壞死，匯管區(qū)少量炎細(xì)胞浸潤;與高劑量組相比中劑量組效果稍差;低劑量組效果最差，但是小鼠肝細(xì)胞水腫亦明顯減輕，部分肝細(xì)胞恢復(fù)正常。表3 杜仲水提物對CCl4致肝損傷小鼠肝

14、組織中SOD活性的影響和肝組織中MDA，GSH-Px水平的影響4 討論CCl4 急性肝損傷模型是最早使用的一種經(jīng)典的實驗性肝損傷動物模型，應(yīng)用最多最廣、最成熟，同時此模型還能準(zhǔn)確反映肝細(xì)胞的功能、代謝及形態(tài)學(xué)變化,重復(fù)性較好3，因此一直是篩選具有保肝降酶作用藥物的常用模型之一4，與病毒性肝炎的病理解剖、病理生理諸方面的改變和表現(xiàn)出來的癥狀及肝功能檢測的指標(biāo)等方面具有相似性5。一般認(rèn)為CCl4損傷肝組織機(jī)制是CCl4經(jīng)肝細(xì)胞色素P450代謝激活后生成三氯甲基自由基(CCl3)和氯自由基(Cl)，引起生物膜脂質(zhì)過氧化，造成膜結(jié)構(gòu)和功能損傷，蛋白質(zhì)等物質(zhì)合成代謝發(fā)生障礙，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷壞死，胞漿內(nèi)轉(zhuǎn)

15、氨酶滲入血液，肝細(xì)胞脂質(zhì)過氧化或壞死。CCl4在體內(nèi)對肝細(xì)胞親和力大，自由基的形成及引發(fā)的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是CCl4損傷肝組織的主要機(jī)制6。誘導(dǎo)微粒體細(xì)胞色素P450同工酶活性的物質(zhì)可增加CCl4產(chǎn)物的肝毒性,因此在制模過程中加入戊巴比妥或乙醇代替飲水是加速肝損傷進(jìn)程的常用方法7。根據(jù)肝損傷的病因病機(jī)，中醫(yī)對其進(jìn)行辨證論治須采用清熱解毒、利膽除濕、健脾和胃、理氣活血、軟堅散結(jié)、養(yǎng)血柔肝、滋補肝腎等方法。杜仲具有補中、益精氣、堅筋骨的功效，在前期的實驗研究和調(diào)查中就已顯示其具有較好的抗肝損傷的作用1。本實驗結(jié)果亦顯示，杜仲水提物能明顯降低CCl4所致的肝損傷小鼠肝脾指數(shù)的升高(P0.01)和血清中ALT

16、、AST活性的升高(P0.01);亦能降低肝組織中MDA 的水平，升高肝組織中SOD的活性和GSH-Px的水平(P0.01)。因此杜仲具有明顯的抗肝損傷的作用，杜仲高劑量組的效果最好，中劑量組次之，低劑量組最差，3個劑量組呈現(xiàn)良好的劑量關(guān)系。推測其抗肝損傷的機(jī)理可能與能增強小鼠清除自由基的能力，能抑制自由基啟動的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，肝細(xì)胞受到自由基攻擊時可因其過度消耗而減少有關(guān)。但是，杜仲抗肝損傷的作用還沒有深入研究，因此本實驗對其進(jìn)行的系統(tǒng)研究，將對開發(fā)杜仲成為新的抗肝損傷的藥物具有極大的價值?！緟⒖肌?1 江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典(上冊)M.上海：上海技術(shù)出版社，1986：2090.2 徐叔云，卞如濂，陳 修，等. 藥理實驗方法學(xué)，第3版M.北京：人民衛(wèi)生出版社， 2002：1346.3 于 強,于 洋. 肝損傷動物模型及中藥研究概況J. 中藥, 2006, 8(11): 25.4 Bozkurt S, Ersoy E, Tekyn HE. The eytoprotective effort of iloprost against carbon tetrachloride induced hecrosis in rat liverJ. Res common Mol Pathol pharmacol, 1997, 95(3): 343.5 龔峻梅，