過氧化氫酶動力學(xué)常數(shù)測定

1、實(shí)驗項目二、過氧化氫酶的活力和動力學(xué)常數(shù)測定姓名：趙家熙指導(dǎo)教師:譚志文實(shí)驗室:6503組員：章恒炯成績：第三部分：實(shí)驗記錄與分析一、酶活力測定（一）原始數(shù)據(jù)1 .樣品原始質(zhì)量：5.032g2 .標(biāo)定數(shù)據(jù)：（1） KMnO4質(zhì)量數(shù)及配制：158（2） Na2c2O4質(zhì)量數(shù)：134（3）標(biāo)定數(shù)據(jù)：0.02mol/L（4） KMnO4實(shí)際濃度:0.019mol/L3 .樣品滴定數(shù)據(jù)消耗高鎰酸鉀溶液（ml）:實(shí)驗（1）0.65實(shí)驗（2）0.50對照（1）1.45對口咐（2）1.30（二）結(jié)果計算1 .換算系數(shù)（1mLKMnO4溶液相當(dāng)于多少mgH2O2）1.72 .樣品酶活計算（每克鮮重樣品1min

2、內(nèi)分解H2O2的毫克數(shù)表示:mgH202/g?min）酶活(mgH2O2/gmin)=(A B) Vt 1.7FW V 1 t(A-B)=0.8Vt=20.25FW=5.032Vi=2.5mlt=10min酶活(mgH2O2/gmin)=0.218二、動力學(xué)常數(shù)的測定（一）原始數(shù)據(jù)編號12345消耗的KMnO4(mL)0.100.100.400.300.30（二）求出各管反應(yīng)前的底物濃度S0和反應(yīng)速度V0編號12345So(mol/L)0.0050.00670.00820.01250.0250Vo(mmol/min)0.00990.01240.01260.02210.0471(三)以1/V0對

3、1/S0作圖(用excel作圖)1/s200149.2121.980401/v111.180.679.345.121.2(四)求出Km(mol/L)和Vmax(mmol/min)1Km1-rvVmaxSVmax如(三)中圖y=0.5572x+1.5829x=0時y=1/Vmaxy=0時x=-1/KmKm=0.35Vmax=0.63第四部分：課后研討題1 .總結(jié)本實(shí)驗操作過程的注意事項。1酶的提取和存放一般在0-4C下進(jìn)行。2每個三角瓶內(nèi)的酶促反應(yīng)時間要精確控制在5min。3各反應(yīng)瓶的滴定終點(diǎn)微紅色為同一標(biāo)準(zhǔn)。4使用前應(yīng)檢查滴定管是否滲漏，滴定過程中應(yīng)該保證逐滴加入。2 .影響過氧化氫酶活力測定

4、的因素有哪些？1、溫度，溫度過高或者過低會降低過氧化氫酶的活性。2、酸堿度，酸或堿濃度太高會使過氧化氫酶失活。3 .過氧化氫酶與哪些生化過程有關(guān)？R(Fe2+)+H2O2=R(Fe3+OH-)R(Fe3+OH-)2+H2O2=R(Fe2+)2+2H2O+O2過氧化氫酶t2H.O22H2O+O24. 在反應(yīng)速度的測定中，加入硫酸有哪些作用？終止反應(yīng)，為下一步的滴定提供酸的環(huán)境。5. 米氏方程中的Km有何實(shí)際應(yīng)用？米氏常數(shù)是酶促反應(yīng)速度n為最大酶促反應(yīng)速度值一半時的底物濃度?？捎糜谂袛喾磻?yīng)級數(shù)；判斷是否為不同種酶；判斷酶的最適底物；確定酶活性測試時所需底物的濃度。6. 在什么條件下，酶的Km可以作

5、為鑒定酶的一種手段，為什么？當(dāng)hVmax/2時，Km=S。Km值是酶促反應(yīng)速度為最大速度一半時的底物濃度。Km值對某一特定酶來說是個常數(shù)。一半根據(jù)酶的Km值來判斷這些酶是否是完全相同的酶，或是催化同一反應(yīng)的一類酶。Km值越大，酶與底物親和力越小；Km值越小，酶與底物親和力越大。7. 測定酶活力為什么要在進(jìn)程曲線的初速度時間范圍內(nèi)進(jìn)行？進(jìn)程曲線是在酶反應(yīng)的最適條件下采用每隔一定時間測產(chǎn)物生成量的方法，以酶反應(yīng)時間為橫坐標(biāo)，產(chǎn)物生成量為縱坐標(biāo)繪制而成。從進(jìn)程曲線可知，在曲線起始一段時間內(nèi)為直線，其斜率代表初速度。隨反應(yīng)時間延長，曲線趨于平坦，斜率變小，說明酶的反應(yīng)速度下降。反應(yīng)速度隨反應(yīng)時間的延長

6、而降低這一現(xiàn)象可能是由于底物濃度的降低和產(chǎn)物濃度的增高致使逆反應(yīng)加強(qiáng)等原因所致。8. 過氧化氫酶的活力測定還有另外一種方法，即紫外吸收法，原理是H2O2在240nm波長下有強(qiáng)烈吸收，過氧化氫酶能分解過氧化氫，使反應(yīng)溶液吸光度(A240)隨反應(yīng)時間而降低。根據(jù)測量吸光率的變化速度即可測出過氧化氫酶的活力。請你查閱資料設(shè)計一個應(yīng)用該方法測定過氧化氫酶活力的實(shí)驗。實(shí)驗概要本實(shí)驗用紫外吸收法測定了過氧化氫酶的活性。主要試劑0.2mol/LpH7.8磷酸緩沖液（內(nèi)含1%聚乙烯叱咯烷酮）；0.1mol/LH2O2（用0.1mol/L高鈕酸鉀標(biāo)定）。主要設(shè)備紫外分光光度計；離心機(jī)；研缽；250ml容量瓶1個

7、；0.5ml刻度吸管2支，2ml刻度吸管1支；10ml試管3支；恒溫水浴。實(shí)驗步驟1.酶液提?。悍Q取新鮮小麥葉片或其它植物組織0.5g置研缽中，加入23ml4 c下預(yù)冷的pH7.0磷酸緩沖液和少量石英砂研磨成勻漿后，轉(zhuǎn)入25ml容量瓶中，并用緩沖液沖洗研缽數(shù)次，合并沖洗液，并定容到刻度?；旌暇鶆?qū)⒘科恐? c冰箱中靜置10min,取上部澄清液在4000rpm下離心15min,上清液即為過氧化氫酶粗提液。5C下保存?zhèn)溆谩? .測定：取10ml試管3支，其中2支為樣品測定管，1支為空白管，按表順序加入試劑。表紫外吸收法測定H2O2樣品液配置表管號S1S2S3粗酶液（ml）0.20.20.2pH7.8磷酸(ml)1.51.51.5蒸儲水（ml）1.01.01.025C預(yù)熱后，逐管加入0.3ml0.1mol/L的H2O2,每加完一管立即記時，并迅速倒入石英比色杯中，240nm下測定吸光度，每隔1min讀數(shù)1次，共測4min,待3支管全部測定完后，按下式計算酶活性。3 .結(jié)果計算：以1min內(nèi)A240減少0.1的酶量為1個酶活單位（u）。44犯xVt過氧化氫酶活性（u/gFW/min尸一！.二（Ast4-Rsz）式中A240=AS02AS0一加入煮死酶液的對照管吸光值；AS1,AS2一樣品管吸光