丙二醛含量測(cè)定講解學(xué)習(xí)

1、丙二醛含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)六、植物組織丙二醛含量測(cè)定植物葉片在衰老過(guò)程中發(fā)生一系列生理生化變化，如核酸和蛋白質(zhì)含量下降、葉綠素降解、光合作用降低及內(nèi)源激素平衡失調(diào)等。這些指標(biāo)在一定程度上反映衰老過(guò)程的變化。近來(lái)大量研究表明，植物在逆境脅迫或衰老過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)活性氧代謝的平衡被破壞而有利于活性氧的積累。活性氧積累的危害之一是引發(fā)或加劇膜脂過(guò)氧化作用，造成細(xì)胞膜系統(tǒng)的損傷，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致植物細(xì)胞死亡?；钚匝醢ê踝杂苫?。自由基是具有未配對(duì)價(jià)電子的原子或原子團(tuán)。生物體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧主要有超氧自由基（O-2）、羥自由基（OH）、過(guò)氧自由基（ROO）、烷氧自由基（RO）、過(guò)氧化氫（H2O2、單線(xiàn)態(tài)氧（O21）等

2、。植物對(duì)活性氧產(chǎn)生有酶促和非酶促兩類(lèi)防御系統(tǒng)，超氧化物歧化酶（SOD過(guò)氧化氫酶（CAT）、過(guò)氧化物酶POES口抗壞血酸過(guò)氧化物酶（ASA-POD等是酶促防御系統(tǒng)的重要保護(hù)酶，抗壞血酸（ASA）和還原型谷胱甘肽（GSH常是非酶促防御系統(tǒng)中的重要抗氧化劑。丙二醛（MDA尾細(xì)胞膜脂過(guò)氧化作用的產(chǎn)物之一，它的產(chǎn)生還能加劇膜的損傷。因此，丙二醛產(chǎn)生數(shù)量的多少能夠代表膜脂過(guò)氧化的程度，也可間接反映植物組織的抗氧化能力的強(qiáng)弱。所以在植物衰老生理和抗性生理研究中，丙二醛含量是一個(gè)常用指標(biāo)。原理植物組織中的丙二醛（MDA）在酸性條件下加熱可與硫代巴比妥酸（TBA）產(chǎn)生顯色反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物為粉紅色的3,5,5三甲基

3、惡噪2,4一二酮（Trimet-nine）。該物質(zhì)在539nm波長(zhǎng)下有吸收峰。由于硫代巴比妥酸也可與其它物質(zhì)反應(yīng)，并在該波長(zhǎng)處有吸收，為消除硫代巴比妥酸與其它物質(zhì)反應(yīng)的影響，在丙二醛含量測(cè)定時(shí)，同時(shí)測(cè)定600nm下的吸光度，利用539nm與600nm下的吸光度的差值計(jì)算丙二醛的含量。材料、儀器、藥品1 .材料：植物抗逆性鑒定實(shí)驗(yàn)中的四種菠菜樣品，即綠色和黃色葉片的高溫處理和室溫對(duì)照。2 .儀器：（1）分光光度計(jì)；（2）離心機(jī)；（3）水浴鍋：（4）天平；（5）研缽；（6）剪刀；（7）5ml刻度離心管；（9）刻度試管（10ml）;（10）鐐子；（11）移液管（5ml、2ml、1ml）;（12）冰箱

4、。3 .藥品：（1） 0.05mol/LpH7.8磷酸鈉緩沖液；（2）石英砂；（3） 5%三氯乙酸溶液：稱(chēng)取5g三氯乙酸，先用少量蒸儲(chǔ)水溶解，然后定容到100ml;（4） 0.5%硫代巴比妥酸溶液：稱(chēng)取0.5g硫代巴比妥酸，用5%三氯乙酸溶解，定容至100ml,即為0.5%硫代巴比妥酸的5%三氯乙酸溶液。方法1 .丙二醛的提?。喝?.5g樣品，加入2ml預(yù)冷的0.05mol/LpH7.8的磷酸緩沖液，加入少量石英砂，在經(jīng)過(guò)冰浴的研缽內(nèi)研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移到5ml刻度離心試管，將研缽用緩沖液洗凈，清洗也移入離心管中，最后用緩沖液定容至5ml。在4500轉(zhuǎn)/min離心10min。上清液即為丙二醛提取液

5、。2 .丙二醛含量測(cè)定：吸取2ml的提取液于刻度試管中，加入0.5%硫代巴比妥酸的5%三氯乙酸溶液3ml,于沸水浴上加熱10min,迅速冷卻。于4500轉(zhuǎn)/min離心10min。取上清液于532、600nm波長(zhǎng)下，以蒸儲(chǔ)水為空白調(diào)透光率100%測(cè)定吸光度。3 .結(jié)果計(jì)算：(A532A600)XV1XV丙二醛含量(nmol/g)=1.55X10-1xW<V2式中：A為吸光度；V1為反應(yīng)液總量(5m1);V為提取液總量(5ml);V2為反應(yīng)液中的提取液數(shù)量(2ml);W為植物樣品重量(0.5g);1.55X10-1為丙二醛的微摩爾吸光系數(shù)(在1升溶液中含有1mol丙二醛時(shí)的吸光度)。4 .注

6、意事項(xiàng)：0.10.5%的三氯乙酸對(duì)MDA-TBA反應(yīng)較合適，若高于此濃度，其反應(yīng)液的非專(zhuān)一性吸收偏高；MDATBA顯色反應(yīng)的加熱時(shí)間，最好控制沸水浴1075min之間。時(shí)間太短或太長(zhǎng)均會(huì)引起532nm下的光吸收值下降；(3)如用MDA乍為植物衰老指標(biāo)，首先應(yīng)檢驗(yàn)被測(cè)試材料提取液是否能與TBA反應(yīng)形成532nm處的吸收峰。否則只測(cè)定532、600nm兩處A值，計(jì)算結(jié)果與實(shí)際情況不符，測(cè)得的高A值是一個(gè)假象；(4)在有糖類(lèi)物質(zhì)干擾條件下(如深度衰老時(shí))，吸光度的增大，不再是由于脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MD給量的升高，而是水溶性碳水化合物的增加，由此改變了提取液成分，不能再用532nm600nm兩處A值計(jì)算MD貽量，可測(cè)定510、532、560nm處的A值，用A532(A510A560)/2的值來(lái)代表丙二醛與TBA反應(yīng)液的吸光值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄實(shí)驗(yàn)前思考題(1)通過(guò)丙二醛含量測(cè)定能夠解決什么理論和實(shí)際問(wèn)題？(2)什么時(shí)候植物會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的膜脂過(guò)氧化作用？簡(jiǎn)述其過(guò)氧化作用過(guò)程。(3)說(shuō)明膜脂過(guò)氧化作用的對(duì)植物的效應(yīng)。(4)TBA為什么要溶解在三氯乙酸中？(5)提取液與TBA的混合液為什么要加熱？為什么加熱時(shí)間又不能過(guò)長(zhǎng)？(6)為什么要測(cè)定反應(yīng)液在600nm下的吸光度？(7)在計(jì)算公式中，為什么吸光系數(shù)的單位是微摩爾，而最后的含量單位卻是毫微摩爾？(8)寫(xiě)出實(shí)驗(yàn)時(shí)間