大蒜素對(duì)大鼠肝損傷細(xì)胞因子保護(hù)作用

1、大蒜素對(duì)大鼠肝損傷細(xì)胞因子保護(hù)作用    【摘要】  目的 研究大蒜素對(duì)高脂飲食致大鼠慢性肝損傷的保護(hù)作用及內(nèi)毒素(Lps)刺激引起肝臟枯否細(xì)胞(KCs)分泌細(xì)胞因子的變化。方法 Wistar大鼠隨機(jī)分為3組，10周后腹主動(dòng)脈采血測(cè)定血漿丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、白細(xì)胞介素(IL)6、IL(10)、腫瘤壞死因子(TNF)水平，取肝組織用于組織病理切片的制備。分離培養(yǎng)KCs，檢測(cè)在Lps刺激下KCs上清液中IL6、IL10、TNF的水平。結(jié)果 大鼠發(fā)生慢性肝損傷時(shí)，血清ALT及IL6、TNF水平明顯升高(P<005)，IL10水平顯著下降

2、(P<001)，大蒜素可減輕慢性肝損傷，降低血清IL6水平(P<005)。各組大鼠分離培養(yǎng)KCs在加入Lps刺激后，上清液中IL6、TNF水平變化與以上結(jié)果十分相似，藥物組L10水平顯著升高(P<005)。結(jié)論 大蒜素對(duì)肝臟的保護(hù)作用，可能通過調(diào)節(jié)KCs對(duì)細(xì)胞因子的分泌來實(shí)現(xiàn)。 【關(guān)鍵詞】  大蒜素大蒜素作為一種來源廣泛的含硫化合物，其對(duì)四氯化碳、酒精等引起的肝損傷有明顯保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn)，大蒜素對(duì)高脂飲食引起的慢性肝損傷有明顯的保護(hù)作用，但機(jī)制尚未闡明。為此，我們通過復(fù)制大鼠慢性肝損傷模型，觀察大蒜素對(duì)肝臟枯否細(xì)胞(KCs) 分泌調(diào)節(jié)的影響。1  材料與

3、方法11  材料111  實(shí)驗(yàn)動(dòng)物  Wistar 雌性大鼠，體重150170g(山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心)。112  主要試劑及藥物  膽固醇(北京化學(xué)試公司)；大蒜素膠囊(湖北金龍藥業(yè)公司)；IV型膠原酶、胎牛血清培養(yǎng)液(DMEM)、Percoll液、內(nèi)毒素(Lipopolysaccharide,Lps from Escherichia coli 0111:B4)(美國(guó)Sigma公司)；白細(xì)胞介素(IL)6、IL10、腫瘤壞死因子(TNF)(解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放射免疫所)；胎牛血清(杭州四季青生物工程公司)。12  方法121&

4、#160; 動(dòng)物模型的建立  選用雌性Wistar大鼠36只，正常喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為3組，對(duì)照組正常飲食飼養(yǎng)；模型組給予高脂飲食(普通飼料+5%的膽固醇+15%的玉米油)；藥物組高脂飲食同時(shí)隔日大蒜素(05%，10ml/kg)灌胃。10周后各組取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物8只，1%戊巴比妥鈉麻醉后腹主動(dòng)脈采血處死動(dòng)物，取肝左葉置于10%中性福爾馬林固定備做病理切片。122  血清指標(biāo)的檢測(cè)  采集的血液經(jīng)肝素抗凝后，3 000r/min離心15 min，分離血漿，用于丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、IL6、IL10、TNF水平的檢測(cè)，按試劑盒說明書進(jìn)行操作。123  枯否細(xì)胞

5、的分離、培養(yǎng)及鑒定  采用改進(jìn)Seglen膠原酶兩步灌流和Percoll密度梯度離心法分離得到各組大鼠肝臟細(xì)胞，經(jīng)5%CO2、37恒溫培養(yǎng)箱孵育4h,洗去未貼壁細(xì)胞。經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)非特導(dǎo)性酯酶染色，活性和純度分別達(dá)到95%時(shí)，調(diào)細(xì)胞數(shù)為5×106，接種于48孔培養(yǎng)板中，每組8孔。124  培養(yǎng)上清液細(xì)胞因子的檢測(cè)  于培養(yǎng)液中加入100mg/ml Lps2滴，4h后收集培養(yǎng)上清，用于IL8、TNF、IL10的測(cè)定。13  統(tǒng)計(jì)分析  計(jì)量資料用±s表示，采用SPSS 120軟件進(jìn)行方差分析(SNK法)。2  結(jié)果21&#

6、160; 慢性肝損傷結(jié)果211  肝組織病理學(xué)變化  肝組織病理學(xué)顯示，模型組與藥物組大鼠體肝組織均出現(xiàn)不同程度的彌漫性改變，肝內(nèi)可見到大量的脂肪空泡(肝小葉內(nèi)含脂滴細(xì)胞/總細(xì)胞數(shù)>1/3)及肝細(xì)胞氣球樣變、小葉內(nèi)和匯管區(qū)有大量的以單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，但未見明顯肝纖維化，表明慢性損傷大鼠發(fā)生脂肪肝炎；與模型組相比，藥物組大鼠肝組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕。212  血清ALT的變化  對(duì)照組為(615±126)u/L，而模型組與藥物組ALT水平明顯升高，分別為(2103±1054)，(1441±729)u

7、/L，與對(duì)照組比較，P<005。藥物組與模型組比較，ALT水平顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<005。213  血清IL6、IL10、TNF的變化(表1)  隨著動(dòng)物發(fā)生慢性肝損傷，模型組與藥物組IL6、TNF水平明顯升高 ，IL10則明顯下降；藥物組IL6水平明顯低于模型組，而TNF降低及IL10升高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表1  大蒜素對(duì)血漿胞因子的影響（略）注：與對(duì)照組比較,a P<001；b P<005；與模型組比較,c P<00522  枯否細(xì)胞的分離、培養(yǎng)結(jié)果221  KCs形態(tài)的改變與對(duì)照比較 

8、 分離KCs結(jié)果表明，對(duì)照組KCs體積較小，形態(tài)相對(duì)規(guī)整，胞漿突起纖細(xì)，胞漿內(nèi)僅有少量空泡。而模型組KCs體積明顯增大，核漿比例增大，胞漿突起明顯增多、變粗、胞漿高度空泡化，吳典型的活化狀態(tài)。222  KCs分泌細(xì)胞因子的變化(表2)  加入Lps后，模型組與藥物組培養(yǎng)上清液中IL6、TNF水平明顯高于對(duì)照組，IL10、水平發(fā)生明顯下降。藥物組與高脂組比較IL6、TNF水平顯降低，而IL10水平顯著升高。表2  大蒜素對(duì)大鼠KCs培養(yǎng)上清液細(xì)胞因子的影響（略）注：與對(duì)照組比較，a P<001，b P<005；與模型組比較，c P<001，d P&

9、lt;0053  討論近年來，非酒精性脂肪肝炎發(fā)病率明顯增高，盡管該病的發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明，但對(duì)先天肥胖性ob/ob小鼠和fa/fa大鼠研究表明，KCs分泌功能紊亂參與了疾病的發(fā)生。其自然發(fā)展成為脂肪肝，特征有胰島素抵抗、肥胖、脂質(zhì)代謝紊亂，與人類的非酒精性脂肪肝炎直接相關(guān)。Yang等提出肥胖個(gè)體枯否細(xì)胞功能紊亂可以增加肝細(xì)胞對(duì)內(nèi)毒素的敏感性，從而加速脂肪肝炎的形成。對(duì)肥胖、瘦素受體功能紊亂的大鼠、小鼠枯否細(xì)胞體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，枯否細(xì)胞表型異常，在給予內(nèi)毒素刺激后與對(duì)照比較，促炎因子IL6、TNF表達(dá)增加，而抑炎因子IL10表達(dá)抑制。盡管肝臟各種細(xì)胞均可產(chǎn)生TNF，但普遍認(rèn)為內(nèi)毒素活化

10、枯否細(xì)胞是TNF產(chǎn)生的主要來源。研究表明，TNF在脂肪肝炎的發(fā)生、發(fā)展中起了重要作用，其不僅可通過活化受體，產(chǎn)生各種適應(yīng)性蛋白、促進(jìn)肝細(xì)胞的抗凋亡，也可引發(fā)肝細(xì)胞線粒體釋放出活性氧引起肝細(xì)胞死亡、凋亡和肝臟的炎病浸潤(rùn)。IL6是肝臟KCs產(chǎn)生的另一種重要促炎因子，可與TNF在協(xié)同促進(jìn)肝內(nèi)炎癥的產(chǎn)生。相反IL10可通過抑制各種促炎因子的生成，從而減少肝內(nèi)中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)。大蒜素是從大蒜中提取出的一種有效成分，其作用十分廣泛。有文獻(xiàn)報(bào)道其對(duì)CCl4及乙醇所致的急、慢性肝損傷有明顯的保護(hù)作用5，6。在我們以往的研究中也發(fā)現(xiàn)，其對(duì)高脂飲食所致肝臟慢性損傷也有較好的保護(hù)作用。為進(jìn)一步證實(shí)大蒜素是否可能通過

11、調(diào)節(jié)KCs分泌功能來改善肝組織慢性損傷，實(shí)驗(yàn)中以高脂飲食復(fù)制慢性肝損傷模型。檢測(cè)結(jié)果表明，模型組大鼠發(fā)生脂肪肝炎時(shí)，血漿促炎因子IL6、TNF明顯升高而抑炎因子IL10顯著降低，大蒜素可抑制IL6水平的升高。體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，大蒜素可降低KCs對(duì)IL6、TNF的表達(dá)，在提高IL10的表達(dá)方面作用十分顯著。說明大蒜素可通過調(diào)節(jié)KCs的分泌，改善肝臟內(nèi)促炎因子與抑炎因子的失衡，參與對(duì)肝臟慢性損傷的保護(hù)作用?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 Yelleymounter MA,Cullen MF,Baker MB,et al.Effects of the obese probuct on body we

12、ight regulation in obob mice J.Science，1995,269:540-543.2 Yang SQ,Lin HZ,Lane MD,et al.Obesity increase to endotoxin liver injury:implications for pathogenesisJ.Proc Ncad Acad Sic USA,1997,94:2557-2563.3 Lefkowitch JH，Haythe JH,Regent N.Kupffer cell aggregation and perivenlar distribution in steatohepatitisJ.Mod Pathol,2002,15:699-704.4 Faggioni R,Shigenaga J,Mosre A,et al.Iuduction of UCP2 gene expression by LPS:a potential mechanism for incre