細菌內(nèi)毒素檢查驗證方案

1、細菌內(nèi)毒素檢查驗證方案文件編號：VP-QC-2015-06起草人：審核人：批準人：批準日期：年月日目錄1概述12驗證目的及范圍13驗證小組人員組成及職責14驗證依據(jù)25驗證前準備26驗證的實施27偏差處理58驗證數(shù)據(jù)及評估59驗證報告及評審510再驗證及周期511驗證文件及歸檔512附件51概述細菌內(nèi)毒素檢查法系利用邕試劑來檢測或量化由格蘭陰性菌產(chǎn)生的細菌內(nèi)毒素，以判斷供試品中細菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法。細菌內(nèi)毒素檢查報告兩種發(fā)放，即凝膠法和光度測定法，后者包括濁度法和顯色基質(zhì)法，供試品檢測時，可使用其中任何一種方法進行實驗。公司自行制備的注射用水需進行細菌內(nèi)毒素的檢查，本方案將采

2、用凝膠法進行試驗。2驗證目的和方法本驗證方案適用于注射用水的細菌內(nèi)毒素的檢查，通過對邕試劑靈敏度復核試驗、干擾試驗及凝膠限度試驗，建立該產(chǎn)品的細菌內(nèi)毒素檢查方法，并對其有效性進行評價，確保檢測方法的專屬性、靈敏度，保證檢測結(jié)果可符合質(zhì)量標準要求。3.驗證小組人員組成及職責：3.1 驗證小組由以下部門人員組成：質(zhì)量部、QG生產(chǎn)部。3.2 驗證小組組成及職責列表組成職責QC1.1.1. .負責起草驗證方案的起草2.2.2. .負責本方案的培訓3.3.3. .儀器儀表校驗確認4.4.4. .負責驗證的實施5.5.5. .負責數(shù)據(jù)的收集和整理6.6.6. .負責數(shù)據(jù)分析7.7.7. .負責完成驗證報告

3、質(zhì)量部1.1.1.1. .負責驗證方案、驗證報告的審核與批準2.2.2.2. .負責驗證現(xiàn)場的監(jiān)督審查生產(chǎn)部6 .負責保障設備、器具的完好7 .負責動力系統(tǒng)的保障4驗證依據(jù)中華人民共和國藥典2015版1143細菌內(nèi)毒素檢查法5.驗證前準備5.1.0 驗證人員培訓：驗證報告起草人有責任在方案批準后（且在驗證實施前）對本次驗證相關人員進行培訓。培訓人員記錄見附件1。5.2.0 確認儀器儀表設施經(jīng)過確認和校驗，并填寫確認記錄。5.3相關文件，確認以下文件皆為現(xiàn)行有效版本廳P相關文件文件編號1DHG型電熱恒溫鼓風干燥箱操作規(guī)程WI-1002BSC-100-II-B2生物安全柜操作和維護保養(yǎng)規(guī)程WI-1

4、013WXQI-S-18SI自動手提式火菌器使用和維護保養(yǎng)規(guī)程WI-1034DK型電熱恒溫水浴鍋操作規(guī)程WI-1045HWS型恒溫恒濕箱操作規(guī)程WI-1056JA2003N電子天平操作及維護保養(yǎng)規(guī)程WI-1067PHS-3C型PH計操作及維護保養(yǎng)規(guī)程WI-1088SHP-3C型低溫生化培養(yǎng)箱操作及維護保養(yǎng)規(guī)程WI-1099YJ-875SDB型凈化操作臺的操作及維護保養(yǎng)規(guī)程WI-11310培養(yǎng)基管理規(guī)程WI-766驗證的實施實驗材料及用具子天平電熱干燥箱恒溫恒濕箱銀溫度計旋渦混合器邕試劑（具有國家主管部門的批準文號）細菌內(nèi)毒素工作標準品（由中國藥品生物制品檢定所統(tǒng)一發(fā)放的標準品）細菌內(nèi)毒素檢查用

5、水：應符合滅菌注射用水標準，其內(nèi)毒素含量小于0.015EU/ml,且對內(nèi)毒素試驗無干擾作用。實驗用具：移液管、凝集管、三角瓶、試管、試管架、洗耳球、時鐘、75%酒精棉、剪刀、砂輪。實驗準備玻璃器皿的洗滌將玻璃器皿放入銘酸洗液或其他熱原滅活劑或清洗液中充分浸泡，然后取出將洗液空干，用自來水將殘留洗液徹底洗凈，再用蒸儲水反復沖洗三遍以上，空干后放入適宜的密閉金屬容器中或用錫箔紙包好后再放入金屬容器內(nèi)，放置入烤箱。除去玻璃器皿表面可能存在的外源性內(nèi)毒素玻璃器皿置烤箱后，將烤箱調(diào)至250C,待烤箱溫度升至設定的溫度后開始計時，干烤至少1小時。達到規(guī)定時間后，關斷電源，待烤箱溫度自然降至室溫。在不打開金

6、屬容器的情況下，可在兩天內(nèi)使用；如果玻璃器皿用錫箔紙包裝，在不打開包裝的情況下可在兩周內(nèi)使用，否則須再次干烤除去可能存在的外源性內(nèi)毒素。邕試劑靈敏度復核試驗本試驗采用凝膠法，凝膠法系通過邕試劑與內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應的原理進行限度檢測的方法。細菌內(nèi)毒素標準溶液的制備取細菌內(nèi)毒素工作標準品一支，輕彈瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂輪在瓶頸上部輕輕劃痕，75%酒精棉球擦拭后啟開，啟開過程中應防止玻璃屑落入瓶內(nèi)。按照標準品說明書，加入規(guī)定量的細菌內(nèi)毒素檢查用水溶解其內(nèi)容物，用封口膜將瓶口封嚴，置旋渦混合器上混合15分鐘。然后進行稀釋，制備成4個濃度的細菌內(nèi)毒素標準溶液，即2入、入、0.5入、0.25人（入

7、為所復核的邕試對的標示靈敏度），每稀釋一步均應在旋渦混合器上混合30秒鐘。待復核邕試劑的準備取規(guī)格為0.1ml/支的邕試劑18支，輕彈瓶壁，使粉末落入瓶底，用砂輪在瓶頸輕輕劃痕，75%酒精棉球擦拭后啟開備用，防止玻璃屑落入瓶內(nèi)。每支加入0.1ml檢查用水溶解，輕輕轉(zhuǎn)動瓶壁，使內(nèi)容物充分溶解，避免產(chǎn)生氣泡。.加樣將已充分溶解的待復核邕試劑18支（管）放在試管架上，排成5列，其中4列4支（管），1列2支（管）。4支（管）4列每列每支分別加入0.1ml的2入、入、0.5入、和0.25人的內(nèi)毒素標準溶液；另2支（管）加入0.1ml檢查用水，作為陰性對照。加樣結(jié)束后，將邕試劑用封口膜封口，輕輕振動混勻，

8、避免產(chǎn)生氣泡，垂直放入試管架上，連同試管架放入37c±1。叵溫恒濕箱中，試管架保持水平狀態(tài)，保溫60±2分鐘。觀察并記錄結(jié)果。將試管架從恒溫包濕箱中輕輕取出，避免振動，將每管拿出緩緩倒轉(zhuǎn)180。觀察，管內(nèi)形成凝膠，并且凝膠不變形，不從管壁滑脫者為陽性，記錄為（十）;未形成凝膠或凝膠不能保持完整并從管壁滑脫者為陰性，記錄為（-）。保溫和拿取試管過程應避免受到振動，造成假陰性結(jié)果。實驗結(jié)果計算如最大濃度2入4管均為陽性，最低濃度0.25入4管均為陰性，陰性對照為陰性時實驗為有效，按下式計算反應終點濃度的幾何平均值即為邕試劑靈敏度的復核結(jié)果（入c）入c=lg-1（EX/4）式中x

9、為反應終點濃度的對數(shù)值（lg）。反應終點濃度是系列遞減的內(nèi)毒素標準溶液中最后一個呈陽性結(jié)果的濃度。結(jié)果判斷判斷標準當入C在0.5入2入（包括0.5人和2入）時判定該批邕試劑靈敏度復核合格，可用于干擾實驗和供試品細菌內(nèi)毒素檢查，并以入（標示靈敏度）為該批邕試劑的靈敏度。6.3.7.2判斷結(jié)果：（記錄附后）干擾實驗目的是檢驗本公司自制的注射用水對于邕試劑與內(nèi)毒素的反應有無干擾作用。使用的供試品溶液應為未檢驗出內(nèi)毒素且不超過所使用的邕試劑的最大有效稀釋倍數(shù)的溶液。確定最大有效稀釋倍數(shù)（MVD注射用水的內(nèi)毒素限值L為0.25EU/ml,邕試劑的標示靈敏度為0.25EU/ml,則最大有效稀釋倍數(shù)MV囪注

10、射用水本身濃度。公司如下：MVD=cL/入式中：L為供試品的細菌內(nèi)毒素限值c為供試品溶液濃度入為邕試劑靈敏度的標示值。制備內(nèi)毒素標準對照溶液取1支細菌內(nèi)毒素標準品，用細菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋成4個濃度的標準溶液即2人、入、0.5入、0.25入（方法同6.3.1）。制備含內(nèi)毒素的供試品溶液再注射用水將6.4.3.中的同支細菌內(nèi)毒素標準品稀釋成4個濃度即2入、入、0.5人、0.25人的含內(nèi)毒素的供試品溶液。邕試劑的準備取規(guī)格為0.1ml/支的邕試劑28支，輕彈壁使粉末落入瓶底，用砂輪在瓶頸輕輕劃痕，75%酒精棉球擦拭后啟開備用，防止玻璃屑落入瓶內(nèi)。每支加入0.1ml檢查用水溶解，輕輕轉(zhuǎn)動瓶壁，使內(nèi)容

11、物充分溶解，避免產(chǎn)生氣泡。加樣：按下列表1方法進行加樣1）將準備好的邕試劑取其中18支（管）放在試管架上，排成5列，4列4支（管），1列2支（管）。其中的4支4列每列每支分別加入0.1ml的2.0入、1.0入、0.5人、0.25人的含內(nèi)毒素的供試品溶液，另一列2支（管）加入0.1ml供試品溶液作為陰性對照。2）將另外10支（管）邕試劑放在試管架上，排成5歹I，每歹42支（管）。其中的4列每列每支分別加入0.1ml的含2.0入、1.0入、0.5入、0.25人的內(nèi)毒素的標準內(nèi)毒素溶液，另一列2支（管）加入0.1ml檢查用水作為樣品陰性對照。加樣結(jié)束后，用封口膜封口，輕輕振動混勻，避免產(chǎn)生氣泡，連同

12、試管架放入37±1C恒溫恒濕箱中，保溫60±2分鐘后，觀察并記錄結(jié)果。表1凝膠法干擾試驗溶液的準備編R內(nèi)毒素濃度/被加入內(nèi)毒素的溶液稀釋用液稀釋倍數(shù)所含內(nèi)毒素的濃度平行管數(shù)A無/供試品溶液2B2供試品溶液供試液溶液12人421人440.5九480.25九4C2檢查用水檢查用水12人22僅240.5九280.25九2D無/檢查用水2注：A為供試品溶液；B為干擾試馬系列；C為邕試劑標示靈敏度的對照系列；D為陰性對照。實驗結(jié)果計算只有當溶液用口陰性對照溶液D的所有平行管都為陰性，并且系列溶液C的結(jié)果符合邕試劑里面的復核試液要求時，試驗方為有效。當系列溶液B的結(jié)果符合邕試劑里面的復

13、核試驗要求室，認為該供試品溶液物干擾作用。其他情況則認為供試品溶液存在干擾作用。按下式計算用檢查用水制成的內(nèi)毒素標準溶液的反應終點濃度的幾何平均值(Es)和用供試品溶液制成的內(nèi)毒素溶液的反應終點濃度的幾何平均值(Et).Es=lg-1(EXs/4)E=lg-1(EXt/4)X、X分別為用檢查用水和供試品溶液或稀釋液制成的內(nèi)毒素溶液的反應終點濃度的對數(shù)值(lg)。結(jié)果判斷判斷標準當Es在0.5入2.0入(包括0.5人和2.0入)時，且E在0.5Es2.0E(包括0.5Es和2.0Es)時，則認為該供試品溶液不干擾實驗，可對此供試品進行細菌內(nèi)毒素檢查。當E不在0.5Es2.0B(包括0.5Es和2

14、.0鼻)時，則認為該供試品溶液干擾實驗。6.4.8.2判斷結(jié)果：(記錄附后)6.5供試品的凝膠限度試驗檢查在細菌內(nèi)毒素檢查中，每批供試品必須做2支供試品管和2支供試品陽性對照,同時每次實驗必須做2支陽性對照和2支陰性對照。凝膠限度溶液的制備：按表2進行各試驗溶液的制備表1凝膠限度試驗溶液的制備編R內(nèi)毒素濃度/被加入內(nèi)毒素的溶液平行管數(shù)A無/供試品溶液2B2V供試品溶液2C2檢查用水2D無/檢查用水2注：A為供試品溶液；B為供試品陽性對照；C為陽性對照；D為陰性對照。供試品溶液的制備：取公司自制的注射用水，不需進行稀釋處理。陽性對照溶液的制備用檢查用水將內(nèi)毒素標準品稀釋制成2人濃度的內(nèi)毒素標準溶

15、液（方法同6.3.1）。供試品陽性對照溶液的制備用待檢測的供試品溶液將內(nèi)毒素標準品制成2人濃度的內(nèi)毒素溶液。（方法同6.4.4制備含內(nèi)毒素的供試品溶液）。陰性對照液用細菌內(nèi)毒素檢查用水邕試劑的準備取規(guī)格為0.1ml/支的邕試劑8支，輕彈瓶壁使粉末落入瓶底，用砂輪在瓶頸輕輕劃痕，75%酒精棉球擦拭后啟開備用，防止玻璃屑落入瓶內(nèi)。每支加入0.1ml檢查用水溶解，輕輕轉(zhuǎn)動瓶壁，使內(nèi)容物充分溶解，避免產(chǎn)生氣泡。加樣取8支（管）溶解好的邕試劑，其中2支（A）加入0.1ml供試品溶液作為供試品管，2支（B）加入0.1ml供試品陽性對照溶液作為供試品陽性對照管，2支（C）加入0.1ml陽性對照溶液作為陽性對

16、照管，2支（D）加入0.1ml檢查用水作為陰性對照管。將試管中溶液輕輕混勻后，用封口膜封閉管口，垂直放入37c±1。叵溫恒濕箱中，保溫60±2分鐘。保溫和取放試管過程應避免受到振動造成假陰性結(jié)果。結(jié)果判斷判斷標準若陰性對照溶液D的平行管均為陰性，供試品陽性對照溶液B的平行管均為陽性，陽性對照溶液C的平行管均為陽性，試驗有效。若溶液A的兩個平行管均為陰性，判定供試品符合規(guī)定。若溶液A的兩個平行管均為陽性，判定供試品不符合規(guī)定。若溶液A的兩個平行管中的一管為陽性，一管為陰性，需進行復試。復試時溶液A需做4支平行管，若所有平行管均為陰性，判定供試品符合規(guī)定，否判定供試品不符合規(guī)定

17、。判斷結(jié)果：（記錄附后）7.偏差處理驗證的數(shù)據(jù)產(chǎn)生的任何偏差，應及時進行偏差調(diào)查，按照化驗室偏差管理規(guī)程進行處理并如實記錄，給出合理的偏差處理措施，并上報驗證領導小組，記錄備案,并且根據(jù)處理措施進行相應的處理，并對處理的過程、結(jié)果進行記錄與跟蹤,驗證小組根據(jù)數(shù)據(jù)分析，做出相應的評定與結(jié)論，報請驗證委員會批準8驗證數(shù)據(jù)及評估驗證小組對驗證檢測數(shù)據(jù)進行評估，并對結(jié)果進行評價結(jié)果評價：評價人：日期：.驗證報告及評審驗證小組依據(jù)本方案實施驗證，編寫驗證報告。驗證小組組織專業(yè)人員對驗證報告進行評審。QA對驗證報告給出結(jié)論，驗證合格發(fā)放驗證合格證。.再驗證及周期當使用新批號的邕試劑或試驗條件發(fā)生了任何可能

18、影響檢驗結(jié)果的改變時，應進行邕試劑靈敏度的復合試驗。當邕試劑、注射用水生產(chǎn)工藝改變或試驗回家發(fā)生了任何有可能影響試驗結(jié)果的變化時，需重新進行干擾試驗。.驗證文件歸檔驗證結(jié)束，全部驗證文件（驗證方案、驗證報告、驗證記錄、驗證合格證等）歸檔質(zhì)量部。.附件驗證小組組成及職責驗證前確認記錄驗證結(jié)果評估記錄驗證合格證驗證前確認記錄、驗證前儀器儀表確認廳P名稱編號上次校驗時間是否在有效期內(nèi)12345確認人：日期：附：表1賞試劑靈敏度復核記錄檢驗目的檢驗日期檢驗依據(jù)室溫試劑名稱生產(chǎn)單位批號靈敏度/效價規(guī)格賞試劑EU/ml細菌內(nèi)毒素標準品EU/支細菌內(nèi)毒素檢查用水實驗操作標準品稀釋：儀器名稱保溫時間()保溫溫

19、度結(jié)果記錄：.濃度平行樣2人1人0.5九0.25九陰性對照123/4/結(jié)算過程：十一賞試劑標系列遞減呈陽性平仃樣示靈敏度兒的最低稀釋倍數(shù)反應終點濃度（系列遞減的反應終點濃度的對數(shù)最舟-個陽性濃度）值1234賞試劑靈敏度標小值1=0.25測試值Xc=lg-1(EX/4)EXEX/4入c=lg-1(EX/4)賞試劑靈敏度標示值A允許范圍0.5人2九靈敏度，一是否符合要求檢驗員復核人表2干擾試驗記錄檢品名稱檢驗日期生產(chǎn)單位室溫供樣單位規(guī)格批號包裝檢驗依據(jù)內(nèi)毒素限度試劑名稱生產(chǎn)單位批號靈敏度/效價規(guī)格賞試劑EU/ml細菌內(nèi)毒素標準品EU/支細菌內(nèi)毒素檢查用水實驗操作.標準品稀釋：.供試品制備：3,含供試品內(nèi)毒素溶液的制備：儀器名稱保溫時間()保溫溫度結(jié)果記錄：賞試劑28支平行管內(nèi)毒素濃度2九1人0.5九0.25九陰性對照A:供試品溶液A1/A2/B:2”供試品溶液B1/B2/B3/B4/C:2檢查用水C1/C2/D:檢查用水D1/D2/系列溶液C賞試劑靈敏度對照系列：計算Es平行樣賞試劑標小火敏度兒系列遞減呈陽性的最低稀釋倍數(shù)反應終點濃度(系列遞減的最舟-個陽性濃度)反應終點濃度的對數(shù)值1234賞試劑靈敏度標本值=0.25日系列溶液C的反應終