大腸桿菌PCR檢測方法

1、ICS11.220B41DB21遼寧省地方標(biāo)準(zhǔn)DB 21/ XXXXXXXXX大腸桿菌PCR檢測方法Method of PCR for the detection of Escherichia coli點(diǎn)擊此處添加與國際標(biāo)準(zhǔn)一致性程度的標(biāo)識XXXX - XX - XX發(fā)布XXXX - XX - XX實(shí)施遼寧省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布前言 本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T 1.12009給出的規(guī)則起草。 本標(biāo)準(zhǔn)由遼寧省動物疫病預(yù)防控制中心提出。 本標(biāo)準(zhǔn)由遼寧省畜牧獸醫(yī)局歸口。 本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：遼寧省動物疫病預(yù)防控制中心、遼寧省動物醫(yī)學(xué)研究院。 本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：趙鳳菊，關(guān)淼，關(guān)乃鵬，李清竹，陳瑤大腸桿菌PCR檢測方

2、法1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了大腸桿菌PCR檢測方法的技術(shù)要求。 本標(biāo)準(zhǔn)適用于大腸桿菌的診斷、監(jiān)測及流行病學(xué)調(diào)查，適用于豬糞便、臟器及純培養(yǎng)物中大腸桿菌的檢測。本標(biāo)準(zhǔn)中的試驗(yàn)操作應(yīng)在生物安全級（BSL-2）以上的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。2 規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第302號 獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室生物安全技術(shù)管理規(guī)范3 縮略語下列縮略語適用于本標(biāo)準(zhǔn)。E.coli：大腸桿菌（Escherichia coli）DNA：脫氧核糖核酸（Diethylpyrocar

3、bonate）bp：堿基對（base pair）PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction）dNTP：脫氧核糖核苷三磷酸（Deoxy-ribonucleoside triphosphate）Taq酶：Ex Taq DNA聚合酶（Taq DNA polymerase）TAE：三羥甲基氨基甲烷-乙酸電泳緩沖液（Tris acetate-EDTA buffer）4 原理 根據(jù)E.coli保守基因序列設(shè)計一對引物，在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以引物為延伸起點(diǎn)，通過變性、退火和延伸，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA。5 儀器和器材 本技術(shù)規(guī)范中需應(yīng)

4、用下列儀器和器材：高速臺式冷凍離心機(jī)（最大離心力12 000g以上）、冰箱、PCR擴(kuò)增儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、微波爐、分析天平、1.5mL離心管和0.2mL離心管、微量移液器和吸頭等。6 試劑和材料6.1 DNAzol® Reagent：DNA抽提試劑，外觀為淡綠色，于48保存。6.2 無水乙醇：-20預(yù)冷。6.3 75%乙醇：用無水乙醇和滅菌雙蒸水配制，-20預(yù)冷。6.4 DNA聚合酶：Ex Taq DNA聚合酶（5 U/L）。6.5 dNTP(2.5 mmol/L)。6.6 引物：引物濃度為20mol/L；上游引物序列為5- GCCTCGCCTGGAGAATGA-3， 下游引物

5、序列為5-CCTGAGACTGCGGTGGAA-3。6.7 陰性對照：滅菌雙蒸水6.8 陽性對照：E.coli ATCC25922。6.9 無菌生理鹽水。6.10 TAE：Tris-乙酸電泳緩沖液，6.11 溴化乙錠。6.12 DL2000 DNA Marker。注：本技術(shù)規(guī)范中使用的試劑，除另有說明外，所用試劑均為分析純；所有試劑均用無菌的容器分裝。7 操作步驟7.1 樣品的采集、前處理、存放與運(yùn)輸7.1.1 采樣注意事項(xiàng) 采樣及樣品前處理過程中應(yīng)戴一次性手套，樣本間不得交叉污染。7.1.2 采樣工具藥匙、15 mL離心管和1.5 mL離心管經(jīng)121（士2）均高壓滅菌20 min；剪刀、鑷子

6、經(jīng)160 干熱滅菌2 h。7.1.3 內(nèi)臟樣品的采集與前處理采取病死或剖殺豬主要臟器（肝臟、脾臟、肺臟）裝入滅菌15mL離心管中，編號，送實(shí)驗(yàn)室。稱取1 g 病料進(jìn)行研磨，然后加入1mL無菌生理鹽水，混勻，3000 rpm離心20 min，取上清液轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中編號備用。7.1.4 內(nèi)容物的采集與前處理采取病死或剖殺豬的小腸內(nèi)容物，裝入15 mL滅菌離心管中，按1：5倍體積加入無菌生理鹽水，混勻，3000 rpm離心20min，取上清液轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中編號備用。7.1.5 糞便的采集與前處理用藥匙無菌采取發(fā)病豬新鮮糞便，裝入15 mL滅菌離心管中，按1：5倍體積加入無菌生理鹽

7、水，混勻，3000 rpm離心20 min，取上清液轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中編號備用。7.1.6 血液無菌采集心血，按1：1倍體積加入無菌生理鹽水，混勻，轉(zhuǎn)入1.5 mL滅菌離心管中編號備用。7.1.7 大腸桿菌純培養(yǎng)物挑取37 1824h培養(yǎng)的典型菌落，用1mL無菌生理鹽水制備成一定濃度的菌懸液。然后轉(zhuǎn)入1.5 mL滅菌離心管中編號備用，待檢。7.1.8 保存與運(yùn)輸 采集或處理的樣品在28條件下保存應(yīng)不超過24 h；若需長期保存，應(yīng)放置-70冰箱，但應(yīng)避免反復(fù)凍融(凍融不超過3次)。采集的樣品密封后，采用保溫壺或保溫桶加冰密封，在68 h之內(nèi)運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室。按照獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室生物安全技術(shù)管理規(guī)范進(jìn)

8、行樣品的生物安全標(biāo)識。7.2 PCR檢測7.2.1 DNA提取7.2.1.1 取n個滅菌的1.5 mL離心管，其中n為待檢樣品數(shù)+陽性對照管數(shù)+陰性對照管數(shù)，對每個離心管進(jìn)行編號。7.2.1.2 每管加入800L DNAzol，分別加入被檢樣品、陽性對照和陰性對照各200 L，顛倒混勻后，4 12000 g離心10 min。7.2.1.3 取與7.2.1.1中相同數(shù)量滅菌的1.5 mL離心管，吸取900 L上清液轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的管中，加入500L無水乙醇混勻后。7.2.1.4 4 12000 g離心5min，棄上清，倒置于吸水紙上，沾干液體，加入1mL 75%乙醇，洗滌。7.2.1.5 4 120

9、00 g離心5 min，棄上清，倒置于吸水紙上，沾干液體。如此洗2次。7.2.1.6 4000 g離心10 s，用微量加樣器小心將殘余液體吸干，室溫干燥310 min。7.2.1.7 加入20 L經(jīng)高壓處理的水，輕柔混勻，溶解管壁上的DNA，冰上保存?zhèn)溆?；若需長期保存應(yīng)放置-70 冰箱。7.2.2 PCR7.2.2.1 PCR反應(yīng)體系建立25L反應(yīng)體系，按下列組分加入PCR專用離心管中： 滅菌蒸餾水 17.375L 10×PCR Buffer 2.5L 2.5mM dNTP 2L Ex Taq DNA聚合酶 0.125L 上游特異性PCR引物 0.5L 下游特異性PCR引物 0.5L

10、 DNA 2L7.2.2.2 PCR反應(yīng)條件94 預(yù)變性5 min；94 變性45 s，56 退火45 s，72 延伸50 s，35個循環(huán)；72 終延伸10 min7.2.2.3 電泳將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物6L與1L上樣緩沖液混合，點(diǎn)樣于1 %瓊脂糖凝膠（含0.5g/mL溴化乙錠）孔中，瓊脂糖凝膠板一側(cè)點(diǎn)樣孔加入DL2000 DNA Marker（分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物），緩沖液為1×TAE，以5 V/cm電壓電泳25min。8 結(jié)果判定紫外凝膠成像儀下觀察結(jié)果，當(dāng)陽性對照出現(xiàn)在272 bp擴(kuò)增條帶，陰性對照未出現(xiàn)目的條帶時，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可作為判定依據(jù)。被檢樣品出現(xiàn)272 bp擴(kuò)增條帶為E.coli 核酸陽性，未出現(xiàn)272bp擴(kuò)增條帶的樣品判為E.coli 核酸陰性。AA附錄A （規(guī)范性附錄）試劑配制A.1 電泳緩沖液（50倍）A.1.1 0.5mol/L乙二銨四乙酸二鈉（EDTA）溶液（pH8.0） 二水乙二銨四乙酸二鈉（分析純） 18.61 g 滅菌雙蒸水 80 mL 氫氧化鈉 調(diào)pH至8.0 滅菌雙蒸水 加至100 mLA.1.2 TAE(三羥甲基氨基甲烷一乙酸)電泳緩沖液(50倍) 羥基甲基氨基甲烷(Tri