腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基本方法

1、腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基本方法腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基本方法（一）準(zhǔn)備和安裝過濾器清洗好過濾器，干燥，放入一張孔徑0.22pm的微孔濾膜，用布包裝好，15磅20min進(jìn)行高壓滅菌處理。在超凈臺(tái)內(nèi)打開過濾器架好，膠管一端接入濾泵再插入待除菌的液體中，出口端膠管深入到已消毒好的瓶子中。用泵過濾，過濾后要檢查濾膜是否完好無(wú)損。（二）合成培養(yǎng)基的配制1、根據(jù)細(xì)胞目錄中的說(shuō)明，按下表選擇合適品牌及貨號(hào)的培養(yǎng)基干粉，用適量超純水充分溶解。/口加小品牌貨號(hào)D-MEM/F-12GIBCO12400024DulbeccosModifiedEagleMedium(D-MEM),powder(highGIBCO12800017gluc

2、ose)F-12NutrientMixture(Ham)powderGIBCO21700075IscovesModifiedDulbeccosMedium(IMDM)powderGIBCO12200036LeibovitzsL-15MediumpowderGIBCO41300039McCOYs5ASIGMAM4892MinimumEssentialMedium(MEM)AlphaMediumpowderGIBCO11900024(MEM”)withribonucleosidesanddeoxyribonucleosidesMinimumEssentialMedium(MEM)AlphaMedi

3、umpowderGIBCO12000022(MEMa)withoutribonucleosidesanddeoxyribonucleosidesMinimumEssentialMedium(MEM)powderGIBCO41500034NUTRIENTMIXTUREF12HAMKAIGHNSSIGMAN3520MODIFICATION(F12K)RPMIMedium1640GIBCO31800022EGFSIGMAE9644SodiumpyruvateSIGMAP2256-25GMEDIUM199,WITHEARLESSALTSANDSIGMAM5017L-GLUTAMINE,WITHOUTS

4、ODIUMBICARBONATE.CELLCULTURETESTED2、按要求添加碳酸氫鈉、谷氨酸鈉、HEPES等，充分?jǐn)嚢枋怪芙狻?、調(diào)pH至7.2左右。4、加水至最終體積。5、在超凈臺(tái)中對(duì)溶液進(jìn)行濾過除菌，分裝入250mL或500mL玻璃瓶中，用翻帽塞塞緊瓶口。6、瓶口封好，4c冰箱貯存。（三）小牛血清的處理市場(chǎng)上出售的小牛血清一般做了滅菌處理，但在使用前還應(yīng)做熱滅活處理，即通過加熱的方法破壞補(bǔ)體（近來(lái)也有觀點(diǎn)認(rèn)為熱滅活處理是不必要的）。胎牛血清不必滅活。1、將血清加熱至56c并保持30min,其間要不時(shí)輕輕晃動(dòng)，使受熱均勻，防止沉淀析出。2、處理后的血清貯存于4C。3、小牛血清在使用前

5、最好進(jìn)行篩選以掌握血清的質(zhì)量。（四）生長(zhǎng)培養(yǎng)基的配制除無(wú)血清培養(yǎng)之外，各種合成培養(yǎng)基在使用前需加入一定量的小牛血清或胎牛血清和抗菌素。1、培養(yǎng)基分裝成小瓶（100200mL）以便使用，翻帽塞塞緊瓶口。2、按如下比例配制：基本培養(yǎng)基占80%90%,小牛血清或胎牛血清占10%20%。按1%體積分?jǐn)?shù)加入雙抗貯存液（青霉素+鏈霉素），使青霉素和鏈霉素的終濃度分別為100U/mL和100/mL。（五）凍存細(xì)胞的復(fù)蘇1、應(yīng)遵守慢凍快融的原則。先將水浴鍋調(diào)至37-37。5度，取出凍存的細(xì)胞迅速放入后將細(xì)胞面浸至水面以下不斷搖動(dòng)至融化。2、在無(wú)菌臺(tái)內(nèi)將完全培養(yǎng)基加入50ml的小培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，約5ml左右，然后用無(wú)

6、菌吸管從凍存管內(nèi)取出細(xì)胞，置培養(yǎng)并內(nèi)輕輕搖晃，使細(xì)胞均勻后置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。（六）傳代：1、貼壁細(xì)胞：對(duì)于貼壁細(xì)胞應(yīng)先吸（倒）盡培養(yǎng)基，吸的越干凈越好，以免中和后加入的消化液，使強(qiáng)度減弱（或PBS洗13次）。50ml培養(yǎng)瓶加入消化液約1-3ml,按此比例進(jìn)行消化，（根據(jù)經(jīng)驗(yàn)），晃動(dòng)使消化液鋪均勻置37度培養(yǎng)箱約2-5分鐘，鏡下見細(xì)胞收縮變圓或少數(shù)脫落后，輕輕振動(dòng)瓶底使細(xì)胞全部脫落，加入2-3ml完全培養(yǎng)基后，輕輕吹打，使細(xì)胞基本成單個(gè)懸浮，然后分置其它無(wú)菌培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，加入完全培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)。2、懸浮細(xì)胞：一般傳代可直接將細(xì)胞原液分置其它培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，如要高濃度可先離心1

7、000rpm,5min后加入完全培養(yǎng)基，輕輕吹勻后，分置其它培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。（七）凍存將貼壁細(xì)胞消化后離心收集，懸浮細(xì)胞直接離心收集，以完全培養(yǎng)基或胎牛血清重懸細(xì)胞至終濃度約106/ml。加入10%的DMSO。以每管12ml分裝至凍存管中。用絕熱材料包裹置-70攝氏度冰箱冷凍過夜。次日保存到液氮中。（八）注意事項(xiàng)1、玻璃吸管和玻璃培養(yǎng)瓶的消毒：1）高壓蒸汽滅菌15分鐘以上;2）干烤消毒140度2小時(shí)以上；2、無(wú)菌工作臺(tái)先清洗后用75%酒精擦拭干凈，紫外線照射40分鐘以上;各種培養(yǎng)板照射3小時(shí)以上；3、培養(yǎng)基（pH7.2）和血清配制好后要做無(wú)菌試驗(yàn)：將血清按10%加入培養(yǎng)基內(nèi)，用無(wú)菌的玻璃離心管或玻璃瓶取完全培養(yǎng)基5-10ml置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2-3天，肉眼見無(wú)渾濁或沉淀等異物。分裝后置4度保存；4、消化液（pH7.8）或其它加入液，應(yīng)用高壓蒸汽滅菌或一次性無(wú)菌濾器過濾除菌，分裝成支置-20度保存；5、培養(yǎng)箱應(yīng)先用清水清洗后用75%酒精擦拭一遍（如有紫外線的應(yīng)照射1小時(shí)以上，如有高溫滅菌的應(yīng)按程序來(lái)菌）。至少每月一次。6、進(jìn)入操作時(shí)應(yīng)注意先清洗雙手及手腕，然后用75%酒精擦拭，操作時(shí)注意無(wú)菌臺(tái)內(nèi)空間層次。