2022年細菌脂多糖免疫對結腸炎小鼠TNF-α-表達的影響-(2)匯總

1、細菌脂多糖免疫對結腸炎小鼠TNF-表達的影響摘要目的：為了研究細菌脂多糖免疫對結腸炎小鼠TNF-表達的影響并探討炎癥性腸炎的發(fā)生機制。方法：設計動物模型實驗，將30只BALB/C小鼠隨機分為三組：觀察組10只注射細菌脂多糖免疫后誘導小鼠潰瘍性結腸炎模型、模型組10只注射生理鹽水后誘導小鼠潰瘍性結腸炎模型和對照組10只不做任何處理并注射生理鹽水，4周后處死并取結腸組織標本檢測，統(tǒng)計炎癥介質(zhì)TNF-的表達情況并進展比擬。結果：觀察組血清TNF-mRNA含量均值為16.36±1.28%，結腸TNF-含量均值為23.25±2.15%，數(shù)據(jù)結果與其他兩組差異具有統(tǒng)計學意義P<0

2、.05。病理切片觀察結果：觀察組小鼠的潰瘍點、靡爛點個數(shù)均較模型組明顯減少，同時炎癥細胞浸潤和杯狀細胞減少程度也明顯較輕。結論：細菌脂多糖可降低小鼠結腸粘膜TNF-及血清TNF-的含量，在病理切片結果中可明顯觀察到經(jīng)過LPS免疫小鼠的病理狀態(tài)明顯減輕，這可能為其對潰瘍性結腸炎的治療提供理論依據(jù)。關鍵詞細菌脂多糖；潰瘍性結腸炎；腫瘤壞死因子Effect of LSP on the expression of TNF- immunity in mice with colitisAbstract Objective: To study the influence of LSP on the expr

3、ession of TNF- immunological colitis in mice and to explore the mechanisms of IBD. Methods: the experiment animal model design, 30 male BALB/C mice were randomly divided into three groups: the observation group 10 (IBD models were induced by injection of LSP after immunization), 10 rats in model gro

4、up (IBD mice models were induced by injection of saline) and 10 in control group (without any treatment and injection of physiological saline), 4 weeks after the colon tissue samples were taken for detection, and compared the expression of inflammatory mediators in TNF- statistics. Results: in the o

5、bservation group, serum TNF- mRNA content was (16.36 ± 1.28)%, the mean content of TNF- colon was (23.25 ± 2.15)%, with statistical significance of data and other differences between the two groups (P<0.05). Pathological observation: the number of the observation group mice ulcer, corru

6、pt are compared with model group were significantly reduced, and the infiltration of inflammatory cells and goblet cells decreased significantly lighter.Conclusion: LSP can reduce the content of the colon mucosa of TNF- and serum TNF- , in pathological results can be clearly observed the pathologica

7、l state of mice immunized with LPS significantly reduced, which may provide a theoretical basis for the treatment of ulcerative colitiKeywordsLSP; IBD; tumor necrosis factor炎癥性腸病inflammatory bowel disease,IBD是一類由多種不明病因引起的、異常免疫介導的腸道慢性及復發(fā)性炎癥，有終身復發(fā)傾向，主要疾病類型有潰瘍性結腸炎ulcerative colitis,UC和克羅恩病Crohn disease

8、,CD。目前病因不明確，有學者認為環(huán)境、遺傳、微生物感染和腸壁黏膜免疫異常，腸道黏膜損失等因素共同作用于IBD的發(fā)作1。以ELISA法檢測IBD及其他胃腸道疾病患者抗結腸抗體時發(fā)現(xiàn)，潰瘍性結腸炎患者抗結腸抗體出現(xiàn)率為36%，明顯高于其他胃腸道疾病患者2 。細菌脂多糖LPS是革蘭陰性菌的內(nèi)毒素，在感染/炎癥的發(fā)病機制中起著十分重要的作用。Toll蛋白家族在構造上有高度同源性,且均在天然免疫防御中起重要作用。目前有報道的TLR已達10種，其中TLR4多分布在巨噬細胞，B/T淋巴細胞及脾，肝，肺及胎盤等組織中，主要識別革蘭氏陰性細菌外表的脂多糖LPS，引起核轉錄因子NF-B的活化及炎癥因子的釋放3。

9、因此,筆者設計動物實驗來研究實驗性潰瘍性結腸炎小鼠的血清和腸道的TNF-表達情況，據(jù)此探討炎癥性腸病的發(fā)生機制，為炎癥性腸病的預防與治療提供理論依據(jù)。1資料與方法1.1實驗資料 30只BALB/C雄性小鼠SPF級均由大連醫(yī)科大學動物實驗中心提供，體質(zhì)量范圍為22g-24g，平均為23.2±1.1g，均為7-8周齡，分組方法：30只小鼠按照隨機數(shù)字表分為觀察組、模型組和對照組三組，每組10只，觀察組和模型組均首先通過三硝基苯磺酸(TNBS)乙醇溶液灌腸誘導小鼠潰瘍性結腸炎模型，觀察組小鼠造模后注射細菌脂多糖免疫，模型組給予同等劑量的生理鹽水，對照組小鼠不造模，正常飼養(yǎng)，與觀察組和模型組

10、小鼠同期給予等劑量的生理鹽水。所有小鼠的在飼養(yǎng)過程中的環(huán)境條件符合中國國家標準?實驗動物環(huán)境及設施?GB14925-2001對屏障動物實驗設施的有關標準，對小鼠的飼養(yǎng)管理和實驗操作符合?北京市實驗動物管理條例?等法規(guī)的要求。1.2給藥方法：觀察組小鼠使用細菌脂多糖進展免疫，具體方法為給予(LPS 1mg+NS 15 ml)+佐劑15ml,配制成終濃度0.03mg/ml(0.003mg/0.1ml)的試劑，用量為0.3mg/1000g,0.003mg/0.1ml/10g，小鼠腹腔注射3ml+佐劑3ml，模型組小鼠與對照組小鼠分別給予適量的生理鹽水+15 ml 完全弗氏佐劑,每次接種0.3mg/1

11、000g，所有30只實驗小鼠均每1周免疫1次，共4次，初次免疫加完全弗氏佐劑，以后免疫用不完全弗氏佐劑。1.3造模方法4 觀察組與模型組的實驗小鼠均在末次免疫3周后禁食24小時，用5%水合氯醛0.15mL或3%戊巴比妥腹腔注射，使小鼠輕度麻醉，約25min以后用套接了涂有石蠟油的小號導尿管直徑1.5mm硅膠管的1mL注射器抽吸TNBS乙醇溶液，從肛門將導尿管緩慢插入約3.5cm3-4cm，然后將藥液緩慢注入，停20s后抽出導尿管，再將小鼠倒懸約30s后放入盒中，自然清醒。1.4標本采集 三組小鼠在同一時間范圍內(nèi)收集血清并制作標本，標本收集方法為：抓取小鼠，用鑷子夾出眼球，放血至EP管，室溫放置

12、約1小時，3500rpm離心15分鐘，收集血清至EP管，-200保存。標本制作方法為：處死小鼠，腹部消毒，無菌剖開腹部，別離結腸，留取距肛門4cm左右的結腸組織，沿腸系膜緣剪開腸腔，PBS沖洗糞便，H-E染色，其余標本錫箔包裹，液氮冷凍，-80保存，觀察測量結腸的長度，拍照。1.5 小鼠結腸組織病理學觀察 無菌條件下摘取小鼠結腸，應用10福爾馬林固定24 h，脫水處理后石蠟包埋，每隔4 um連續(xù)切片，HE染色，光鏡下觀察小鼠結腸病理學特征。1.6 ELISA法檢測TNF-在血清和結腸組織的表達：取血清及結腸組織樣本嚴格按照小鼠放射免疫試劑盒說明書要求檢測細胞因子TNF-及結腸組織的表達情況。1

13、.7DAI評分標準 對各組小鼠按照以下表格進展DAI潰瘍性結腸炎疾病活動指數(shù)評估5。表1：DAI分值=糞便粘稠度+體質(zhì)量減輕率+血便/31.7統(tǒng)計學處理 選擇spss19.0統(tǒng)計學軟件包進展分析，三組獨立樣本計量資料平均值數(shù)據(jù)以均值加減標準差表示：組間比擬方法選擇單因素方差分析one-way ANOVA，兩兩比擬方法選擇LSD檢驗，獨立樣本計量資料組間比擬方法選擇t檢驗，均以0.05為差異具有統(tǒng)計學意義的標準，行雙邊檢驗。2結果2.1病理形態(tài)學的表現(xiàn)：在光鏡下觀察，對照組小鼠的結腸黏膜上皮完整、連續(xù)，腺體排列規(guī)那么、構造清楚，無潰瘍、無靡爛點及淋巴細胞浸潤見圖1。模型組小鼠結腸黏膜可見多個潰瘍

14、出現(xiàn)，靡爛點散在分布，黏膜淋B細胞浸渭嚴重t杯狀細胞硪少明顯見圖2。觀察組小鼠在潰瘍點、靡爛點個數(shù)均較模型組明顯減少，同時炎癥細胞浸潤和杯狀細胞減少程度也明顯較輕見圖3。圖1：對照組小鼠病理典型代表圖例圖2：模型組小鼠病理典型代表圖例圖3：觀察組小鼠病理典型代表圖例2.2 細菌脂多糖對潰瘍性結腸炎血清TNF-及結腸TNF-含量的影響 觀察組血清TNF-mRNA含量均值為16.36±1.28%，結腸TNF-含量均值為23.25±2.15%，F(xiàn)檢驗結果顯示與其他兩組實驗小鼠數(shù)據(jù)不一致P<0.05，拒絕H0假設，承受H1假設，LSD兩兩比擬結果顯示：觀察組實驗數(shù)據(jù)明顯高于對

15、照組t=18.90，P<0.05，但明顯低于模型組t=8.94，P<0.05,數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計學意義，具體數(shù)據(jù)結果如下表2：表2：三組小鼠實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計結果表組別N只免疫劑量血清TNF-mRNA含量(%)結腸TNF-含量(%)觀察組103ml+佐劑3ml16.36±1.2823.25±2.15對照組103mL生理鹽水+佐劑3ml15.50±1.0116.42±1.87模型組103mL生理鹽水+佐劑3ml28.64±2.3534.37±2.20F值25.5816.71P<0.05<0.052.3DAI評估結果 記錄

16、第五天到第十天時，觀察組與模型組小鼠的出現(xiàn)明顯的體質(zhì)量降低和粘稠糊狀血便表現(xiàn)，兩組小鼠DAI評分結果差異無統(tǒng)計學意義3.5±0.2分VS3.4±0.3分t=1.12，P>0.05，而正常對照組沒有出現(xiàn)上述異常生理表現(xiàn)。從第十天開場，經(jīng)過LSP免疫的模型組不再出現(xiàn)明顯的體質(zhì)量減輕現(xiàn)象，糞便逐漸成形，評分結果明顯高于模型組DAI評分結果3.4±0.3分VS2.7±0.2分t=7.85，P<0.05。3討論本研究通過動物實驗觀察細菌脂多糖免疫小鼠后誘導實驗性炎癥性腸病的炎癥反響程度，檢測炎癥介質(zhì)TNF在血清和結腸組織的表達情況，首先通過病理形態(tài)觀察

17、結果進展定性分析：觀察組小鼠在通過細菌脂多糖免疫后，潰瘍點、靡爛點個數(shù)均較模型組明顯減少，同時炎癥細胞浸潤和杯狀細胞減少程度也明顯較輕，結合對照組小鼠觀察結果可以推斷出細菌脂多糖可降低小鼠結腸粘膜TNF-及血清TNF-的含量。通過ELISA法檢測TNF-在血清和結腸組織的表達情況來進展定量分析，實驗數(shù)據(jù)說明了結腸炎小鼠在經(jīng)過細菌脂多糖免疫后，其血清TNF-mRNA含量和結腸TNF-含量均有明顯的改善，與模型組數(shù)據(jù)結果相比，差異具有統(tǒng)計學意義，由此可以進一步得出結論：細菌脂多糖可降低小鼠結腸粘膜TNF-及血清TNF-的含量，這可能為其對潰瘍性結腸炎的治療提供理論依據(jù)。革蘭陰性菌細胞壁外膜的重要成

18、分之一是細菌內(nèi)毒素，它在細菌的感染機制中發(fā)揮著重要作用，也被認為是引起全身性炎癥綜合癥的主要物質(zhì)之一。LPS在人體內(nèi)能夠刺激巨噬細胞和單核細胞，促使細胞因子的分泌，進而引起病理生理的損傷。但是少量的LPS不但能夠使單核巨噬細胞系統(tǒng)活化，而且能夠加速內(nèi)源性細胞因子的釋放。通過動物實驗我們發(fā)現(xiàn)6-7：短期內(nèi)給予實驗動物致死劑量的內(nèi)毒素后，因為內(nèi)毒素而產(chǎn)生的發(fā)熱或者休克等生理表現(xiàn)消失，這種現(xiàn)象稱為內(nèi)毒素耐受。內(nèi)毒素耐受在生物體內(nèi)是一種保護性調(diào)節(jié)機制，是生物體在長期的進化過程中形成的，它能防止內(nèi)毒素對機體持續(xù)的、過度的刺激，對增強機體的防御功能具有重要的意義。實驗中選擇炎癥介質(zhì)TNF-的表達情況作為判

19、斷潰瘍性結腸炎病情的指標，主要是因為TNF-炎癥因子能夠準確的反映出小鼠結腸炎情況，相關文獻報道8-9，利用炎癥介質(zhì)TNF-的抗體治療結腸炎具有起效快、治療預后效果好的特點，并且在用藥2月后再給藥，能夠有效預防結腸炎的復發(fā)，這也近一步說明了TNF-炎癥因子是導致結腸炎發(fā)病的關鍵因子。從這一點出發(fā)，結合相關文獻10-13探討炎癥性腸炎的發(fā)生機制如下：TNF炎癥因子有兩個亞型：TNF-和TNF-，均屬于促炎細胞因子，主要由巨噬細胞和單核細胞分泌產(chǎn)生，能夠參與細胞的免疫反響過程中，而參與體液免疫反響的抗炎性因子主要包括由免疫T細胞分泌產(chǎn)生的IL-4，IL-5，IL-10和IL-13等，這些抗炎細胞因

20、子和促炎細胞因子之間的分泌代謝失衡，是引起結腸炎發(fā)病的重要作用機制之一，最后，關于炎癥性腸炎的免疫學發(fā)病機制有一個被廣泛認同的觀點，即炎癥性腸炎患者體內(nèi)的腸道免疫系統(tǒng)對自身的抗原或者外來抗原出現(xiàn)異常反響而致病，但是自身免疫反響產(chǎn)生的方式和損傷機制還沒有統(tǒng)一的定論，需要進展進一步的研究。參考文獻：1Xavier RJ，odolsky DK. Unravealing the pathogenesis of inflammatory bowel diseaseJNature，2021，448(7152):427-4342劉麗娜，梁麗娜.炎癥性腸病與腸粘膜免疫調(diào)節(jié)細胞.世界華人消化雜志.2021；28

21、.3Poltorak A , He X, Smirnova I , et a l . Defective LPS signaling in C3H / He J and C57BL / 10 ScCr mice: mutations in Tlr4 gene J .Science, 2021, 282 ( 4 ) : 2085-2088.4Morris GP,Beck PL, Herridge MS, et al.Hapten2inducedmodel ofchronic inflammation and ulceration in the rat colon.Gastroenterology 2021；96(3):795-803.5IukasiewiczJLugowski cBiologic activity of lipopolysaccharidesJPostepy Hig Med Dosw，2021，57(1)：33-536DAndrea A。AsteAmezaga MVajianle NM,et a1Intefleukin 10(IL-10)in