從胡蘿卜中提取色素的實(shí)驗(yàn)

1、從胡蘿卜中提取色素的實(shí)驗(yàn)前言色素分天然色素和合成色素兩大類，天然色素的應(yīng)用有著悠久的歷史，我國古代就有使用天然色素作紡織品染料、米飯、釀酒、化妝品等色料的記載。自從1856年英國人帕金合成出第一種人工色素苯胺紫之后，合成色素因其色澤鮮艷、著色力強(qiáng)、性質(zhì)穩(wěn)定且價格便宜等特點(diǎn)，在人們的生活中就開始扮演著非常重要的角色。隨著毒理學(xué)和分析化學(xué)的不斷發(fā)展，人類逐漸認(rèn)識到多數(shù)合成色素品種對人體有較為嚴(yán)重的毒性和致畸、致癌性，世界各國嚴(yán)格限制使用尚未弄清其安全性的合成色素品種，不少合成色素相繼從各國許可使用的名單中刪除。因而，現(xiàn)在利用無毒無害的天然物質(zhì)提取食用、化妝品和醫(yī)用色素，成為一種新的發(fā)展趨勢。 第一

2、部分：天然色素天然色素來自天然物質(zhì)，現(xiàn)今主要由植物組織中提取，也包括來自動物和微生物的一些色素。天然色素具有安全、健康的特點(diǎn)，許多還具有一定的營養(yǎng)價值和藥理功能。1天然色素的提取天然色素的生產(chǎn)和獲得主要有三條途徑：一是直接提??；二是人工合成；三是利用生物技術(shù)生產(chǎn)1。目前絕大多數(shù)品種的天然色素是采用直接提取方法生產(chǎn)的。色素的提取主要有下列方法：溶劑提取法、萃取法、酶法、壓榨法、粉碎法、組織培養(yǎng)法、微生物發(fā)酵法及人工合成法等，下面僅介紹幾種常用的、具有發(fā)展前景的天然色素提取方法。1.1溶劑提取法溶劑提取法是目前從動植物中提取色素的一種普遍常用的方法。溶劑提取法包括浸漬法、滲漉法、煎煮法和回流提取法

3、。以水為溶劑提取天然色素可用浸漬法和煎煮法，前者適用于有效成分能溶于水，對濕、熱穩(wěn)定且不易揮發(fā)的原料用有機(jī)溶劑提取可采用回流提取法。提取高粱紅色素是用0.1的鹽酸水溶液浸泡2h，除去雜質(zhì)和雜色后，再用7的乙醇水溶液在40下浸提，然后過濾、濃縮、干燥而得2。利用有機(jī)溶劑如甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等提取姜黃中的姜黃色素3。將蝦殼用鹽酸浸泡24h后過濾，濾渣用95乙醇浸泡，提取液經(jīng)蒸餾后得到濃縮的粗制蝦青素提取物4。相對而言，有機(jī)溶劑提取法萃取劑便宜，設(shè)備簡單，操作步驟簡單易行，提取率較高，但用其提取的某些產(chǎn)品的質(zhì)量較差，純度較低，有異味或溶劑殘留，影響產(chǎn)品的應(yīng)用范圍。1.2超臨界流體萃取法目前在

4、超臨界流體萃取(SFE)技術(shù)中使用最普遍的溶劑是CO2。超臨界二氧化碳流體萃取是近一二十年發(fā)展起來的一種新型物質(zhì)分離、精制技術(shù)。它兼?zhèn)溆袣怏w低粘度、高擴(kuò)散和流體的高密度、大溶解度兩方面的特點(diǎn)。由于超臨界CO2提取工藝簡單，能耗低，萃取劑便宜，提取的產(chǎn)品具有純度高、溶劑殘留少，無毒副作用等優(yōu)點(diǎn)，越來越受到人們的重視。Rozzi.NL研究了3286、13.780048.2686kPa條件下從番茄副產(chǎn)品中提取番茄紅素。結(jié)果表明，在86、34.478 6 kPa條件下得到了38.8的最大提取率。超臨界CO2流體萃取技術(shù)是一種新型的綠色分離技術(shù)，但因?yàn)榇嬖诩夹g(shù)尚不完善、設(shè)備復(fù)雜且昂貴、運(yùn)行成本高等問題，

5、使這種萃取方法在該領(lǐng)域的發(fā)展和應(yīng)用受到了一定的限制。 1.3微波萃取法微波萃取是在密閉容器中用微波加熱樣品及有機(jī)溶劑，將待測物質(zhì)組分從樣品基體中提取出來的一種方法。其能在短時間內(nèi)完成多種樣品組分的萃取，溶劑用量少，結(jié)果重現(xiàn)性好。目前，微波技術(shù)用于提取色素的報(bào)道不斷出現(xiàn)，涉及生物堿、黃酮、單寧類等物質(zhì)。王偉華等人研究出了利用微波萃取番茄紅素的最佳工藝條件，使得番茄紅素的提取率達(dá)到95，使提取時間大大縮短，與超臨界CO2萃取相比，它成本低，投資少，提取率高5。微波萃取天然色素技術(shù)在實(shí)驗(yàn)工作中雖然已經(jīng)取得一定重要成果，但由于受它的特性的限制，應(yīng)用范圍受到了一定的影響。1.4酶法在植物色素提取的過程中

6、，色素往往被包裹在細(xì)胞壁內(nèi)，而大部分植物的細(xì)胞壁由纖維素構(gòu)成。用纖維素酶可以破壞-D一葡萄糖苷鍵，使植物細(xì)胞壁破壞，有利于成分提取。根據(jù)此原理，在提取植物成分前先用纖維素酶酶解，使植物細(xì)胞壁破壞后再進(jìn)行提取，可提高活性成分的提取率。而不管是否使用酶，提取物的成分一致，這說明酶解沒有破壞植物色素的成分。總結(jié)，傳統(tǒng)的提取方法如粉碎法、壓榨法、有機(jī)溶劑提取法、回流法等存在著提取時間長、勞動強(qiáng)度大、原料預(yù)處理能耗高、熱敏性組分易被破壞、生產(chǎn)的色素產(chǎn)品純度差、有異味和溶劑殘留等缺點(diǎn)，直接影響了天然色素的發(fā)展及應(yīng)用。對人工合成法而言，由于生物合成代謝的復(fù)雜性，許多天然色素物質(zhì)很難在人工控制下化學(xué)合成，人工

7、合成的方法只能生產(chǎn)極個別的具有天然色素化學(xué)組成和分子結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，如胡蘿卜素。近年來隨著生物技術(shù)的發(fā)展，利用生物技術(shù)生產(chǎn)天然色素已為人們開闊了廣泛的領(lǐng)域，利用微生物發(fā)酵方法生產(chǎn)藍(lán)色素、紅曲色素等多種天然色素已成為現(xiàn)實(shí)6。2天然色素的分類和應(yīng)用天然色素按來源可分為：植物色素、動物色素和微生物色素三大類；按其溶解性質(zhì)不同又可分為水溶性色素和脂溶性色素；天然色素按其功效成分可分為：類胡蘿卜素類；黃酮類色素；花青苷類色素；葉綠素類色素；其他類色素如姜黃、紅曲、甜菜紅、紫草紅、紫膠紅、藍(lán)藻等。這里僅就幾種有代表性的天然色素的生理功能和用途作如下介紹。2.1類胡蘿卜素類類胡蘿卜素是植物和微生物合成的天然色素

8、，是多烯類色素代表，是胡蘿卜素(carotene)和胡蘿卜醇(xanthophylls)總稱。廣泛分布于生物界中，目前已發(fā)現(xiàn)類胡蘿卜素就有600多種。類胡蘿卜素按其組成和溶解性質(zhì)可分為兩類：胡蘿卜素類和葉黃素類。類胡蘿卜素類是國際公認(rèn)具有生理活性功能抗氧化劑，為單線態(tài)氧有效淬滅劑，能消除羥基自由基，在細(xì)胞中與細(xì)胞膜中脂類相結(jié)合，有效抑制脂質(zhì)氧化。較多攝入類胡蘿卜素能減少老年性前列腺癥和老年性視網(wǎng)膜黃斑變性7。近年有報(bào)道，其在抗癌、抗衰老等方面也有不少新的功能價值，因此類胡蘿卜素色素是一類開發(fā)前景十分廣闊的功能性食品添加劑。2.2黃酮類色素黃酮類色素是廣泛分布于植物組織中一類天然色素，多呈淺黃色

9、乃至無色，少數(shù)為鮮亮橙黃色。黃酮類化合物一直是人們所關(guān)注的抗氧化劑和自由基清除劑,眾多的研究表明,黃酮類化合物具有廣泛的生物活性,如抗氧化、抗突變、抗衰老、抗腫瘤抗菌等等12。其中最主要的是黃酮的抗氧化活性,主要表現(xiàn)在減少自由基的產(chǎn)生和清除自由基兩個方面。在黃酮類色素中，高粱紅色素、可可色素和洋蔥色素具有較強(qiáng)的抗氧活性。王立等人對烏飯樹樹葉中提取出的色素進(jìn)行了分離純化,分離出了4種黃酮類物質(zhì)。并且對這4種物質(zhì)清除活性氧自由基的能力進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)烏飯樹提取物都具有很強(qiáng)的清除自由基能力,清除能力最強(qiáng)的槲皮素和6#提取物的IC50達(dá)到了519ug/mL左右8。 2.3花青素類色素花色素又稱花青素，

10、存在于植物果實(shí)、花、莖和葉中細(xì)胞的液泡內(nèi)，是植物體內(nèi)一種水溶性色素。由于各種花色素分子結(jié)構(gòu)上差異或酸堿度不同，花色素就呈紅、紫、藍(lán)等不同顏色。花青素類不僅資源豐富，色彩絢麗，構(gòu)成色素王國中絕大部分，且生理活性也高，它是羥基供體，自由基清除劑，在眼科學(xué)和治療各種血液循環(huán)失調(diào)疾病等方面均有療效。2.4葉綠素類色素這類色素主要包括葉綠素及其銅鈉鹽、鋅鈉鹽。葉綠素廣泛存在于高等植物的葉、果實(shí)和藻類中。葉綠素具有補(bǔ)血、促進(jìn)造血、活化細(xì)胞、抗菌消炎等功效，近年來還發(fā)現(xiàn)葉綠素有抑制癌細(xì)胞生成作用，因而是一種保健食用色素。葉綠素鋅鈉在醫(yī)用上能用于治療慢性骨髓炎、慢性潰瘍、皮膚創(chuàng)傷、白血球減少等癥，在食品工業(yè)上

11、是很好的著色劑和營養(yǎng)強(qiáng)化劑。葉綠素銅鈉除作為一種綠色素、脫臭劑外，在醫(yī)學(xué)上也有許多生理功能，如葉綠素銅鈉鹽或其衍生物能促進(jìn)機(jī)體細(xì)胞新陳代謝、胃腸潰瘍面愈合及肝功能恢復(fù)，能用于治療傳染性肝炎、痔瘡、白血病、子宮疾患及胃和十二指腸潰瘍等，還能增進(jìn)造血機(jī)能及促使放射線損傷機(jī)體恢復(fù)。2.5其它類色素主要指紅曲色素、姜黃色素和紫草色素等。紅曲色素除應(yīng)用于食品中，起到增強(qiáng)食品風(fēng)味和抗菌、抑菌、提高產(chǎn)品保質(zhì)期作用外，還具有抗菌作用。另外，紅曲色素作為中藥還具有降脂、降壓、降糖、抑制腫瘤細(xì)胞及治療痢疾和胃病等功能。姜黃色素，因其著色力強(qiáng)，且具有抗炎、消除自由基、抑制毒素和抗癌等性能而廣泛應(yīng)用于食品及醫(yī)藥中，是

12、難得藥食兩用藥材，同時還是一種香料。它最主要生理功能為抗氧化，及與之相關(guān)生理功能，如可保護(hù)細(xì)胞的組分子不被破壞，對癌癥引發(fā)有抑制作用，甚至有報(bào)道，它還具有抗HIV病毒功能等。紫草作為中草藥，其臨床已有相當(dāng)長歷史，具有涼血、活血、解毒、透疹功效和抗炎、抗菌、抗病毒等作用。而從中提取的紫草色素，是一種很有前途的生物色素，其鮮艷明亮紅色用作化妝品添加劑，能明顯提高化妝品抗菌、消炎、潤膚、消斑功效；用作果酒、飲料、點(diǎn)心等食品添加劑，能增加其清熱消毒、消炎抗菌、防病抗癌等功能。3天然色素的開發(fā)中存在的問題及研究方向9與合成色素相比,天然色素也存在一些需要改進(jìn)的缺陷：大部分天然色素對光、熱、氧、金屬等敏感

13、，穩(wěn)定性較差；絕大多數(shù)天然色素染著力較差，染著不易均勻；天然色素對pH值變化十分敏感，色調(diào)會隨之發(fā)生很大變化；天然色素種類繁多、性質(zhì)復(fù)雜，就一種天然色素而言，應(yīng)用時專用性較強(qiáng)，運(yùn)用范圍較窄。另外一個問題是許多未發(fā)現(xiàn)的色素可能位于未發(fā)展的陸地和海洋，商業(yè)開發(fā)難度較大。鑒于這些困難，目前天然色素的研究工作主要集中在以下三個方面：合成工藝、生產(chǎn)技術(shù)和可替代的色素資源。另外研究開發(fā)新的食用天然色素以外，必須加強(qiáng)天然色素穩(wěn)定性和使用過程中色素穩(wěn)定化技術(shù)的研究。在自然界中微生物能產(chǎn)生色素的種類非常豐富，且具有不受資源、環(huán)境和空間限制的優(yōu)越性，因此被開發(fā)利用的潛力巨大，尤其是通過大量的發(fā)酵培養(yǎng)微生物即可獲得

14、天然色素產(chǎn)品，使生產(chǎn)成本大大降低，同時保護(hù)了環(huán)境和生態(tài)平衡，解決了資源短缺的矛盾，具有可持續(xù)開發(fā)利用的優(yōu)勢，而且產(chǎn)生的色素具有天然色素的特點(diǎn)，可應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)中。微生物色素也將是天然色素開發(fā)的一大方向。 第二部分：從胡蘿卜中提取色素的實(shí)驗(yàn)1實(shí)驗(yàn)?zāi)康?)      掌握從胡蘿卜中提取分離胡蘿卜素的原理和方法；2)      學(xué)會用色譜柱和紙色譜的實(shí)驗(yàn)操作；3)      學(xué)習(xí)并掌握柱色譜法的裝柱操作。2

15、實(shí)驗(yàn)原理胡蘿卜是營養(yǎng)價值很高的蔬菜，其胡蘿卜素含量豐富，胡蘿卜素與VA的性質(zhì)很相似，存在于有色植物中，有、和等幾種異構(gòu)體。其中，以胡蘿卜素的生理作用最好，可在動物的小腸、肝臟中轉(zhuǎn)化成V，所以也稱VA元。在胡蘿卜育種中，胡蘿卜素的含量是一項(xiàng)重要指標(biāo)。近年來，由于胡蘿卜素在防癌、抗癌方面的顯著作用，使得胡蘿卜素的研究更趨重要(10)。胡蘿卜素大都難溶于水，易溶于極性或非極性的有機(jī)溶劑，分子式C40H56.分子量536.85，熔點(diǎn)184，是不飽和碳?xì)浠衔?，難溶于甲、乙醇，可溶于乙醚、石油醚、丙酮等有機(jī)溶劑（11）。目前，對植物性食品中的胡蘿卜素含量的測定，可以用生物學(xué)鑒定法、溶劑分配法和層析法（1

16、2），。本實(shí)驗(yàn)通過柱色譜法，薄層色譜法提取胡蘿卜中的胡蘿卜素（11）并進(jìn)行鑒定。A.      柱色譜法原理：柱層析是化合物在液相和固相之間的分配，屬于固液吸附層析，在一般柱色譜裝置中，柱內(nèi)裝有“活性”固體（固定相）如氧化鋁或硅膠等，液體樣品從柱頂加入，流經(jīng)吸附柱時即被吸附在柱的上端，然后從柱頂加入洗脫溶劑沖洗，由于固定相對各組分吸附能力不同，以不同速度沿柱下移，形成若干色帶。再用溶劑洗脫，吸附能力最弱的部分隨溶劑首先流出，分別收集各組分，再逐個鑒定，若各組分是有色的物質(zhì)，則在柱上可以直接看到色帶。B.  

17、0;  薄層色譜法原理：薄層色譜法是快速分離和定性分析少量物質(zhì)的一種重要的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，也用于跟蹤反應(yīng)進(jìn)程。在玻璃板上均勻的鋪上一薄層吸附劑，制成薄層板，用毛細(xì)管將樣品溶液點(diǎn)在起始處，將此薄層板置于盛有溶劑的容器中，待溶液到達(dá)前沿后取出，晾干，顯色，測定色斑的位置。3儀器與試劑1)      儀器： 色譜柱 、濾紙、玻璃棒、毛細(xì)管 、50 mL燒杯、烘箱、250 mL廣口瓶2)      試劑： 新鮮胡蘿卜5 g 、 &

18、#160;丙酮30mL 、石油醚（bp 3060）20 mL、   石油醚（bp 6090）150 mL、丁醇-水、乙醇、無水硫酸鈉、羧甲基纖維素鈉水溶液、層析用硅膠（80100目）40g、1：9丙酮-石油醚     注:1-層析缸; 2-薄層板3-展開劑蒸氣; 4-展開劑                   

19、0;                                                圖11柱色譜裝置&#

20、160;                 圖 12 薄層色譜裝置4實(shí)驗(yàn)操作1. 胡蘿卜素石油醚溶液的制備13-15稱取10g新鮮胡蘿卜，搗碎，置于50mL的三角燒瓶中， 重復(fù)萃取2次，每次用10mL.丙酮。最后用石油醚（bp3060）萃取固體2次，每次用10mL。把石油醚溶液加到丙酮溶液里面中。在分液漏斗中將混合物與50mL飽和氯化鈉溶液振蕩，分出有機(jī)層，用蒸餾水洗滌2次，每次50mL，分去水，用

21、無水硫酸鈉干燥石油醚溶液（約1小時），再往制得的固體加入3mL石油醚（bp 6090）拌硅膠1g，在通風(fēng)櫥抽干溶劑，得黃色硅膠顆粒，待上柱。2.  裝柱和分離 選色譜柱20cm×1 cm，關(guān)閉活塞，向柱內(nèi)倒入石油醚（bp 6090）至約為柱高的3/4處，打開活塞，控制流速為1滴/S，將層析硅膠用石油醚先調(diào)成糊狀，再徐徐倒入柱中，用洗耳球輕輕敲打柱身，使填裝緊密。當(dāng)柱裝到3/4時，再在上面加一層0.5 cm厚的海石沙，操作時一直保持上述流速，當(dāng)溶劑面流至離海石沙面1 cm處，立即從玻璃漏斗加入已制備好的含胡蘿卜素的黃色硅膠，隨后用0.5 mL石油醚洗下管壁

22、的硅膠，如此連續(xù)幾次，直至洗凈。然后在色譜柱上裝上滴液漏斗，用石油醚（bp 6090）作洗脫劑，洗速1滴/s。當(dāng)有一黃色的譜帶分出，待黃色組分絕大部分洗出后，把洗脫液換成10丙酮和90石油醚（bp 6090）混合液進(jìn)行洗脫，控制流出速度如前，分出黃色組分。在4590min內(nèi)，柱內(nèi)的物料將全部洗脫下來。收集好3份洗出液，對各段洗出液進(jìn)行薄層色譜分析。3.胡蘿卜素的薄層色譜法分析將前面得到的胡蘿卜素樣品以及柱色譜分離得到的樣品分別進(jìn)行薄層色譜分析，以檢查柱色譜分離的效果。薄層層析板預(yù)先用硅膠制備并活化好，展開劑為10丙酮和90石油醚（bp 6090），薄層分離后觀察斑點(diǎn)位置，計(jì)算各斑點(diǎn)的Rf值（理

23、論值-胡蘿卜素黃色Rf值為0.89），其中比移值Rf=溶質(zhì)移動的距離溶液移動的距離。5.注意事項(xiàng)1、洗脫劑用以洗脫混和提取液中的胡蘿卜素。2、洗脫劑由丙酮-石油醚組成，丙酮所占比例越多，洗脫力越大，但必須注意丙酮用量，控制在只將胡蘿卜素洗下來而不將其它色素洗下（6）。3、胡蘿卜素在光下易分解破壞，應(yīng)在較暗處操作。6.實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象的記錄如下： 操作實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象10g胡蘿卜，搗碎成粉末，丙酮萃取兩次，每次取丙酮10mL橙黃色液體石油醚萃取兩次，每次取石油醚10mL橙黃色液體合并萃取液于分液漏斗中，加50mL飽和NaCl溶液洗滌分層，上層為橙黃色，下層為乳黃色。用水洗滌，每次取50m

24、L水上層為橙黃色油狀液體，下層為乳黃色取上層溶液加少量無水硫酸鈉干燥澄清橙色液體，瓶底出現(xiàn)少量固體取澄清液進(jìn)行水浴蒸餾，加熱直至燒瓶內(nèi)剩余少量黃色溶液為止，再冷卻后加入3mL石油醚拌硅膠1g，用洗耳球吹干黃色硅膠顆粒為樣品裝柱：先往柱內(nèi)裝一層細(xì)沙，再一邊加入硅膠與石油醚的糊狀一邊用洗耳球輕敲柱，是均勻裝柱無氣泡產(chǎn)生，在裝柱達(dá)3/4處停止裝柱，再往柱加一層細(xì)沙即可。柱呈為白色加樣品于柱中，再接上滴液漏斗（內(nèi)裝1：9丙酮-石油醚）分三層，上層顏色較深，為橙色，接著是橙黃色，最后是黃色，不過不明顯 洗脫后 得黃色溶液，柱依舊為白色     參考文獻(xiàn)1  鄧祥元,王淑軍,李富超,秦松.天然色素的資源和應(yīng)用.中國調(diào)味品,2006(10):49-53.2 &