實(shí)驗(yàn)3培養(yǎng)基的配制及消毒滅菌

1、實(shí)驗(yàn)3 培養(yǎng)基的配制及消毒滅菌第一講、培養(yǎng)基的配制一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛢?nèi)容目的：學(xué)習(xí)和掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟。內(nèi)容：1牛肉膏蛋白陳培養(yǎng)基的配制。2高氏1號(hào)培養(yǎng)基的配制。3馬丁氏培養(yǎng)基的配制。二、實(shí)驗(yàn)材料和用具 牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉紅、鏈霉素、1mol/L NaOH、lmol/L HCl、KNO3、NaCl、K2HPO43H2O、MgSO47H2O、FeSO47H2O。試管、三角瓶、燒杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH試紙、棉花、牛皮紙、記號(hào)筆、線繩、紗布、漏斗、漏斗架、膠管、止水夾等。三、操作步驟（一）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應(yīng)用最廣泛和

2、最普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基。其配方如下：牛肉膏3g，蛋白胨10g，Nacl5g，瓊脂1520g，水1000mL，PH7.47.6 1稱藥品 按實(shí)際用量計(jì)算后，按配方稱取各種藥品放入大燒杯中。牛肉膏可放在小燒杯或表面皿中稱量，用熱水溶解后倒入大燒杯；也可放在稱量紙上稱量，隨后放入熱水中，牛肉膏使與稱量紙分離，立即取出紙片。蛋白胨極易吸潮，故稱量時(shí)要迅速。2加熱溶解 在燒杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉網(wǎng)上，小火加熱，并用玻棒攪拌，待藥品完全溶解后再補(bǔ)充水分至所需量。若配制固體培養(yǎng)基，則將稱好的瓊脂放入己溶解的藥品中，再加熱融化，此過程中，需不斷攪拌，以防瓊脂糊底或溢出，最后補(bǔ)足所失的水分。3

3、調(diào)pH 檢測培養(yǎng)基的pH，若pH偏酸，可滴加lmol/L NaOH，邊加邊攪拌，并隨時(shí)用pH試紙檢測，直至達(dá)到所需pH范圍。若偏堿，則用lmol/L HCl進(jìn)行調(diào)節(jié)。pH的調(diào)節(jié)通常放在加瓊脂之前。應(yīng)注意pH值不要調(diào)過頭，以免回調(diào)而影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度。4過濾 液體培養(yǎng)基可用濾紙過濾，固體培養(yǎng)基可用4層紗布趁熱過濾，以利培養(yǎng)的觀察。但是供一般使用的培養(yǎng)基，這步可省略。5分裝 按實(shí)驗(yàn)要求，可將配制的培養(yǎng)基分裝入試管或三角瓶內(nèi)。分裝時(shí)可用漏斗以免使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上而造成污染。分裝量：固體培養(yǎng)基約為試管高度的l/5，滅菌后制成斜面。分裝入三角瓶內(nèi)以不超過其容積的一半為宜。半固體培養(yǎng)基以試管高

4、度的1/3為宜，滅菌后垂直待凝。6加棉塞 試管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脫脂棉)制作的棉塞。棉塞的形狀、大小和松緊度要合適，四周緊貼管壁，不留縫隙，才能起到防止雜菌侵入和有利通氣的作用。要使棉塞總長約3/5塞入試管口或瓶口內(nèi)，以防棉塞脫落。有些微生物需要更好的通氣，則可用8層紗布制成通氣塞。有時(shí)也可用試管帽或塑料塞代替棉塞。7包扎 加塞后，將三角瓶的棉塞外包一層牛皮紙或雙層報(bào)紙，以防滅菌時(shí)冷凝水沾濕棉塞。若培養(yǎng)基分裝于試管中，則應(yīng)以5支或7支在一起，再于棉塞外包一層牛皮紙，用繩扎好。然后用記號(hào)筆注明、培養(yǎng)基名稱、組別、日期。8滅菌 將上述培養(yǎng)基于121.3濕熱滅菌20min。如因特殊情況不

5、能及時(shí)滅菌，則應(yīng)故人冰箱內(nèi)暫存。9擺斜面 滅菌后，如制斜面，則需趁熱將試管口端擱在一根長木條上，并調(diào)整斜度，便斜面的長度不超過試管總長的1/2。10無菌檢查 將滅菌的培養(yǎng)基放入37溫箱中培養(yǎng)2448h，無菌生長即可使用，或貯存于冰箱或清潔的櫥內(nèi)，備用。（二）高氏l號(hào)培養(yǎng)基的配制高氏1號(hào)培養(yǎng)基是用于分離和培養(yǎng)放線菌的合成培養(yǎng)基。其配方如下：可溶性淀粉20g，KNO3 1g，NaCl 0.5g，K2HPO43H2O 0.5g，MgSO47H2O 0.5g，F(xiàn)eSO47H2O 0.01g，瓊脂1520g，水1000mL，pH7.47.6。 l稱量和溶解 先計(jì)算后稱量，按用量先稱取可溶性淀粉，放入小燒

6、杯中，并用少量冷水將其調(diào)成糊狀，再加至少于所需水量的水，繼續(xù)加熱，邊加熱邊攪拌，至其完全溶解。再加入其他成分依次溶解。對(duì)微量成分FeSO47H2O可先配成高濃度的貯備液后再加入，方法是先在1000mL中加入1g的FeSO47H2O，配成濃度為0.01g/mL的貯備液，再在1000mL培養(yǎng)基中加入以上貯備液1mL即可。待所有藥品完全溶解后，補(bǔ)充水分到所需的總體積。如要配制固體培養(yǎng)基，其瓊脂溶解過程同牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配制。2pH調(diào)節(jié)、分裝、包扎及無菌檢查 同牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配制。（三）馬丁氏培養(yǎng)基的配制馬丁氏培養(yǎng)基是用于分離真菌的選擇培養(yǎng)基。其配方如下：K2HPO4 1g，MgSO47H2O

7、0.5g，蛋白胨5g，葡萄糖l0g，瓊脂1520g，水1000mL，自然pH。1稱量和溶解 先計(jì)算后稱量，按用量稱取各成分，并將其溶解在少于所需的水中。待各成分完全溶解后，補(bǔ)充水分到所需體積。再將孟加拉紅配成1%的水溶液，在1000mL培養(yǎng)液中加入以上孟加拉紅溶液3.3mL，混勻后，加入瓊脂加熱融化，方法同牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配制。2分裝、包扎、滅菌及無菌檢查同牛肉膏蛋白膝培養(yǎng)基配制。 3鏈霉素的加入 鏈霉素受熱容易分解，所以臨用時(shí)，將培養(yǎng)基融化后待溫度降至45左右時(shí)才能加入?？上葘㈡溍顾嘏涑?%的溶液(配好的鏈霉素溶液保存于-20)，在100mL培養(yǎng)基中加1%鏈霉素0.3mL ，使每毫升培養(yǎng)基

8、中合鏈霉素30g。四、注意事項(xiàng) 稱藥品用的牛角匙不要混用，稱完藥品應(yīng)及時(shí)蓋緊瓶蓋。調(diào)pH時(shí)要小心操作，避免回調(diào)。不同培養(yǎng)基各有配制特點(diǎn)，要注意具體操作。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告記錄本實(shí)驗(yàn)配制培養(yǎng)基的名稱、數(shù)量，并圖解說明其配制過程，指明要點(diǎn)。六、問題和思考l配制培養(yǎng)基有哪幾個(gè)步驟?在操作過程中應(yīng)注意些什么問題?為什么?2培養(yǎng)基配制完成后，為什么必須立即滅菌?若不能及時(shí)滅菌應(yīng)如何處理?已滅菌的培養(yǎng)基如何進(jìn)行無菌檢查? 3試設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對(duì)飲料進(jìn)行無菌檢查。第二講 消毒與滅菌一、干熱滅菌（一）目的要求1了解干熱滅菌的原理和應(yīng)用范圍。2學(xué)習(xí)干熱滅菌的操作技術(shù)。（二）基本原理干熱滅菌是利用高溫使微生物細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固

9、變性而達(dá)到滅菌的目的。細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固性與其本身的含水量有關(guān)，在菌體受熱時(shí)，當(dāng)環(huán)境和細(xì)胞內(nèi)含水量越大，則蛋白蛋凝固就越快，反之含水量越少，凝固緩慢。因此，與濕熱滅菌相比，干熱滅菌所需溫度要高（160170），時(shí)間要長（12h），但干熱滅菌溫度不能超過180，否則，包器皿的紙或棉塞就會(huì)燒焦，甚至引起燃燒。干熱滅菌使用的電烘箱的結(jié)構(gòu)如圖3-1。（三）器材培養(yǎng)皿、試管、吸管、電烘箱等。（四）操作步驟1裝入待滅菌物品將包好的待滅菌物品（培養(yǎng)皿、試管，吸管等）放入電烘箱內(nèi)，關(guān)好箱門。物品不要擺得太擠，以免妨礙空氣流通，滅菌物品不要接觸電烘箱內(nèi)壁的鐵板，以防包裝紙烤焦起火。2升溫接通電源，撥動(dòng)開關(guān)，打開

10、電烘箱排氣孔，旋動(dòng)恒溫調(diào)節(jié)器至綠燈亮，讓溫度逐漸上升。當(dāng)溫度升至100時(shí)，關(guān)閉排氣孔。在升溫過程中，如果紅燈熄滅，綠燈亮，表示箱內(nèi)停止加溫，此時(shí)如果還未達(dá)到所需的160170溫度，則需轉(zhuǎn)動(dòng)調(diào)節(jié)器使紅燈再亮，如此反復(fù)調(diào)節(jié)，直至達(dá)到所需溫度。3恒溫當(dāng)溫度升達(dá)到160170時(shí)，恒溫調(diào)節(jié)器會(huì)自動(dòng)控制調(diào)節(jié)溫度，保持此溫度2h。干熱火菌過程。嚴(yán)防恒溫調(diào)節(jié)的自動(dòng)控制失靈而造成安全事故。4降溫切斷電源、自然降溫。5開箱取物待電烘箱內(nèi)溫度降到70以下后，打開箱門，取出滅菌物品。電烘箱內(nèi)溫度末降到70，切勿自行打開箱門以免驟然降溫導(dǎo)致玻璃器皿炸裂。（五）實(shí)驗(yàn)報(bào)告思考題l在干熱滅菌操作過程中應(yīng)注意哪些問題，為什么?

11、2為什么干熱火菌比濕熱滅菌所需要的溫度要高，時(shí)間要長?請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)干熱滅菌和濕熱滅菌效果比較實(shí)驗(yàn)方案。圖3-1 電烘箱的外觀和結(jié)構(gòu)A.外觀 B.結(jié)構(gòu)1.溫度計(jì); 2.排氣閥; 3.箱體; 4.控溫器旋鈕; 5.箱門; 6.指示燈; 7.加熱開關(guān); 8.溫度控制閥; 9.控制室; 10.側(cè)門; 11.工作室; 12. 保溫室; 13.電熱器; 14. 散熱板; 15.擱板二 高壓蒸氣滅菌（一）目的要求1了解高壓蒸氣滅菌的基本原理及應(yīng)用范圍。2學(xué)習(xí)高壓蒸氣滅菌的操作方法。（二）基本原理高壓蒸氣滅菌是將待滅菌的物品放在一個(gè)密閉的加壓滅菌鍋內(nèi)，通過加熱，使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產(chǎn)生蒸氣。待水蒸氣急劇地將鍋內(nèi)

12、的冷空氣從排氣閥中驅(qū)盡，然后關(guān)閉排氣閥，繼續(xù)加熱，此時(shí)由于蒸氣不能溢出，而增加了滅菌鍋內(nèi)的壓力，從而使沸點(diǎn)增高，得到高于100的溫度。導(dǎo)致菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌的目的。在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大。其原因有三：一是濕熱中細(xì)菌菌體吸收水分，蛋白質(zhì)較易凝固，因蛋白質(zhì)含水量增加，所需凝固溫度降低（表3-1），二是濕熱的穿透力比干熱大（表3-2），三是濕熱的蒸氣有潛熱存在。1g水在100時(shí)，由氣態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)時(shí)可放出2.26kJ(千焦)的熱量。這種潛熱，能迅速提高被滅菌物體的溫度，從而增加滅菌效力。在使用高壓蒸氣滅菌鍋滅菌時(shí)，滅菌鍋內(nèi)冷空氣的排除是否完全極為重要，因?yàn)榭諝獾呐蛎泬捍笥谒魵獾?/p>

13、膨脹壓，所以，當(dāng)水蒸氣中含有空氣時(shí)，在同一壓力下，含空氣蒸氣的溫度低于飽和蒸氣的溫度。滅菌鍋內(nèi)留有不同分量空氣時(shí)，壓力與溫度的關(guān)系見（表3-3）表3-1 蛋白質(zhì)含水量與凝固所需溫度的關(guān)系卵白蛋白含水量/%30分鐘內(nèi)凝固所需溫度/505625748018809061450160170表3-2 干熱溫?zé)岽┩噶皽缇Ч容^溫度/時(shí)間/h透過布層的溫度/滅菌20層10層100層干熱130-1404867270.5不完全濕熱105.33101101101完全表3-3 滅菌鍋留有不同分量空氣時(shí)，壓力與溫度的關(guān)系壓力數(shù)全部空氣排出時(shí)的溫度/2/3空氣排出時(shí)的溫度/1/2空氣排出時(shí)的溫度/1/3空氣排出時(shí)的

14、溫度/空氣全不排出時(shí)的溫度/MpaKg/cm2Ib/in20.030.355108.81009490720.070.7010115.6109105100900.1010.515121.31151121091000.141.4020126.21211181151090.171.7525130.01261241211150.212.1030134.6130128126121現(xiàn)在法定壓力單位己不用磅和kg/cm2表示，而是用Pa或bar表示，其換算關(guān)系為：1kg/cm2=98066.5Pa；1Ib/in2=6894.76Pa.一般培養(yǎng)基用0.1Mpa（相當(dāng)于15 Ib/in2或1.05kg/cm2）

15、，121.5,1530min可達(dá)到徹底滅菌的目的。滅菌的溫度及維持的時(shí)間隨滅菌物品的性質(zhì)和容量等具體情況而有所改變。例如含糖培養(yǎng)基用0.06Mpa（8Ib/in2或0.59kg/cm2）112.6滅菌，然后以無菌操作手續(xù)加入滅菌的糖溶液。又如盛于試管內(nèi)的培養(yǎng)基以0.1Mpa,121.5滅菌20min即可，而盛于大瓶內(nèi)的培養(yǎng)基最好以0.1Mpa，122滅菌30min。實(shí)驗(yàn)中常用的非自控高壓蒸氣滅菌鍋有臥式（圖3-2，A）和手提式（圖3-2，B）二種，其結(jié)構(gòu)和工作原理相同，本實(shí)驗(yàn)以手提式高壓蒸氣滅菌鍋為例，介紹其使用方法，有關(guān)自控高壓蒸氣滅菌鍋（autoclave）的使用可參照廠家說明書。（三）器

16、材牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，培養(yǎng)皿(6套一包)，手提式高壓蒸氣滅菌鍋等。（四）操作步驟1首先將內(nèi)層鍋取出，再向外層鍋內(nèi)加入適量的水，使水面與三角擱架相平為宜。 切勿忘記加水，同時(shí)水量不可過少，以防滅菌鍋燒干而引起炸裂事故。2放回內(nèi)層鍋，并裝入待滅菌物品。注意不要裝得太擠，以免防礙蒸氣流通而影響滅菌效果。三角燒瓶與試管口端均不要與鍋壁接觸，以免冷凝水淋濕包口的紙而透入棉塞。3加蓋，并將蓋上的排氣軟管插入內(nèi)層鍋的排氣槽內(nèi)。再以兩兩對(duì)稱的方式同時(shí)旋緊相對(duì)的兩個(gè)螺栓，使螺栓松緊一致，勿使漏氣。4用電爐或煤氣加熱，并同時(shí)打開排氣閥，使水沸騰以排除鍋內(nèi)的冷空氣。待冷空氣完全排盡后，關(guān)上排氣閥，讓鍋內(nèi)的溫度隨蒸氣

17、壓力增加到逐漸上升。當(dāng)鍋內(nèi)壓力升到所需壓力時(shí)，控制熱源，維持壓力至所需時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)用0.1Mpa，121.5，20min滅菌。滅菌的主要因素是溫度而不是壓力。因此鍋內(nèi)冷空氣必須完全排盡后，才能關(guān)上排氣閥，維持所需壓力。5滅菌所需時(shí)間到后，切斷電源或關(guān)閉煤氣，讓滅菌鍋內(nèi)溫度自然下降，當(dāng)壓力表的壓力降至“0”時(shí)，打開排氣閥，旋松螺栓，打開蓋子，取出滅菌物品。壓力一定要降到“0”時(shí)，才能打開排氣閥，開蓋取物。否則就會(huì)因鍋內(nèi)壓力突然下降，使容器內(nèi)的培養(yǎng)基由于內(nèi)外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口，造成棉塞沾染培養(yǎng)基而發(fā)生污染，甚至灼傷操作者。6將取出的滅菌培養(yǎng)基，需擺斜面的則擺成斜面，然后放入37溫箱培養(yǎng)

18、24h，經(jīng)檢查若無雜菌生長，即可待用。 圖3-2A 臥式滅菌鍋 圖3-2B 手提式滅菌鍋1. 安全閥; 2.壓力表; 3.放氣閥; 4.軟管; 5.緊固螺栓; 6.滅菌桶; 7. 篩架; 8.水 （五）實(shí)驗(yàn)報(bào)告l結(jié)果檢查培養(yǎng)基滅菌是否徹底。 2思考題（1）高壓蒸氣滅菌開始之前，為什么要將鍋內(nèi)冷空氣排盡?滅菌完畢后，為什么待壓力降低“0”時(shí)才能打開排氣閥，開蓋取物？（2）在使用高壓蒸氣滅菌鍋滅菌時(shí)，怎樣杜絕一切不安全的因素?（3）滅菌在微生物實(shí)驗(yàn)操作中有何重要意義?（4）黑曲霉的孢子與芽孢桿菌的孢子對(duì)熱的抗性哪個(gè)最強(qiáng)?為什么? 三、紫外線滅菌（一）目的要求了解紫外線滅菌的原理和方法（二）基本原理

19、紫外線滅菌是用紫外線燈進(jìn)行的。波長為200300nm的紫外線都有殺菌能力，其中以260nm的殺菌力最強(qiáng)。在波長一定的條件下，紫外線的殺菌效率與強(qiáng)度和時(shí)間的乘積成正比。紫外線殺菌機(jī)理主要是因?yàn)樗T導(dǎo)了胸腺嘧啶二聚體的形成和DNA鏈的交聯(lián)，從而抑制了DNA的復(fù)制。另一方面，由于輻射能使空氣中的氧電離成O，再使O2氧化生成臭氧（O3）或使水（H2O）氧化生成過氧化氫（H2O2）。O3和H2O2均有殺菌作用。紫外線穿透力不大，所以，只適用于無菌室，接種箱，手術(shù)室內(nèi)的空氣及物體表面的滅菌。紫外線燈距照射物以不超過1.2m為宜。此外，為了加強(qiáng)紫外線滅菌效果，在打開紫外燈以前；可在無菌室內(nèi)(或接種箱內(nèi))噴灑

20、3%5%石炭酸溶液，一方面使空氣中附著有微生物的塵埃降落，另一方面也可以殺死一部分細(xì)菌。無菌室內(nèi)的桌面、凳子可用2%3%的來蘇爾擦洗，然后再開紫外燈照射，即可增強(qiáng)殺菌效果，達(dá)到滅菌目的。（三）器材1培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨平板。2溶液或試劑 3%5%石炭酸或2%3%來蘇爾溶液。3儀器或其他用具 紫外線燈。（四）操作步驟l單用紫外線照射（1）在無菌室內(nèi)或在接種箱內(nèi)打開紫外線燈開關(guān)，照射30min，將開關(guān)關(guān)閉。（2）將牛肉膏蛋白胨平板蓋打開15min，然后蓋上皿蓋。置37培養(yǎng)24h。共做三套。 （3）檢查每個(gè)平板上生長的菌落數(shù)。如果不超過4個(gè)，說明滅菌效果良好，否則，需延長照射時(shí)間或同時(shí)加強(qiáng)其他措施。

21、 2化學(xué)消毒劑與紫外線照射結(jié)合使用（1）在無菌室內(nèi)，先噴灑3%5%的石炭酸溶液，再用紫外線燈照射15imn。 （2）無菌室內(nèi)的桌面，凳子用2%3%來蘇爾擦洗，再打開紫外線燈照射15min。 （3）檢查滅菌效果方法同“單用紫外線照射”(3)。 因紫外線對(duì)眼結(jié)膜及視神經(jīng)有損傷作用，對(duì)皮膚有刺激作用，故不能直視紫外線燈光下工作。（五）實(shí)驗(yàn)報(bào)告1結(jié)果記錄兩種滅菌效果于下表中處理方法平板菌落數(shù)1 2 3滅菌效果比較紫外線照射3%5%石炭酸+紫外線照射2%3%來蘇爾+紫外線照射2思考題。（1）細(xì)菌營養(yǎng)體細(xì)胞和細(xì)菌芽孢對(duì)紫外線和的抵抗力會(huì)一樣嗎，為什么？（2）你知道紫外線燈管是用什么玻璃制作的？為什么不用普通燈用玻璃？（3）在紫外燈下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)，為什么要隔一塊普通玻璃？四 微孔濾膜過濾除菌（一）目的要求1了解過濾除菌的原理。2掌握微孔濾膜過濾除菌的方法。（二）基本原理過濾除菌是通過機(jī)械作用濾去液體或氣體中細(xì)菌的方法。根據(jù)不同的需要選用不同的濾器和濾板材料。微孔濾膜過濾器是由上下二個(gè)分別具有出口和入口連接裝置的塑料蓋盒組成，出口處可連接針頭，人口