WesternBlot常見問題及處理總結(jié)說課材料

1、We s t e r n Bl o t 常 見問題及處理總結(jié)免疫細(xì)胞研究 western blotWestern Blot常見問題及處理總結(jié)阿木1、western blot 的優(yōu)點答：靈敏，可達(dá)ng級，用Ecl顯色法理 論上可達(dá)pg級。方便，特異性高。2、為什么我的細(xì)胞提取液中沒有目標(biāo)蛋白？答:原因有很多：a）你的細(xì)胞中不表達(dá)這種蛋白質(zhì)，換一種細(xì)胞；b）你的細(xì)胞中的蛋白質(zhì)被降解掉了，你必需加入PMSF，抑制蛋白酶活性；c）你的抗體不能識別目標(biāo)蛋白，多看看說明，看是否有問題。3、我的細(xì)胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，為什么呢？答：a）有沉淀可能因為你的蛋白沒有變性完全，可以適當(dāng)提高SDS濃度，同

2、時將樣品煮沸時間延長，b）也不排除你的抗原濃度過高，這時再加入適量上樣緩沖液即可。4、我做的蛋白質(zhì)分子量很小（10KD），請問怎么做WB ?答：可以選擇o.2卩m勺膜，同時縮短轉(zhuǎn) 移時間。也可以將兩張膜疊在一起，再轉(zhuǎn) 移。其他按步驟即可。5、我的目的帶很弱，怎么加強？答：可以加大抗原上樣量。這是最主要 的。同時也可以將一抗稀釋比例降低。6、膠片背景很臟，有什么解決方法？答：減少抗原上樣量，降低一抗?jié)舛?，?變一抗孵育時間，提高牛奶濃度。7、目標(biāo)帶是空白，周圍有背景，是為什么？答：你的一抗?jié)舛容^高，二抗上 HRP催 化活力太強，同時你的顯色底物處于一個 臨界點，反應(yīng)時間不長，將周圍底物催化 完，

3、形成了空白即 反亮現(xiàn)象”將一抗和 二抗?jié)舛冉档停蚋鼡Q新底物。、我的膠片是一片空白，是怎么回事?答：如果能夠排除下面的幾個問題那么問題多半岀現(xiàn)在一抗和抗原制備上。a)二抗的HRP活性太強，將底物消耗光；b) ECM底物中H2O2，不穩(wěn)定，失活；c) ECL底物沒覆蓋到相應(yīng)位置；d)二抗失活。9、我在顯影液中顯影1分鐘和5分鐘后,底片漆黑一片，是什么原因呢？答：a)可能是紅燈造成的，膠片本來就被 曝光了，可以在完全黑暗的情況下操作. 看是否有改善.；b)顯影時間過長。10、DAB好還是ECM好？答: DAB有毒，但是比較靈敏，是 HRP 最敏感的底物；ECM結(jié)果容易控制，但 被催化時靈敏度差一點

4、，但如果達(dá)到閥 值，就特別靈敏，可以檢測pg級抗原。 要看你實驗的情況。11、抗原檢測出的分子量比資料上的大， 是怎么回事？答：a）抗原形成了二聚體。增多巰基乙醇 量，煮沸變性時間延長，可以打開二聚 體。b）蛋白本身的修飾如：糖基化，磷酸 化等 12、蛋白轉(zhuǎn)移不到膜上，但膠上有，同時Marker轉(zhuǎn)上去了，為什么？答：可能是：a）樣品濃度過低；b）轉(zhuǎn)移時間不夠，。13、磷酸化抗體的檢測樣本制備時是否一 定要加NaF等？答：NaF是一種廣譜磷酸化酶的抑制劑，一般最好加。但是不加也可以，大部分時候是不用加的。14、要驗證某個細(xì)胞上有無該蛋白的存在，需要做免疫組化和western blot試驗嗎？做這

5、兩個試驗時的一抗和二抗可以共用嗎？答：免疫組化可以用來進(jìn)行定位，但 是不能精確定量，而且有時會有假陽性， 不易與背景區(qū)分；Western blot可以特異 性檢測某個蛋白質(zhì)分子，進(jìn)行定量，但是 不能定位。兩種實驗的一抗有時候不能通用，公司的產(chǎn)品說明一般都會說明可以進(jìn)行什么實驗，在免疫組化時，是否適合石蠟切片或者冰凍切片。15、做Western Blot時，提取蛋白后凍 存（未加蛋白酶抑制劑），用的博士德的 一抗，開始還有點痕跡，現(xiàn)在越來越差，上樣量已加到120 g換了個santa cloz 的一抗仍不行。是什么原因？蛋白酶抑制 劑單加PMSF行嗎？答：懷疑是樣品問題，可能是：1,樣品 不能反復(fù)

6、凍融；2,樣品未加蛋白酶抑制劑。同時，建議檢查 Western Blot過程，提咼一抗?jié)舛?。對于加蛋白酶抑制劑來說，一般加PMSF就可以了，最好能多加幾中種蛋白酶抑制劑。16、細(xì)胞水平要做 western blot，多少細(xì)胞提的蛋白夠做 western blot ?答：一般5X10A6就足夠了17、同一樣品能同時提RNA又提蛋白么？這樣對 western blot有無影響？答：能，沒有問題。Western Blot 檢測嗎？答:當(dāng)然可以，有的甚至可以同時測幾十 種樣品。18、同一蛋白樣品能同時進(jìn)行兩種因子的19、如果目標(biāo)蛋白是膜蛋白或是胞漿蛋白，操作需要注意什么？答：如果是膜蛋白和胞漿蛋白，所

7、用的去 垢劑要溫和得多，這時最好加上 NaF去 抑制磷酸化酶的活性。20、我的樣品的蛋白含量很低，每微升不 到1微克，但是在轉(zhuǎn)膜時經(jīng)常會發(fā)現(xiàn)只有 一部分蛋白轉(zhuǎn)到了膜上，就是在轉(zhuǎn)膜后染 膠發(fā)現(xiàn)有的孔所有的蛋白條帶都在，只是 顏色變淡了，有什么辦法可以解決？答：你可以加大上樣量，沒有問題，還有 轉(zhuǎn)移時你可以用減少電流延長時間，加 20%甲醇。21、想分離的蛋白是分子量200kd的, SDS-PAGE電泳的分離膠濃度多大合 適？積層膠的濃度又該用多少？這么大分子量的蛋白容易作Western Blot嗎？答：200kd的蛋白不好做，分離膠用7%,積層膠3.5%。22、如果上樣量超載，要用什么方法來增

8、加上樣量？答：可以濃縮樣品，也可以根據(jù)你的目標(biāo) 分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般 地，超載30%是不會有問題的。如果已 經(jīng)超了不少了，而且小分子量的也要，可以考慮加大膠的厚度，可以試試 1.5mm的。23、蛋白變性后可以存放多久？答：一0C，兩年沒有問題。最關(guān)鍵兩條：不要被蛋白酶水解掉；不要被細(xì)菌消化掉（也是被酶水解了）。24、我所測定的蛋白分子量是105KD ,按理說分離膠應(yīng)當(dāng)采用7.5%，但資料卻要求分離膠和濃縮膠均采用11 %的配方，不知為何？答：上述提到的兩種凝膠均可以使用，因 為105KD的蛋白在上述兩種膠的線性分 辨范圍內(nèi)，但需注意條帶位置。25、二抗是生物素化的抗體，三抗是親和

9、 素生物素體系，不知采用這樣的方案后，封閉液是否要作調(diào)整，能否再用 5%的脫 脂奶粉呢？好像有資料說脫脂奶粉會影響親和素生物素的生成，是嗎？解答：不能使用脫脂奶粉，因為脫脂奶粉 中含生物素，用BSA代替應(yīng)該好一點.26、問一般一次上樣的蛋白總量是多少， 跟目的蛋白的表達(dá)量有關(guān)系嗎？答：Western Blot 般上樣 30- 100 微克 不等，結(jié)果跟目的蛋白的豐度、上樣量、 一二抗的量和孵育時間都有關(guān)系，也與顯 色時間長短有關(guān)。開始摸條件時，為了拿 到陽性結(jié)果，各個步驟都可以量多一點時 間長一點，當(dāng)然背景也就出來了。要拿到 好的結(jié)果，如果抗體好的話比較容易，抗 體不好的話就需要反復(fù)地試了，當(dāng)

10、然有的 不適合Western Blot的怎樣做也不行。27、做組織樣品的western的時候，怎樣 處理樣品？答：必須進(jìn)行研磨、勻漿、超聲處理，蛋 白質(zhì)溶解度會更好，離心要充分，膜蛋白 需用更劇 烈的方法抽提，低豐度膜蛋白 可能還要分步抽提（超速離心）。還有一點 就是組織中的蛋白酶活性更強，需要注意 抑制蛋白酶的活性（加入PMSF）。28、問大分子量蛋白200KD，在做western要注意什么呢?答：做200kd蛋白的 Western Blot時要注意，分離膠最好選擇7%的；剝膠時要小心；轉(zhuǎn)移時間需要相應(yīng)延長；要做分子量參照（否則出現(xiàn)雜帶不知道如何分析）。29、有什么方法可以提高上樣量?答：a

11、）可以濃縮樣品；增大上樣體積來增 大上樣量；b）用5倍的上樣緩沖液來稀釋30、蛋白的上樣量有沒有什么具體的要求？答：上樣量要根據(jù)實驗的要求來定，如果要求是定量和半定量的 Western Blot則上樣量要均等，如果只是要定性，則沒有太大的關(guān)系，盡量多上就行了，但是不要超載31、一抗，二抗的比例是否重要？答：比較重要，調(diào)整好一抗，二抗的比例，可以去掉部分非特異的本底。32、要做磷酸化某因子 Western Blot，其二抗有何要求？答：對二抗無要求，要看你實驗條件來選 擇，一般推薦用HRP標(biāo)記的二抗。33、免疫組化和Western Blot可以用同一種抗體嗎？答：免疫組化時抗體識別的是未經(jīng)變性處

12、 理的抗原決定簇（又稱表位），有些表位 是線性的，而有的屬于構(gòu)象型；線性表位 不受蛋白變性的影響，天然蛋白和煮后的 蛋白都含有；構(gòu)象型表位由于受蛋白空間 結(jié)構(gòu)限制，煮后變性會消失。如果你所用 的抗體識別的是蛋白上連續(xù)的幾個氨基 酸，也就是線性表位，那么這種抗體可同 時用于免疫組化和Western，而如果抗體 識別構(gòu)象形表位，則只能用于免疫組化。34、Western Blot中抗體的可以重復(fù)應(yīng)用嗎？答：抗體工作溶液一般不主張儲存反復(fù)使 用，但是如抗體比較珍貴，可反復(fù)使用 2 -3次。稀釋后應(yīng)在2-3天內(nèi)使用，4度 保存，避免反復(fù)凍融。35、在做 Western Blot 時，PVDF 膜用甲醇浸

13、泡的目的？答：PVDF膜用甲醇泡的目的是為了活化 PVDF膜上面的正電基團，使它更容易跟 帶負(fù)電的蛋白質(zhì)結(jié)合，做小分子的蛋白轉(zhuǎn) 移時多加甲醇也是這個目的。36、檢測同一抗體的磷酸化和非磷酸化的抗原可以在同一張膜上嗎？答：可以。37、轉(zhuǎn)膜后經(jīng)麗春紅染色的條帶，為什么 大蛋白分子的一端的轉(zhuǎn)膜好象不是很好， 為什么？答：這是正常的，大分子的蛋白轉(zhuǎn)移的慢，你延長轉(zhuǎn)移時間和電流，大分子一端就會好的多，但是小分子的就有可能會變淡。38、做Western Blot時，同樣的抗體免疫組化能做出，而 Western Blot卻不能?答：這多半是抗體的問題，要看抗體的說 明，是否能做Western Blot和免疫

14、組 化。39、如果是6 >8轉(zhuǎn)印膜，要加多少一抗？答：一抗的稀釋度是有說明的，根據(jù)你的 一抗看看就知道了，但是那么大的膜孵育體積一般最少為3 5ml。40、上下槽緩沖液有何要求，怎樣才能達(dá)到最佳效果。答：無特殊要求。但我們一般是上槽放新 鮮的緩沖液，下槽可以是重復(fù)使用過一兩 次的緩沖液41、跑電泳的時候配的膠總是 縮”是什么原因呢？是有的成分不對嗎？答：沒什么問題，就是你膠里的水分被蒸 發(fā)了。過夜時拿保鮮膜包起來，在里面加 點水保持濕度就可以了；也可能母液（30%聚丙酰胺）有問題，你可以重新配制一份觀察；能夠替換的試劑，盡量換一下，選用好的試劑。42、蛋白質(zhì)的分子量跨度很大，如要分離小2

15、1KD，中至66KD，大至170KD，可 以一次做好嗎？答：這么廣的分布不好轉(zhuǎn)移，一般建議：21kd 和 66kd 可以一起轉(zhuǎn)，12%SDS-PAGE，濕轉(zhuǎn) 120mA，45-60min 就可以 了，可以根據(jù)你實驗室的經(jīng)驗調(diào)節(jié)； 170kd 用 7%SDS - PAGE，200mA 90- 120min。43、不能很好地將大分子量蛋白轉(zhuǎn)移到膜上,轉(zhuǎn)移效率低怎么樣解決？答：可以考慮：轉(zhuǎn)移緩沖液中加入 20% 甲醇（是指終濃度），因為甲醇可降低蛋 白質(zhì)洗脫效率，但可增加蛋白質(zhì)和 NC膜的結(jié)合能力，甲醇可以防止凝膠變形，甲 醇對高分子量蛋白質(zhì)可延長轉(zhuǎn)移時間；轉(zhuǎn) 移緩沖液加入終濃度0.1%SDS，也是

16、為 了增加轉(zhuǎn)移效率；用優(yōu)質(zhì)的轉(zhuǎn)移膜，或使 用小孔徑的NC膜（0.2微米）.44、我用的是可視marker，但是電泳總跑不全條帶，請問什么原因？怎樣改善？膠用過8%, 10%,12%,都是這樣。marker是新買的答：一般來說，是小分子量 Marker跑走 了，增加膠濃度或減少電泳時間試試看。當(dāng)然梯度膠也是不錯的選擇。45、是否 Western Blot實驗半定量一定要加ACTIN內(nèi)參？答：對于發(fā)表文章的實驗最好加內(nèi)參，實 驗嚴(yán)謹(jǐn)。46、核內(nèi)抗原 Western Blot內(nèi)參選擇什么合適？答：可以選用組蛋白，組蛋白在細(xì)胞核中 的表達(dá)是很穩(wěn)定的，有很多都可以當(dāng)成內(nèi) 參，在網(wǎng)上查查就可以選出你要的內(nèi)

17、參。47、做半定量 Western Blot，內(nèi)參 禺a(chǎn)ctin , GAPDH 哪個好？答：選用beta-actin就可以48、想問一下細(xì)胞裂解液選擇蛋白酶抑制劑時有什么原則嗎？受不受組織來源的影響？胞膜和胞漿有區(qū)別嗎？答：一般來說提取時加入廣譜的蛋白酶抑制劑就可以了，操作時保持低溫。除非有文獻(xiàn)特別指明用特殊的方法，一般來說都沒有區(qū)別。49、轉(zhuǎn)膜后的脫脂奶粉封閉液是5%的TBST脫脂奶粉”其中TBST最后那個T是Tween嗎，濃度多大？答：是 Tween，配方如下：Tris-BufferedSali ne Twee n-20 (TBST), NaCIg，Tris base : 2.42g 加水00ml溶解,加500-1000ul 的 Tween-20,用 HCI 調(diào)節(jié) pH至7.4，加水定容至1L.50、封閉，一抗，二抗時的溫度有沒有什 么規(guī)定呢，比如在室溫里做，或者要在 4 度下？ 答：均可在室溫進(jìn)行，如果時間不夠，一 抗孵育可以先在室溫進(jìn)行一個小時，然后 4度過夜。51、請問一下PVDF膜和硝酸膜結(jié)合蛋白的原理是什么？答：一般而言，硝酸纖維素膜是通過疏水 作用來和蛋白質(zhì)相聯(lián)，這樣的話，反復(fù)洗 幾次后，蛋白容易掉下來，結(jié)果較差。PVDF膜主要通過它膜上的正電荷和蛋白 接合，同時也有疏水作用，但相對較弱。 這樣的話，PVDF膜和蛋白接合較牢，不 易脫落，結(jié)果較好。52