AD自噬改動標紅

1、二苯乙烯苷通過抑制的 Beclin-1、LC3-H表達改善APP695V717I轉基因鼠的行為學障礙羅紅波,石向群, 郭建魁,張志強 , 汪泳,李蕓,尹榕（蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院神經內科 , 甘肅省 蘭州市 730050）【摘要】目的 探討在APP695V717I轉基因鼠模型中，二苯乙烯苷（TSG）對大鼠行為學的保護作用及其對自噬分子 Beclin-1、LC3- U的表達影響。方法 選取10月齡APP695V717I 轉基因小鼠40只，隨機數字表法分為藥物組組、模型組，各20只,藥物組給予TSG灌胃1 個月,同背景同月齡C57BL/6J小鼠為正常對照組。行為學檢測應用 Morris水迷宮實驗和丫

2、電迷宮實驗。反轉錄聚合酶鏈反應及免疫印跡法檢測海馬神經元自噬相關蛋白 Beclin-1 和 LC3- U的mRNA及蛋白表達變化。結果 在模型組中，大鼠丫電迷宮躲避所需的電刺激次 數增加， Morris 水迷宮測試中潛伏期延長 , 游泳路程增加及穿越平臺次數減少； Beclin-1 和 LC3- U的mRNA及蛋白的表達增高，與對照組比較有統(tǒng)計學意義 （P<0.05）; TSG藥物干預 后，大鼠躲避所需的電刺激次數減少，潛伏期縮短 , 游泳路程縮短，穿越平臺次數增加； Beclin-1和LC3- U的mRNA及蛋白的表達較模型組下降（P<0.05）,差異有統(tǒng)計學意義。結論 二苯乙烯

3、苷可通過下調自嗜通路中Beclin-1和LC3- U的表達，以抵抗 A B的神經毒性作用對內質網功能的損害，從而改善大鼠的學習記憶、空間定向等行為學表現?！娟P鍵詞】 A PP轉基因小鼠；自噬；二苯乙烯苷；行為學阿爾茨海默?。ˋlzheimer' s disease AD）是一種神經系統(tǒng)變性疾病，其主要的病理學特 征之一是腦組織中出現大量老年斑 。老年斑主要由B -淀粉樣蛋白（B -amyloid，A B ）形成, A B是通過淀粉樣樣前體蛋白（APP）的異常剪切、折疊后所形成，在細胞內，對這種異常 折疊的蛋白質，細胞可通過泛素蛋白酶體途徑（ubiquitin-proteasome pa

4、thway, UPP）和自噬溶酶體途徑來調控蛋白、細胞器的降解，從而保證蛋白質的正常工作，維持細胞功能的正常運 行。有學者早期研究發(fā)現 AD 患者在病理上表現為大量囊泡的堆積， 但這種表現的機制及其 在 AD 發(fā)病機制中的作用卻沒有得到明確的闡述； 2006年，有學者建立自噬途徑的重要蛋 白 Apg5/Apg7 基因敲除的大鼠模型，發(fā)現該模型表現出神經變性疾病的一些表型，使得自 噬途徑在神經變性疾病得到了關注和重視 2-3。本實驗采用 APP695V717I 轉基因 AD 動物 模型觀察大鼠海馬神經元自噬相關蛋白Beclin-1和LC3- U的表達情況并探討其意義。AD患者的學習記憶及工作能力

5、的逐漸喪失給家庭及社會帶來沉重的負擔，但目前其治 療尚無十分有效方法與藥物 。研究顯示何首烏的主要有效成分之一（ 2， 3， 5， 4-四羥基二 苯乙烯-2-0- B -D葡萄糖苷（2，3，5，4-tetrahydroxy-stilbene-2-glycoside,二苯乙烯苷，TSG） 能減少B -淀粉樣肽誘導的老年斑沉積，改善癡呆模型大鼠學習記憶能力，降低淀粉樣前體 蛋白（APP）的表達水平。我們通過觀察APP695V717I轉基因鼠的行為學表現及自噬相關蛋白 Beclin-1、LC3- U在海馬的表達情況并探討其意義，進一步揭示AD新的發(fā)病機制，以及何首烏提取物二苯乙烯苷治療AD的主要作用

6、機制及藥物靶點。材料和方法一、材料1. 實驗動物分組及干預 ：10 月齡 APP695V717I 轉基因小鼠 40 只，雌雄各半 （許可證號 01-3001），及20只年齡匹配的同背景 C57BL/6J小鼠，雌雄各半（作為正常對照），均購自中 國醫(yī)學科學院實驗動物研究中心。轉基因小鼠隨機數字表法分為 TSG組、模型組，各20只。 藥物組給予 TSG 灌胃 1 個月，每天 1 次，灌胃量按 5 ml/kg 計算。正常對照組給予生理鹽 水灌胃。2. 主要試劑和藥物：Beclin-1和LC3- U抗購于Stressge公司；引物自行設計，由上海華大基 因有限公司合成；Trizol、Taq酶、逆轉錄酶

7、購自MBI公司。二苯乙烯苷為從何首烏中提取分 離的干粉，含量為68% (湖南中醫(yī)藥研究所提供)，實驗時用水溶解為100 mg/kg的濃縮液。二、方法刪掉“大鼠模型的建立、取材及干預”1.行為學檢測：(1)Y電迷宮電擊實驗：電擊次數表示其學習記憶的獲得能力，記錄每只大鼠 學會逃避電刺激次數，以30次為最大值計數。(2)Morris水迷宮定位航行實驗(PNT ):每天 08 :00-11:00之間對每只大鼠進行訓練,不選平臺所在象限作為入水點,按順時針方向把大鼠 面向池壁放入水中，檢測大鼠隱匿平臺潛伏期。如果在規(guī)定的最長時間 120s內未到達平臺， 則由實驗者將其引至平臺,逃避潛伏期記為120s,

8、大鼠在平臺休息20s后進行下一次測試。觀 察并記錄動物找到并爬上平臺的潛伏期、游泳路程及游泳軌跡。3d訓練結束后將大鼠按組別進行造模。于制模后21 d進行PNT0( 3)Morris水迷宮空間探索試驗(SPT):各組大鼠最 后一次PNT后撤除平臺，將大鼠從最后1次入水點面向池壁放入水中，使大鼠在水迷宮中連 續(xù)游泳，記錄大鼠120 s內穿越原平臺平面的次數。2 超微結構檢測：分離海馬組織后，磷酸鹽緩沖夜(PBS)洗滌2次，4%戊二醛固定，冷 卻后切塊，2%鋨酸固定，梯度丙酮脫水，浸泡，包埋，醋酸雙氧鈾 -檸檬酸鉛雙重染色，透 射電鏡觀察。3. 逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)測mRNA表達：依

9、據Medline基因文庫自行設計引物，目 的基因 Beclin-1 (162 bp),上游弓I物：5' CCCTACAGGATGGATGTGGAGAAAG-3 '，下游弓I 物: 5' ATTGTGAGGACACCCAAGCAAGACC-3 ' 目的基因 LC3- II (136 bp),上游弓I物： 5' ACCAAGCCTTCTTCCTCC-3 ' 下游弓I物：5' TGTCCCGAATGTCTCCTG3-3 內參照 B -actin( 100 bp)，上游引物：5'-CGTTGACATCCGTAAAGACCTCTA-3下游引

10、物：5'TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3 '。產物經瓊脂糖凝膠電泳，于紫外投射燈下觀察 結果并拍照。4免疫印跡法(Western blot)測蛋白表達：密度梯度離心法提取蛋白，將海馬組織轉移到勻 漿器中，加裂解液勻漿，離心10 min (2400 r/min,半徑13.5cm),取上清，繼續(xù)離心15 min(轉速 12000 r/min,半徑 13.5cm),取上清，再離心 30 min (15 000 r/min,半徑 13.5cm),加 入裂解液和蛋白酶抑制劑，用二奎琳甲酸(BCA)蛋白測定試劑盒測定蛋白質濃度；樣品與 等體積的上樣緩沖液混勻，煮沸變性

11、，用 10%十二烷基硫酸鈉聚-丙烯酰胺凝膠電泳(SDS- PAGE)分離，轉移蛋白至硝酸纖維素膜，5 %脫脂奶粉封閉，與一抗孵育，加入辣根過氧化 物酶標記二抗孵育，ECL試劑盒進行化學發(fā)光檢測，JS-300凝膠圖像儀掃描分析處理。三、統(tǒng)計學方法數據用SPSS12.0軟件處理。計量資料用x s表示，兩組間比較用t檢驗，多組獨立樣 本比較用方差分析。結果刪掉“模型組大鼠腦組織切片染色結果”一、丫電迷宮檢測與對照組比較，模型組躲避電刺激數明顯增加(t =10.0884, P < 0.01),藥物組躲避電刺激數增加(t =2.7781, P < 0.05),差異有統(tǒng)計學意義；與模型組比較，

12、經 TSG干預，藥 物組學會躲避所需的電刺激顯著減少(t =11.1755, P < 0.01),差異有統(tǒng)計學意義(表1)o二、Morris水迷宮檢測與對照組相比，模型組和藥物組小鼠的 Morris水迷宮測試游泳潛伏期(t =14.4648, P < 0.01)及路程均增加(t =5.6550, P < 0.01),穿越平臺次數下降明顯(t =15.5895, P < 0.01), 差別隨時間的延長而加大；與模型組比較，藥物組的潛伏期縮短(t =5.5023, P < 0.01),游泳路程縮短(t =2.2341, P < 0.05)，穿越平臺次數增加(t

13、=4.8163, P < 0.01),差異具有統(tǒng)計學意義。見表1表1大鼠水迷宮行為學比較比較（xs）組別n潛伏期測試（秒）路程測試（米）穿越平臺測試（次）對照組2017.03 ± 1.233.96 ± 1.0518.13 ±4.15模型組2032.15 ± 4.51 a8.30 ± 3.02 a3.09 ± 1.18 a藥物組2025.26 ± 3.76 a b6.08 ± 3.26 a c4.82 ± 1.09 a c注：與對照組比較：a Pv 0.05;與模型組比較：cP V 0.05三、大鼠海

14、馬CA1區(qū)電鏡下自噬現象對照組：神經細胞胞膜完整，胞漿基質電子密度均勻，胞漿內線粒體結構清晰可見，細胞質 內線粒體及粗面內質網豐富，結構大致正常，線粒體嵴清楚、完整，核圓、核膜完整清晰， 高爾基體無改變。模型組：胞漿內線粒體結構欠清楚，嵴消失，少數呈空泡樣變，粗面內質網結構欠清晰，部 分擴張，核膜較模糊不清，高爾基體大致正常，見圖 2;胞內可見大量自嗜泡形成，見圖3 藥物組：胞漿內線粒體結構尚清楚，少數可見嵴消失，空泡樣變很少見，粗面內質網結構尚 清晰，少數見輕度擴張，偶見個別胞漿水腫，核膜尚完整，高爾基體正常，見圖4。圖2電鏡X 6000倍圖3電鏡X 6000 倍圖4電鏡X 6000倍四、自

15、噬相關蛋白 Beclin-1、LC3- U的mRNA及蛋白表達如圖5/6/7所示，將RT-PCR產物經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳并采用蛋白質印跡方法分析， 可見模型組的Beclin-1、LC3- n mRNA與其蛋白的表達趨勢一致，與對照組比較，差異有統(tǒng) 計學意義（P=0.00<0.05）; TSG組在Beclin-1、LC3- n蛋白表達明顯降低，與模型組比較有顯 著性差異（P=0.00<0.05）;假手術組與對照組比較無顯著性差異（P=0.2041>0.05）,排除手術因 素干擾。見圖&表2大鼠Beclin-1、LC3- n的mRNA及蛋白相對表達（X s,%）組別

16、例數mRNA的相對表達蛋白的相對表達（%）Becli n-1LC3- nBecli n-1LC3- n對照組200.25 ± 0.010.23 ± 0.030.20 ± 0.01 0.26± 0.02模型組20a0.58 ± 0.01a0.42 ± 0.01a0.63 ± 0.01a0.52 ± 0.01藥物組20,a b0.41 ± 0.02,ab0.34 ± 0.01,ab0.49 ± 0.02,a b0.36 ± 0.02ab注：與對照組比較：PV 0.05;與模型組比

17、較：Pv 0.05;ABCDABCD圖 5: Beclin-1/ B -actin 的 mRNA 表達圖6: LC3- n / B -actin 的 mRNA 表達A:對照組B:藥物組C:模型組A:對照組B:藥物組 C:模型組圖 7: Beclin-1、LC3- n / B -actin 的蛋白表達A:對照組B:藥物組C:模型組老年斑是阿爾茨海默病(Alzheimer ',AD)的主要組織病理變化，而B -淀粉樣肽(B -amyloid, A B)是老年斑的主要成分，因此，A B的神經毒性是AD形成和發(fā)展的關鍵因素。A B由3943個氨基酸組成，來源于淀粉樣前體蛋白(Amyloid p

18、recursor protein,APP),如果 各種危險因素導致APP的異常剪切，A B的空間構象發(fā)生改變，就會導致 A B異常聚集而產 生神經毒性作用4。正常情況下A B的空間二級結構以a螺旋為主，聚集性較弱，可被蛋白 酶水解；如果A B構象發(fā)生錯誤折疊，轉變?yōu)锽折疊時，聚集性較弱，不易被蛋白酶水解， 進而形成組織沉淀并誘導神經元凋亡。因此，在分子水平上，AD勺疾病本質是一種神經變性構象病，一種蛋白錯誤折疊并聚集的“蛋白構象病”。蛋白構象病的相同點是異常蛋白在 細胞內蓄積，而這些蛋白主要是依賴自噬途徑被降解，提示自噬障礙可能參與了神經退行性疾病的發(fā)病。自噬溶酶體途徑可能通過清除細胞內產生的

19、細胞毒性物質、失活的細胞器，再 循環(huán)利用細胞中的氨基酸、核普酸等成分，減少對細胞的損害，從而有利于挽救瀕臨死亡的 細胞。LC3和Beclin-1是參與自噬體形成的特異性的重要基因5。LC3- n定位于前自噬體和自噬 體，使之成為自噬體的標志分子。 一旦自噬體與溶酶體融合，自噬體內的LC3- n即被溶酶體 中的水解酶降解。LC3- n含量的多少與自噬泡數量的多少成正比，可通過檢測細胞內LC3-n的含量變化，來判斷細胞狀態(tài)，判斷其自噬是被誘導還是被抑制。而Becli n-1還是參與自噬調控的重要基因，它可以通過提高細胞自噬來抑制腫瘤的生長，是候選的腫瘤抑制基因，其不僅與自噬調控通路有關，而且涉及細

20、胞凋亡的調控，可能同時參與兩種程序性細胞死亡 過程。因此，本研究用LC3- n和Beclin-1作為細胞發(fā)生自吞噬的標志分子。在實驗中，Western® RT-PCR的結果顯示，轉基因小鼠的模型組海馬部位 LC3、Beclin-1 的mRNA及蛋白表達均明顯增高，說明APP轉基因小鼠產生的A B啟動自噬通路；推測A B在 形成纖維化的過程中產生的神經毒性可導致內質網功能障礙，細胞通過內質網自穩(wěn)系統(tǒng)的調節(jié)，促進細胞內自噬來平衡應激狀態(tài)。也有觀點認為自噬溶酶體途徑是產生毒性 A B的一個重要過程。在體內和體外試驗中， Yu等和LeBlanc等9發(fā)現在自噬體內存在 A B,其前體B CTF

21、、APP及丫分泌酶。用 rapamycin或去血清等方法來增強自噬功能后，丫分泌酶能從內質網中轉移至自噬體中，而A B的產生也大大增加。Haass等10研究發(fā)現細胞內A B對細胞的損傷遠遠大于細胞外 A B 的作用。此外，通過自噬溶酶體途徑產生的 A B,可以通過溶酶體降解，也可以被分泌到細 胞外形成不可溶的異常聚集體。這些提示自噬溶酶體途徑障礙可能導致毒性A B的產生增多，導致神經元的損傷和細胞外老年斑的形成。在前期的實驗中我們發(fā)現 A B誘發(fā)的內質網應激及相關的凋亡通路參與A B神經毒性對腦的神經元損傷機理11。而目前的研究也發(fā)現內質網應激時 PERK信號通路促使某些蛋白 質如多聚谷氨酰胺

22、 polyQ72 在內質網中大量堆積，抑制內質網相關降解系統(tǒng)；同時磷酸化 elF2a,上調 Atg12(autophagy protein12形成 Atg5-Atg12-Atg16 復合物，引起 LC3 蛋白質的 膜轉位誘發(fā)自噬12。結合本實驗結果并回顧文獻，我們認為在 AD的發(fā)病中，當A B被細胞 分泌至細胞外，形成纖維化的過程中，所表現的神經毒性開始起作用，AB可破壞細胞膜誘發(fā)氧化應激， 氧化應激又會破壞內質網功能， 引起的內質網應激在短時間內通過啟動未折疊 蛋白保護通路如 PERK 等來保護對大腦造成的損傷， 同時內質網的應激也使細胞內產生的蛋 白在內質網中錯誤折疊的幾率增加， 導致了錯

23、誤蛋白的異常剪切和積聚， 這些異常剪切的蛋 白可啟動細胞的 LC3、Beclin-1 自噬通路，但當自噬無法降解過多的蛋白質時，這部分細胞 可能因為這種過度的應激導致通過特異性的內質網Caspase12凋亡途徑發(fā)生死亡。因此可見，分泌至細胞外的A B可誘導細胞內產生更多的異常剪切和積聚的蛋白，這些錯誤折疊的蛋白即可誘發(fā)內質網介導的凋亡， 也可以通過自噬途徑使細胞程序性死亡， 出現 AD 的病理學改 變及進行性加重的行為學障礙。對中藥何首烏的相關研究表明， 何首烏能改善 AD 模型大鼠學習記憶能力， 對膽堿能神 經投射纖維有保護作用，可提高乙酰膽堿酯酶活性，可通過調節(jié)凋亡相關基因 Bax /Bc

24、l-2 通 路抑制細胞凋亡 13-16。因此，對何首烏的主要有效成分二苯乙烯苷進行研究，進一步揭示其 治療 AD 的主要作用機理及藥物靶點。在Morris水迷宮實驗中，PNT主要考察大鼠的空間分辨學習能力，SPT主要測量大鼠的 工作記憶能力，通過本實驗可以看出，在A B毒性作用下，轉基因鼠的學習記憶、空間定向、 工作記憶能力明顯下降 , 表現為 Y 電迷宮躲避所需的電刺激次數增加， Morris 水迷宮測試 中潛伏期延長，游泳路程增加及穿越平臺次數減少；從時間上來看，這種損害隨著A B暴露時間的延長而加重，說明AB對小鼠的學習記憶、空間記憶及工作記憶的損害呈逐漸增強的 累加效應；經 TSG 干

25、預后，小鼠躲潛伏期縮短 , 游泳路程縮短，穿越平臺次數增加，說明 TSG 可改善模型小鼠學習記憶、空間定向、工作學習能力，具有腦保護作用。Western 和RT-PCR的結果顯示，藥物組經TSG干預后，海馬部位LC3、Beclin-1的mRNA及蛋白表達 均降低。有研究提示TSG可以下調APP的表達，我們的前期實驗證實TSG可以緩解內質網應激 程度，減少內質網應激分子伴侶 GRP78的表達和Caspase12誘導的凋亡11。因此，中藥何 首烏提取物 TSG 可以明顯改善 AD 鼠的學習記憶、空間定向等行為學功能，其作用機制可 能通過抑制淀粉樣前體蛋白的表達， 減輕A B的神經毒性對內質網功能的

26、損害， 緩解內質網 應激程度，從而使自嗜通路中 Beclin-1、LC3- U的表達下調，細胞的自嗜和凋亡等減少，從 而起到改善 AD 鼠行為學障礙的腦保護作用。參考文獻1 Querfurth HW,LaFerla FM.Alzheimer's disease.N Engl J Med.2010; 362(4):329-344.2 Komatsu M,Waguri S,Chiba T,et al.Loss of autophagy in the central nervous system causes neurodegeneration in mice.Nature,2006,441

27、:880-8843 Hara T,Nakamura K,Matsui M,et al.Suppression of basal autophagy in neural cell scausesn eurodege nerative disease in mice.Nature,2006;441:885-8894 Tomiyama T.lnvolvement of beta-amyloid in the etiology of Alzheimer's disease.Brain Nerve, 2010, 62(7) :691-6995 Vellai T.Autophagy genes a

28、nd agi ng.Cell Death Differ, 2009,16:94-102.6 Hua ng J, Klio nsky DJ. Autophagy and human disease. Cell Cycle, 2007,6(15):1837-18497 Aita VM,Lia ng XH,Murty VV,et a1.Clo ning and geno mic orga ni zati on of becli n 1,a can didate tumor suppressor gene on chromosome 17q21.Genomics,1999,59(1):59-65 .8 Yu WH,Kumar A,Peterhoff C,et al.Autophagic vacuoles are enriched inamyloidprecursorprotein-secret aseactivities:implications for beta-amyloid peptide over-production and localization in Alz