抗生素微生物檢定方法學(xué)驗(yàn)證中的常見問題分析

1、發(fā)布日期 20070423 欄目 化藥藥物評(píng)價(jià)>>化藥質(zhì)量控制 標(biāo)題 抗生素微生物檢定方法學(xué)驗(yàn)證中的常見問題分析 作者 審評(píng)三部 部門 正文內(nèi)容 審評(píng)三部審評(píng)五室劉英摘要： 本文對(duì)抗生素微生物檢定法中的管碟法在方法學(xué)驗(yàn)證中的常見問題如線性與范圍中溶液濃度與直徑的關(guān)系、精密度的測(cè)定方法等進(jìn)行了分析，歸納其錯(cuò)誤的問題，給出了正確的操作方法。關(guān)鍵詞：  抗生素微生物檢定法多組分抗生素方法學(xué)驗(yàn)證抗生素微生物檢定法是國(guó)際上通用的、經(jīng)典的抗生素測(cè)定方法。自20世紀(jì)40年代建立至今，在各國(guó)藥典中被普遍采用。雖然伴隨著HPLC等化學(xué)分析技術(shù)的發(fā)展，一些抗生素品種的效價(jià)已被化學(xué)分析法所取代

2、，但由于微生物檢定法可直觀、特異地反映出抗生素品種的抗菌活性；多組分抗生素由于結(jié)構(gòu)與不同活性組分生物活性的差異，化學(xué)測(cè)定結(jié)果難以準(zhǔn)確表征組分組成、含量和生物活性間的關(guān)系；許多抗生素品種由于各種原因如無特征紫外吸收等，目前沒有適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)分析方法表征其活性，故抗生素微生物檢定法目前在各國(guó)藥典中仍占有重要的地位，且短期內(nèi)化學(xué)分析法不可能完全取代微生物檢定法。中國(guó)藥典2005年版仍采用抗生素微生物檢定法中的管碟法測(cè)定其效價(jià)，目前申報(bào)已有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的該類制劑較多，在質(zhì)量研究中存在諸多問題，現(xiàn)就常見的問題加以分析，希望對(duì)注冊(cè)申請(qǐng)人有所幫助。一、方法的建立1、 供試品與標(biāo)準(zhǔn)品的同質(zhì)性 抗生素微生物檢定法的原理

3、以供試品與標(biāo)準(zhǔn)品同質(zhì)為前提，方法建立前，首先應(yīng)確定供試品與標(biāo)準(zhǔn)品是否同質(zhì)，包括化學(xué)結(jié)構(gòu)、所含組分及組分比例的一致性，對(duì)于制劑還要考慮輔料的影響是否造成供試品與標(biāo)準(zhǔn)品不同質(zhì)。2、培養(yǎng)基、試驗(yàn)菌、緩沖液和培養(yǎng)條件的選擇可參照中國(guó)藥典建立，在此不再贅述。3、檢定方法的確定 可采用一劑量法（標(biāo)準(zhǔn)曲線法）、二劑量法及三劑量法等。一般確定線性與范圍采用一劑量法（標(biāo)準(zhǔn)曲線法），常規(guī)含量測(cè)定采用二劑量法，標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)定采用三劑量法。               &#

4、160;                          4、抗生素溶液的穩(wěn)定性選定的品種可參照中國(guó)藥典現(xiàn)行版附錄抗生素微生物檢定法的品種，若溶劑和緩沖液與其不同，應(yīng)考察抗生素儲(chǔ)備溶液和測(cè)定溶液在室溫、40和不同pH值緩沖液中，以及放置不同時(shí)間的穩(wěn)定性，以確定抗生素儲(chǔ)備溶液和測(cè)定溶液的存放時(shí)間和條件。    

5、;                                                  

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14、;         二、方法的驗(yàn)證驗(yàn)證的目的是證明采用的方法適合于檢測(cè)的要求。驗(yàn)證內(nèi)容有：準(zhǔn)確度、精密度（包括重復(fù)性、中間精密度）、專屬性、適用性和線性。在申報(bào)資料中常見的錯(cuò)誤有：線性測(cè)定不符合抗生素微生物檢定法一劑量中心濃度等比測(cè)定的原理；精密度的測(cè)定方法不正確；無專屬性試驗(yàn)。下面就方法驗(yàn)證的內(nèi)容與常見的錯(cuò)誤加以簡(jiǎn)述。1、專屬性 考察雜質(zhì)、輔料等對(duì)測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確性的影響，可通過以下試驗(yàn)驗(yàn)證：(1) 用輔料等替代抗生素進(jìn)行試驗(yàn)，應(yīng)不產(chǎn)生抑菌作用。(2) 采用回收率試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，至少有9對(duì)以上數(shù)據(jù)，并進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。2

15、、線性 線性系指在設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)，測(cè)試結(jié)果與試樣中被測(cè)物濃度直接呈正比關(guān)系的程度。做抗生素微生物檢定法試驗(yàn)時(shí)，被測(cè)物濃度應(yīng)轉(zhuǎn)換為對(duì)數(shù)濃度。管碟法中抗生素溶液濃度的對(duì)數(shù)值與抑菌圈直徑或面積之間的關(guān)系在一定的濃度范圍內(nèi)，應(yīng)呈線性關(guān)系。用一劑量法測(cè)定。  、測(cè)定方法 (1)確定直線中心點(diǎn)的抗生素濃度。中心點(diǎn)濃度C 0應(yīng)使所致抑菌圈的直徑在1618mm。(2) 線性測(cè)定的劑距一般用等比級(jí)數(shù)，可選用1:0.80、1:0.85或1:0.88等，稀釋成適當(dāng)?shù)臐舛认盗小?3)每個(gè)濃度為一組，至少設(shè)8組，一般每組35個(gè)雙碟，每組雙碟數(shù)m應(yīng)相等。(4)管碟法的線性考察，其直線的最低濃度端與最高濃度端的確定

16、，應(yīng)選擇比所致抑菌圈直徑在1822mm高的濃度為最高濃度，即高濃度應(yīng)涵蓋能致抑菌圈直徑在1822mm的濃度。按中心濃度等比的關(guān)系，求算最低濃度。但最低濃度端應(yīng)涵蓋含量（效價(jià)）測(cè)定時(shí)高、低劑量之比為4：1的低劑量濃度。(5)取制備好底層及菌層培養(yǎng)基的雙碟，每35個(gè)雙碟為一組，共分n組(6)各組滴加完畢后，將雙碟在規(guī)定溫度下培養(yǎng)一定時(shí)間，測(cè)定各抑菌圈直徑。(7)以各組濃度C的對(duì)數(shù)值log與相對(duì)應(yīng)各濃度的直徑與中心點(diǎn)濃度直徑的差值作線性分析，得回歸方程及相關(guān)系數(shù)r，并對(duì)相關(guān)系數(shù)作顯著性檢驗(yàn)，同時(shí)繪制線性圖。、常見錯(cuò)誤（1）直接以濃度與直徑作線性關(guān)系圖。（2）雖然以抗生素溶液濃度的對(duì)數(shù)值與抑菌圈直徑作

17、線性關(guān)系圖，但不是等比系列，如濃度設(shè)計(jì)為：1、2、3、4、5、6、7u/ml等。以上兩種現(xiàn)象顯然違背抗生素微生物檢定法的原理，也不可能得出直線關(guān)系。（3）抑菌圈直徑太大或太?。捍笥?4mm或小于14mm均不正常。如：效價(jià)測(cè)定中高濃度溶液所制的抑菌圈直徑大于26mm時(shí)已超出雙碟的直徑范圍而無法測(cè)量，低濃度溶液所制的抑菌圈直徑小于14mm時(shí)，其濃度的對(duì)數(shù)劑量與直徑已不成線性，而在線性研究中結(jié)果為抑菌圈直徑在5mm35mm范圍內(nèi)與濃度的對(duì)數(shù)劑量線性關(guān)系良好，顯然上述數(shù)據(jù)是不符合實(shí)際情況的。（4）以濃度與效價(jià)建立線性關(guān)系。如：劑量濃度（u/ml）0.001    0.01

18、    0.0201    0.0251    0.0402    0.0502    0.1004該方法顯然不符合抗生素微生物檢定方法學(xué)中線性的含義，線性是指滴加抗生素溶液的濃度與所致抑菌圈直徑或面積的關(guān)系，若以濃度與效價(jià)建立線性關(guān)系，則是利用已建立好的方法去測(cè)定含量的高低，而非對(duì)方法本身進(jìn)行驗(yàn)證。況且由于高低劑量相差較大，低者僅為1u/ml，高者達(dá)50u/ml，也可能不在同一線性范圍。以上幾種結(jié)果均不是從真實(shí)試驗(yàn)得到，也無法進(jìn)行實(shí)際實(shí)驗(yàn)操作。3、準(zhǔn)確度（回收率） 準(zhǔn)確度系指用該方法測(cè)定的結(jié)果與真實(shí)值接近的程度，通常用回收率（）評(píng)價(jià)。準(zhǔn)確度驗(yàn)證，可根據(jù)具體試驗(yàn)情況選擇如下試驗(yàn)方法。回收率試驗(yàn)一般用至少9次測(cè)定結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)，按標(biāo)示量的80、100、120分別投入已知量的被測(cè)物，分別測(cè)定3次。標(biāo)示量的80、120的回收率可在線性范圍內(nèi)調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品的劑量，使其滿足抗生素微生物檢定法的要求。應(yīng)報(bào)告己知加入量的回收率或測(cè)定結(jié)果平均值與真實(shí)值或認(rèn)可參照值之差及其可信限。模擬回收率試驗(yàn)：按處方成分和比例，分別加入敷料和已知量的被測(cè)物，測(cè)定回收率。加樣回收率測(cè)定：如不能得到制劑的全部組分，可先