醫(yī)學(xué)專題—中國藥典薄層色譜的基本要求課件

1、醫(yī)學(xué)專題中國藥典薄層色譜的基本要求中國藥典薄層色譜(s p)的基本要求 周蘭貴州省食品藥品檢驗(yàn)所中藥(zhngyo)（民族藥）室 2014年5月第一頁，共四十四頁。醫(yī)學(xué)專題中國藥典薄層色譜的基本要求內(nèi)容(nirng)薄層色譜技術(shù)在中藥標(biāo)準(zhǔn)的優(yōu)勢中國藥典薄層色譜的基本要求薄層色譜應(yīng)用(yngyng)的影響因素第二頁，共四十四頁。醫(yī)學(xué)專題中國藥典薄層色譜的基本要求薄層色譜技術(shù)在中藥標(biāo)準(zhǔn)(biozhn)的優(yōu)勢薄層色譜法（中國藥典2010年版一部附錄 B），系將供試品溶液點(diǎn)于薄層板上，在展開容器內(nèi)用展開劑展開，使供試品所含成分(chng fn)分離，將所得色譜圖與對照物按同法所得的色譜圖比較，并可用薄

2、層掃描儀進(jìn)行掃描，用于鑒別、檢查或含量測定的方法。第三頁，共四十四頁。醫(yī)學(xué)專題中國藥典薄層色譜的基本要求薄層色譜技術(shù)在中藥(zhngyo)標(biāo)準(zhǔn)的優(yōu)勢薄層色譜獨(dú)有的特點(diǎn)是分析結(jié)果以直觀的彩色圖像表達(dá)，為其它(qt)色譜技術(shù)所不能。而圖像給出的多層面的信息是文字難以表達(dá)的，而且豐富多彩的圖像可以給分析者更多的思考判斷的空間。第四頁，共四十四頁。醫(yī)學(xué)專題中國藥典薄層色譜的基本要求提供直觀(zhgun)的彩色圖像是薄層色譜獨(dú)有的特點(diǎn)第五頁，共四十四頁。醫(yī)學(xué)專題中國藥典薄層色譜的基本要求離線操作(cozu)的靈活性各單元操作既有關(guān)聯(lián)，又相互獨(dú)立，點(diǎn)樣器材和方法、展開方式、顯色試劑選擇、直觀比較或掃描比較

3、可根據(jù)(gnj)需要靈活變通。根據(jù)(gnj)需要操作可以視實(shí)際需要和實(shí)驗(yàn)室條件分層次進(jìn)行和終止，節(jié)省分析時(shí)間和資源。由于是離線操作，所以個(gè)人占機(jī)時(shí)間短。第六頁，共四十四頁。醫(yī)學(xué)專題中國藥典薄層色譜的基本要求正相色譜流動(lidng)相（展開劑）的廣泛適用性薄層色譜最常用的是以硅膠板為基礎(chǔ)固定相的正相色譜，有多種組合(zh)的有機(jī)溶劑展開系統(tǒng)可供選擇；甲苯系統(tǒng)；三氯甲烷系統(tǒng)；己烷系統(tǒng)；正丁醇系統(tǒng)；乙酸乙酯系統(tǒng)等等。酸性、堿性、中性。高極性、中等極性、低極性。第七頁，共四十四頁。醫(yī)學(xué)專題中國藥典薄層色譜的基本要求色譜(s p)后衍生的專屬性色譜(s p)后靈活方便的衍生技術(shù)，同一色譜(s p)薄層

4、板可生成可見光譜、紫外光譜、熒光淬滅光譜或熒光光譜，給出豐富的檢測成分的化學(xué)類別信息。如三氯化鋁試劑是黃酮類化合物的專屬試劑；碘化鉍鉀是生物堿類成分的專屬試劑；三氯化鐵是酚類成分的專屬試劑；醋酐硫酸是三萜類和甾醇類成分的專屬試劑等。硫酸則是許多成分激發(fā)產(chǎn)生熒光的通用試劑，非常方便。第八頁，共四十四頁。醫(yī)學(xué)專題中國藥典薄層色譜的基本要求同板多個(gè)(du )樣品平行比較成本相對低廉、色譜生成快速、同板可以同時(shí)產(chǎn)生多達(dá)1618個(gè)樣品色譜，共平行直觀地比較，色彩豐富的圖像給人的視覺沖擊遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于較為“呆板”的輪廓色譜圖，可以迅速(xn s)地、粗略地，而且頗為有效地評價(jià)樣品色譜圖像之間的相試程度。第九頁，

5、共四十四頁。醫(yī)學(xué)專題中國藥典薄層色譜的基本要求 中國藥典薄層(bo cn)色譜的基本要求供起草(q co)標(biāo)準(zhǔn)用樣品的要求中成藥薄層色譜(s p)鑒別中藥材薄層色譜鑒別第十頁，共四十四頁。醫(yī)學(xué)專題中國藥典薄層色譜的基本要求中藥標(biāo)準(zhǔn)制定(zhdng)技術(shù)要求原則(yunz)保證(bozhng)用藥安全科學(xué)、先進(jìn)、規(guī)范、適用促進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)國際化第十一頁，共四十四頁。醫(yī)學(xué)專題中國藥典薄層色譜的基本要求中藥(zhngyo)標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求中藥標(biāo)準(zhǔn)(biozhn)制定國家藥品標(biāo)準(zhǔn)工作手冊中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 研究制定技術(shù)要求方法學(xué)驗(yàn)證 中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方法學(xué)驗(yàn)證指導(dǎo)原則（中國藥典(yodin)2010版一部）第十二頁，共

6、四十四頁。醫(yī)學(xué)專題中國藥典薄層色譜的基本要求供起草(q co)用樣品的要求研究用樣品應(yīng)具有代表性，覆蓋面要廣，一般至少(zhsho)收集15批以上樣品供研究用；對于多來源品種，每種收集35種；相關(guān)信息包括(boku)：產(chǎn)地（如有可能表明野生或家種）、收集地、收集時(shí)間、收集人獨(dú)家生產(chǎn)的應(yīng)不少于10批，多家企業(yè)生產(chǎn)的應(yīng)盡量收集每家企業(yè)的樣品，5家以上企業(yè)生產(chǎn)的應(yīng)至少收集510家企業(yè)生產(chǎn)的樣品樣品量除滿足起草研究、留樣觀察外，還應(yīng)有不少于3倍檢驗(yàn)量的樣品供復(fù)核用第十三頁，共四十四頁。醫(yī)學(xué)專題中國藥典薄層色譜的基本要求供起草用樣品(yngpn)的要求注意(zh y)中藥材、飲片要求(yoqi)專家鑒定

7、對于具有多種不同規(guī)格的中成藥，應(yīng)收齊全部規(guī)格的樣品試驗(yàn)用樣品必須采用合格原輔料依法生產(chǎn)的樣品，收集的每批樣品均要有該企業(yè)的原輔料和成品的自檢報(bào)告及詳細(xì)生產(chǎn)工藝第十四頁，共四十四頁。醫(yī)學(xué)專題中國藥典薄層色譜的基本要求供起草(q co)用樣品的要求陰性對照(duzho)樣品生產(chǎn)單位(dnwi)應(yīng)盡可能提供研究單位自制陰性樣品系指按處方除去被測定的藥味，按制法制備的樣品，注意應(yīng)包括所有的輔料和工藝步驟，制成量應(yīng)與原標(biāo)準(zhǔn)相符第十五頁，共四十四頁。醫(yī)學(xué)專題中國藥典薄層色譜的基本要求鑒別(jinbi)鑒別(jinbi)顯微(xin wi)鑒別理化鑒別色譜鑒別特征圖譜鑒別一般理化鑒別熒光鑒別光譜鑒別薄層色譜

8、鑒別液相色譜鑒別氣相色譜鑒別第十六頁，共四十四頁。醫(yī)學(xué)專題中國藥典薄層色譜的基本要求中藥材薄層色譜(s p)鑒別盡量采用對照品和對照提取物或?qū)φ账幉?yoci)同時(shí)進(jìn)行對照圖譜清晰、斑點(diǎn)明顯(mngxin)、分離度與重現(xiàn)性符合要求根據(jù)被測物的特性選擇合適的固定相、展開劑及顯色方法等色譜條件色譜條件的優(yōu)化應(yīng)對三個(gè)以上的展開系統(tǒng)進(jìn)行考察確定供試品取樣量、提取和純化方法、點(diǎn)樣量等條件選擇合適的對照物質(zhì)，確定對照物質(zhì)用量、濃度、溶劑、點(diǎn)樣量等第十七頁，共四十四頁。醫(yī)學(xué)專題中國藥典薄層色譜的基本要求中藥材薄層色譜(s p)鑒別驗(yàn)證(ynzhng)專屬性重復(fù)性耐用性重現(xiàn)(zhn xin)性多來源藥材、飲片

9、的色譜行為是否一致混淆品的區(qū)別斑點(diǎn)是否重疊不同品牌的薄層板或自制薄層板考察考察至少23個(gè)品牌或廠家的薄層板，不同溫度、濕度考察，在535考察高低2個(gè)溫度；在低相對濕度（RH）1530%和高相對濕度7590%各考察一個(gè)相對濕度第十八頁，共四十四頁。醫(yī)學(xué)專題中國藥典薄層色譜的基本要求 中成藥薄層(bo cn)色譜鑒別（1）薄層色譜具有分離與鑒別(jinbi)的特性，并具有直觀、承載信息大、專屬性強(qiáng)、快速、經(jīng)濟(jì)、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，是中成藥鑒別的首選方法。（2）新建立的薄層色譜(s p)應(yīng)該圖譜清晰，斑點(diǎn)明顯，分離度、專屬性、重現(xiàn)性與耐用性符合要求，并需要提供圖譜；（3）應(yīng)盡量與該藥材和飲片的薄層色譜鑒

10、別方法一致，如因其他成分干擾或制劑的提取方法不同，可增加提取純化處理或展開劑優(yōu)化。第十九頁，共四十四頁。醫(yī)學(xué)專題中國藥典薄層色譜的基本要求新增薄層色譜鑒別(jinbi)要求供試品溶液的制備：供試品溶液的制備：應(yīng)盡可能除去干擾，同時(shí)方法(fngf)盡量簡便，首先進(jìn)行提取、純化選擇，如回流、超聲提取方法，溶劑、時(shí)間，酸堿處理，溶劑萃取，柱子純化等的選擇對照品選擇：對照品選擇：盡量采用以對照品和對照提取物或?qū)φ账幉耐瑫r(shí)進(jìn)行(jnxng)對照。當(dāng)對照品不易獲得時(shí)，可采用對照提取物或?qū)φ账幉臑閷φ毡影宓倪x擇：薄層板的選擇：吸附劑的比較，選硅膠G板還是GF254板第二十頁，共四十四頁。醫(yī)學(xué)專題中國藥典薄

11、層色譜的基本要求新增薄層色譜(s p)鑒別要求點(diǎn)樣量選擇點(diǎn)樣量選擇(xunz)：不同點(diǎn)樣量的比較展開劑選擇：展開劑選擇：對三個(gè)以上的展開系統(tǒng)進(jìn)行考察(koch)比較顯色條件選擇：顯色條件選擇：日光、紫外光、顯色劑陰性空白試驗(yàn)：陰性空白試驗(yàn)：以證明其他藥味無干擾耐用性：耐用性：不同廠牌的薄層板、溫度、相對濕度等第二十一頁，共四十四頁。醫(yī)學(xué)專題中國藥典薄層色譜的基本要求注意(zh y)（1）使用對照藥材應(yīng)保證藥材的主斑點(diǎn)在樣品(yngpn)中均有對應(yīng)斑點(diǎn)（可參照制法對藥材進(jìn)行前處理），供試品色譜中不能只有對照藥材色譜中的12個(gè)次要斑點(diǎn)相對應(yīng)（2）盡可能采取一個(gè)供試液多項(xiàng)多維鑒別(jinbi)使用的

12、薄層色譜方法，達(dá)到節(jié)約資源、保護(hù)環(huán)境、簡便實(shí)用的目的（3）注意”過柱“的影響，不同品牌、不同批號的吸附劑吸附能力有的不同（4）對原方法的驗(yàn)證注意原標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)樣量按手鋪板制定，現(xiàn)用市售薄層板點(diǎn)樣量過大分離度差，點(diǎn)樣量可減少第二十二頁，共四十四頁。醫(yī)學(xué)專題中國藥典薄層色譜的基本要求薄層色譜應(yīng)用(yngyng)的影響因素樣品預(yù)處理薄層色譜的點(diǎn)樣技術(shù)吸附劑活性溶劑蒸汽在薄層色譜中的應(yīng)用溫濕度對薄層色譜的影響(yngxing)薄層色譜的優(yōu)化及溶劑系統(tǒng)（展開劑）的選擇薄層板第二十三頁，共四十四頁。醫(yī)學(xué)專題中國藥典薄層色譜的基本要求樣品(yngpn)預(yù)處理要得到一個(gè)較為清晰的色譜，樣品提取物經(jīng)預(yù)處理，使供試品溶

13、液得以凈化，往往是一個(gè)重要的有時(shí)甚至是關(guān)鍵的步驟提取溶劑的要求：溶解度不宜太大，黏度不宜太高，沸點(diǎn)(fidin)適中第二十四頁，共四十四頁。醫(yī)學(xué)專題中國藥典薄層色譜的基本要求供試品溶液(rngy)凈化的方法（1）單一溶劑提取法 根據(jù)被測物質(zhì)的化學(xué)特性，有選擇性地采用某種溶劑直接提取制備。（如浙貝母、平貝母、華山參、洋金花等）（2）分段提取法； 被檢測樣品不同極性部位分別提取后制成相應(yīng)供試液，分別檢測分析(fnx)（如丹參）（3）特殊提取方式 如蜜丸等含糖較高又有黏性的樣品，有機(jī)溶劑較難滲透到樣品的內(nèi)部，可加硅藻土、滑石粉等分散劑共同研勻后再提取。第二十五頁，共四十四頁。醫(yī)學(xué)專題中國藥典薄層色譜

14、的基本要求供試品溶液凈化(jnghu)的方法（4）液-液萃取法 利用樣品與雜質(zhì)在兩相（水相和有機(jī)相）中溶解度的不同，達(dá)到凈化目的(md)。 特別適合合劑、口服液、糖漿劑、注射劑等的處理。（5）固-液萃取法 固相小柱萃取基本上是基于吸附、鍵合相分配、正相、反相、離子對、離子交換原理富集待測成分，去除部分雜質(zhì)。第二十六頁，共四十四頁。醫(yī)學(xué)專題中國藥典薄層色譜的基本要求點(diǎn)樣點(diǎn)狀或條帶狀點(diǎn)樣？ 點(diǎn)狀點(diǎn)樣： 簡單快速 缺點(diǎn)：接觸式點(diǎn)樣，易損傷薄層板表面 點(diǎn)樣量小 斑點(diǎn)容易點(diǎn)大，易產(chǎn)生容積環(huán)形色譜效應(yīng)(xioyng)，影響 分離效果 條帶狀點(diǎn)樣 優(yōu)點(diǎn)：一般噴霧式，不損傷薄層板表面 點(diǎn)樣量比點(diǎn)狀點(diǎn)樣大 原點(diǎn)

15、不會上下擴(kuò)散，分離度增加 第二十七頁，共四十四頁。醫(yī)學(xué)專題中國藥典薄層色譜的基本要求點(diǎn)樣點(diǎn)多少？ 常規(guī)的TLC：0.5-5l， 高效(o xio)TLC：HPTLC： 1l；用什么點(diǎn)？ 常規(guī)：手工一般使用定量毛細(xì)管（0.5/1/2和5l），點(diǎn)樣是毛細(xì)管必須完全充滿和完全排空，要以垂直方向小心接觸TLC/ HPTLC板面，（玻璃毛細(xì)管不易損傷預(yù)制板的板面），切忌斑點(diǎn)或條帶在原點(diǎn)因溶劑過大造成原點(diǎn)的擴(kuò)散，一般建議控制在5l以下。 裝置：手工點(diǎn)樣器 半自動點(diǎn)樣器 全自動點(diǎn)樣器第二十八頁，共四十四頁。醫(yī)學(xué)專題中國藥典薄層色譜的基本要求展開(zhn ki)-展開(zhn ki)溶劑使用的溶劑必須是“分析

16、純”或“色譜純”有毒試劑如“苯”禁用，“三氯甲烷”慎用（三氯甲烷目前仍有使用，否則許多鑒別無法進(jìn)行，有的例子是難以取代的）；溶劑組成采用體積比（如乙酸乙酯-甲醇-甲酸=8:2:0.1，或?qū)懽?0:20:1 V/V/V)。甲酸一般雖然用量很微，但應(yīng)準(zhǔn)確加入。溶劑總量應(yīng)足以(zy)使薄層板的浸入深度約為5mm（展開劑量的多少會影響斑點(diǎn)的Rf值）展開劑要求新鮮配制，一般不用多次反復(fù)使用，如展開溶劑混合放置后有分層現(xiàn)象，則按要求放置分層后取需要的一相（上層或下層），備用。第二十九頁，共四十四頁。醫(yī)學(xué)專題中國藥典薄層色譜的基本要求展開(zhn ki)-飽和與預(yù)平衡溶劑的蒸氣相在展開缸中也參與色譜展開而形

17、成三維的層析(cn x)過程，即固相-板上的吸附劑、液相-展開劑、氣相-溶劑蒸氣三相相互作用；如處理不好，會產(chǎn)生如下現(xiàn)象： 展開過程中展開劑的組分被固定相分離產(chǎn)生第二前沿。 未平衡或平衡時(shí)間不夠易產(chǎn)生邊緣效應(yīng)。第三十頁，共四十四頁。醫(yī)學(xué)專題中國藥典薄層色譜的基本要求該怎樣(znyng)飽和呢？展開缸預(yù)平衡或飽和：展開前將展開劑置展開缸中，其蒸氣在展開缸中平衡一段時(shí)間（15-20min）后迅速放入薄層(bo cn)板展開；預(yù)吸附：將薄層板放在展開缸中，不與展開劑接觸，吸附一定量的溶劑蒸氣可以改變層析行為，得到不同的色譜；第三十一頁，共四十四頁。醫(yī)學(xué)專題中國藥典薄層色譜的基本要求飽和(boh)方式

18、方法A（展開(zhn ki)缸、薄層板均不飽和）方法B（展開缸飽和、薄層板不飽和）方法C（展開缸、薄層板均飽和） 第三十二頁，共四十四頁。醫(yī)學(xué)專題中國藥典薄層色譜的基本要求展開(zhn ki)-展開(zhn ki)劑優(yōu)化展開劑在色譜展開中起著關(guān)鍵作用，至今植物藥分析的薄層展開劑的優(yōu)化基本上還是依靠經(jīng)驗(yàn)。主要是因?yàn)橹参锼幒刑嗟奈粗煞?chng fn)，色譜行為各不相同，所以試錯(cuò)法仍然是中藥分析實(shí)驗(yàn)室在選擇展開劑時(shí)最常用的方法（包括借鑒他人的經(jīng)驗(yàn)）第三十三頁，共四十四頁。醫(yī)學(xué)專題中國藥典薄層色譜的基本要求展開劑的優(yōu)化主要考慮兩方面：溶劑的極性和溶劑的選擇性。 前者要求使待分離的主要物質(zhì)的Rf

19、值在0.30.7之間；當(dāng)Rf值符合要求后，進(jìn)行等強(qiáng)度溶劑替換，直到分離度達(dá)到要求為止。對于硅膠等吸附薄層和正相分配色譜來說，展開劑的極性越大，溶劑強(qiáng)度就越大，洗脫能力就越強(qiáng)，即同一物質(zhì)在薄層板上的Rf值越大。根據(jù)(gnj)文獻(xiàn)和樣品所含化合物類型選擇，并記錄色譜純?nèi)軇┰鰷p溶劑強(qiáng)度混合，改性試劑，添加酸堿、水等獲得最佳配比第三十四頁，共四十四頁。醫(yī)學(xué)專題中國藥典薄層色譜的基本要求常用溶劑(rngj)的極性順序水（最大） 甲酰胺乙腈甲醇(ji chn)乙醇 丙醇丙酮二氧六環(huán)四氫呋喃甲乙酮正丁醇乙酸乙酯乙醚異丙醚二氯甲烷三氯甲烷溴乙烷笨四氯化碳二硫化碳環(huán)己烷己烷煤油（最?。?第三十五頁，共四十四頁。

20、醫(yī)學(xué)專題中國藥典薄層色譜的基本要求展開(zhn ki)-展開(zhn ki)距離是不是展距越大越好呢？ TLC:12-15cm HPTLC:5-7cm建議對展距進(jìn)行考察，選擇(xunz)最佳展距，并做好記錄第三十六頁，共四十四頁。醫(yī)學(xué)專題中國藥典薄層色譜的基本要求溫度對薄層(bo cn)色譜的影響一般而言，溫度越低，Rf值越低；展開溫度對薄層色譜的影響不大，一般相差5時(shí)，Rf值的變動(bindng)一般不會超過0.02；因此，展開溫度一般控制在1525 之間即可（一般空調(diào)實(shí)驗(yàn)室均能解決）；記錄試驗(yàn)時(shí)的實(shí)際溫度。第三十七頁，共四十四頁。醫(yī)學(xué)專題中國藥典薄層色譜的基本要求相對濕度對薄層色譜(s p

21、)的影響一般而言，濕度越低， Rf值越低；相對濕度是影響薄層色譜重現(xiàn)性差的主要原因之一；不同樣品或成分(chng fn)和所選用的展開劑對相對濕度的適應(yīng)能力不同；因此，建議展開的濕度一般控制在50%記錄試驗(yàn)時(shí)實(shí)際的相對濕度第三十八頁，共四十四頁。醫(yī)學(xué)專題中國藥典薄層色譜的基本要求相對濕度的控制(kngzh)方法相對濕度相對濕度（%）所需硫酸濃度（所需硫酸濃度（V/V）硫酸（ml）水（ml）18100 95.53268100425710047501005839.510065341007227.51008810.8100第三十九頁，共四十四頁。醫(yī)學(xué)專題中國藥典薄層色譜的基本要求顯色(xin s)對同一薄層板在UV254、365nm、可見光（衍生前和/或后）下觀察給出豐富的化學(xué)結(jié)構(gòu)類型信息；TLC板上常含有UV指示劑（F-254），在UV254nm激發(fā)下產(chǎn)生有色熒光。對UV254nm有