Western操作步驟

1、Western-Blot 操作流程及注意事項(xiàng)Western操作步驟（一）蛋白樣品制備 （1）單層貼壁細(xì)胞總蛋白的提?。?#160;     1. 倒掉培養(yǎng)液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液（或?qū)⑵恐绷⒎胖靡粫?huì)兒使殘余培養(yǎng)液流到瓶底然后再用移液器將其吸走）。      2. 每瓶細(xì)胞加3ml 4預(yù)冷的PBS（0.01M pH7.27.3）。平放輕輕搖動(dòng)1min 洗滌細(xì)胞，然后棄去洗液。重復(fù)以上操作兩次，共洗細(xì)胞三次以洗去培養(yǎng)液。將PBS 棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上。  &#

2、160;   3. 按1ml 裂解液加10 l PMSF（100mM），搖勻置于冰上。（PMSF要搖勻至無結(jié)晶時(shí)才可與裂解液混合）      4. 每瓶細(xì)胞加400 l含PMSF的裂解液，冰上裂解30min，為使細(xì)胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來回?fù)u動(dòng)。      5. 裂解完后，用干凈的刮棒將細(xì)胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)（動(dòng)作要快），然后用槍將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5ml 離心管中。（整個(gè)操作盡量在冰上進(jìn)行）      6. 于4下120

3、00rpm 離心5min。（提前開離心機(jī)預(yù)冷）      7. 將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移倒0.5min 的離心管中放于-20保存。（個(gè)人感覺上述方法可操作性有待加強(qiáng)，細(xì)胞中蛋白本來就很少，一瓶50ml的細(xì)胞有時(shí)按照實(shí)驗(yàn)要求只能加100200l 的裂解液，按照上述操作，直接用200l 裂解液進(jìn)行裂解，根本就不夠瓶壁上沾的。本人是先用預(yù)冷的PBS（一般數(shù)毫升）加入后，用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至試管中，如果數(shù)瓶細(xì)胞是收集同一蛋白的，可以放在同一試管，離心后再將蛋白轉(zhuǎn)移到EP管中，這樣可操作性就比較強(qiáng)）（2）組織中總蛋白的提取：  &#

4、160;   1. 將少量組織塊置于12ml 勻漿器中球狀部位，用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎。      2. 加400 l 單去污劑裂解液裂（含PMSF）于勻漿器中進(jìn)行勻漿。然后置于冰上。      3. 幾分鐘后再碾一會(huì)兒再置于冰上，要重復(fù)碾幾次使組織盡量碾碎。      4. 裂解30 min 后，即可用移液器將裂解液移至1.5ml 離心管中，然后在4下12000rpm 離心5min，取上清分裝于0.5ml 離心管中并置

5、于-20保存。（3）加藥物處理的貼壁細(xì)胞總蛋白的提?。?#160;        由于受藥物的影響，一些細(xì)胞脫落下來，所以除按（一）操作外還應(yīng)收集培養(yǎng)液中的細(xì)胞。以下是培養(yǎng)液中細(xì)胞總蛋白的提?。?#160;     1. 將培養(yǎng)液倒至15ml 離心管中，于2500rpm 離心5min。      2. 棄上清，加入4ml PBS并用槍輕吹打洗滌，然后2500rpm離心5min。棄上清后PBS 重復(fù)洗滌一次。  

6、60;   3. 用槍吸干上清后，加100 l 裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解過程中 要經(jīng)常彈一彈以使細(xì)胞充分裂解。       4. 將裂解液與培養(yǎng)瓶中裂解液混在一起4、12000rpm 離心5min，取上清分裝于0.5ml 離心管中并置于-20保存。（二）蛋白含量的測(cè)定（1）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線1. 從-20取出1mg/ml BSA，室溫融化后，備用。2. 取18 個(gè)1.5ml 離心管，3 個(gè)一組，分別標(biāo)記為0g，2.5g，5.0g ，10.0g ，20.0g ，40.0g。3. 按下表在各管中加入各種試

7、劑。  0g 2.5g  5.0g  10.0g  20.0g  40.0g 1mg/ml BSA   2.5l  5.0l  10.0l  20.0l  40.0l 0.15mol/L NaCl  100l  97.5l  95.0l  90.0l  80.

8、0l  60.0l G250 考馬斯亮藍(lán)溶液 1ml  1ml  1ml  1ml  1ml  1ml4. 混勻后，室溫放置 2min。在生物分光光度計(jì)上比色分析。（2）檢測(cè)樣品蛋白含量      1. 取足量的1.5ml 離心管，每管加入4儲(chǔ)存的考馬斯亮藍(lán)1ml。室溫放置30min 后即可用于測(cè)蛋白。      2. 取一管考馬斯亮藍(lán)加0.15mol/L NaCl

9、溶液100 l，混勻放置2 分鐘可做為空白樣品，將空白倒入比色杯中在做好標(biāo)準(zhǔn)曲線的程序下按blank 測(cè)空白樣品。     3. 棄空白樣品，用無水乙醇清洗比色杯2 次（每次0.5ml），再用無菌水洗一次。4. 取一管考馬斯亮藍(lán)加95 l 0.15mol/L NaCl溶液和5l 待測(cè)蛋白樣品， 混勻后靜置2min，倒入扣干的比色杯中按sample 鍵測(cè)樣品。注意：每測(cè)一個(gè)樣品都要將比色杯用無水乙醇洗2 次，無菌水洗一次?？赏瑫r(shí)混合好多個(gè)樣品再一起測(cè)，這樣對(duì)測(cè)定大量的蛋白樣品可節(jié)省很多時(shí)間。測(cè)得的結(jié)果是5 l樣品含的蛋白量。（上述方法只是一家之言，可以自我

10、變通，本人就不是按照上述方法進(jìn)行的） （三）SDS-PAGE 電泳（1）清洗玻璃板：        一只手扣緊玻璃板，另一只手蘸點(diǎn)洗衣粉輕輕擦洗。兩面都擦洗過后用自來水沖，再用蒸餾水沖洗干凈后立在筐里晾干。（2）灌膠與上樣      1.  玻璃板對(duì)齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠。（可以用1% 瓊脂糖在垂直電泳槽的左、右和下部封邊，五分鐘后重復(fù)一次，這樣可以保證基本不漏膠）      2.&#

11、160; 按前面方法配10分離膠，加入TEMED 后立即搖勻即可灌膠。灌膠時(shí)，可用10ml 槍吸取5ml 膠沿玻璃放出，待膠面升到綠帶中間線高度時(shí)即可。然后膠上加一層水，液封后的膠凝的更快。（灌膠時(shí)開始可快一些，膠面快到所需高度時(shí)要放慢速度。操作時(shí)膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會(huì)有氣泡。加水液封時(shí)要慢，否則膠會(huì)被沖變型。）      3. 當(dāng)水和膠之間有一條折射線時(shí)，說明膠已凝了。再等3min 使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。      4. 按前面方法配4%的濃縮膠，加入T

12、EMED 后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時(shí)也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生。插梳子時(shí)要使梳子保持水平。由于膠凝固時(shí)體積會(huì)收縮減小，從而使加樣孔的上樣體積減小，所以在濃縮膠凝固的過程中要經(jīng)常在兩邊補(bǔ)膠（其實(shí)說經(jīng)常有點(diǎn)過了，補(bǔ)12 次就行了，不補(bǔ)膠問題也不大）。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。      5. 用水沖洗一下濃縮膠，將其放入電泳槽中。（沖洗的話個(gè)人感覺可以使用5ml 的針筒，當(dāng)然操作不能太粗暴了）      6.

13、 測(cè)完蛋白含量后，計(jì)算含20-50g 蛋白（根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行選擇，沒有固定的量）的溶液體積即為上樣量。取出上樣樣品至200l的EP 管中，加入5×SDS 上樣緩沖液至終濃度為1×。（上樣總體積一般不超過15l，加樣孔的最大限度可加20l 樣品）（其實(shí)大一點(diǎn)的垂直電泳槽每孔最大上樣量可以達(dá)到40l，膠做得很好的話50l也是問題不大的）上樣前要將樣品于沸水中煮510min 使蛋白變性。（本人心得：可以使用PCR 儀進(jìn)行變性，加快速度，這樣就不用將水煮沸了，同時(shí)在水中煮蛋白樣品有下面弊端：1.EP管容易炸開，樣品丟失；2.容易進(jìn)水，使樣品體積增加，超過電泳最大上樣量）

14、60;     7. 加足夠的電泳液后開始準(zhǔn)備上樣。（電泳液至少要漫過內(nèi)測(cè)的小玻璃板）用微量進(jìn)樣器貼壁吸取樣品，將樣品吸出不要吸進(jìn)氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品。（加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出。加入下一個(gè)樣品時(shí)，進(jìn)樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌數(shù)次，以免交叉污染）（3）電泳：        電泳時(shí)間一般 45 h，電壓為40V 較好，也可用60V。（本人為了加快速度，濃縮膠時(shí)用80-100V 跑，到分離膠以后用 150-200跑，結(jié)果也不錯(cuò)，總時(shí)間 2

15、h 左右）電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜（如果目的條帶比較大的話，最好使用可視的蛋白marker，F(xiàn)ermentas 的0441 和0671比較好，就是有點(diǎn)貴。一般要讓目的條帶跑過分離膠的1/3 比較好，不要局限于此說明）。 （四）轉(zhuǎn)膜      （1）轉(zhuǎn)一張膜需準(zhǔn)備6 張7.08.3cm 的濾紙和1 張7.38.6cm 的PVDF膜。切濾紙和膜時(shí)一定要戴手套，因?yàn)槭稚系牡鞍讜?huì)污染膜。將切好的PVDF膜置于水上浸2 h 才可使用。（用鑷子捏住膜的一邊輕輕置于有超純水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下層才與水接觸。這樣由于毛細(xì)管

16、作用可使整個(gè)膜浸濕。若膜沉入水里，膜與水之間形成一層空氣膜，這樣會(huì)阻止膜吸水）（個(gè)人感覺其實(shí)轉(zhuǎn)膜之前浸濕一下就ok 了，沒有多大問題，可能按照上述操作結(jié)果會(huì)更好）      （2）在加有轉(zhuǎn)移液的搪瓷盤里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子、兩塊海綿墊、一支玻棒、濾紙和浸過的膜。      （3）將夾子打開使黑的一面保持水平。在上面墊一張海綿墊，用玻棒來回?fù){幾遍以搟走里面的氣泡。（一手搟另一手要壓住墊子使其不能隨便移動(dòng)）在墊子上墊三層濾紙（可三張紙先疊在一起再墊于墊子上，注：個(gè)人感覺就墊1 張濾紙也沒問題呀），一手固

17、定濾紙一手用玻棒搟去其中的氣泡。      （4）要先將玻璃板撬掉才可剝膠，撬的時(shí)候動(dòng)作要輕，要在兩個(gè)邊上輕輕的反復(fù)撬（應(yīng)該邊撬邊用流水緩緩沖洗）。撬一會(huì)兒玻璃板便開始松動(dòng)，直到撬去玻板。（撬時(shí)一定要小心，膠很易裂，要用巧勁）除去小玻璃板后，將濃縮膠輕輕刮去（濃縮膠影響操作），要避免把分離膠刮破。小心剝下分離膠蓋于濾紙上，用手調(diào)整使其與濾紙對(duì)齊，輕輕用玻棒搟去氣泡。將膜蓋于膠上，要蓋滿整個(gè)膠（膜蓋下后不可再移動(dòng)）并除氣泡。在膜上蓋3 張濾紙并除去氣泡。最后蓋上另一個(gè)海綿墊，搟幾下就可合起夾子。整個(gè)操作在轉(zhuǎn)移液中進(jìn)行，要不斷的搟去氣泡。膜兩邊的濾

18、紙不能相互接觸，接觸后會(huì)發(fā)生短路。（轉(zhuǎn)移液含甲醇，操作時(shí)要戴手套，實(shí)驗(yàn)室要開門以使空氣流通）（最后做成的“三明治”千萬不能形成短路，不然有可能會(huì)短路燒壞轉(zhuǎn)膜裝置（價(jià)格不菲，尤其是進(jìn)口的），第一次做的應(yīng)請(qǐng)老手指教）      （5）將夾子放入轉(zhuǎn)移槽槽中，要使夾的黑面對(duì)槽的黑面，夾的白面對(duì)槽的紅面。電轉(zhuǎn)移時(shí)會(huì)產(chǎn)熱，在槽的一邊放一塊冰來降溫。一般用60V 轉(zhuǎn)移2 h 或40V 轉(zhuǎn)移3 h。（1.實(shí)際上應(yīng)該根據(jù)蛋白分子量的大小確定轉(zhuǎn)膜時(shí)間，對(duì)于小分子量的蛋白，轉(zhuǎn)膜時(shí)最好墊兩塊PVDF膜，以免轉(zhuǎn)膜過頭，因?yàn)槿绻谝粡埬ど系鞍踪|(zhì)已經(jīng)轉(zhuǎn)過了，第二張膜上還有蛋

19、白質(zhì)可以進(jìn)行檢測(cè)；對(duì)于大分子量的蛋白，轉(zhuǎn)膜時(shí)電壓要高一點(diǎn)，一般80-100V，時(shí)間也要延長(zhǎng)一點(diǎn)，開始最好也用兩塊膜， 特別是務(wù)必注意加強(qiáng)降溫措施。當(dāng)然轉(zhuǎn)膜是要摸條件的，最好剛開始做的時(shí)候摸個(gè)轉(zhuǎn)膜的時(shí)間梯度。如果由于時(shí)間原因來不及做下面實(shí)驗(yàn)，可以在4 度下12V 轉(zhuǎn)膜過夜）（2.PVDF膜建議使用0.22m 的小孔徑膜，不容易轉(zhuǎn)膜過頭）（3.不同的轉(zhuǎn)膜裝置，轉(zhuǎn)移效率是不一樣的，所以換用轉(zhuǎn)膜裝置，最好再摸個(gè)條件）（4. 轉(zhuǎn)膜時(shí)電極方向注意是膜正膠負(fù)）      （6）轉(zhuǎn)完后將膜用1×麗春紅染液染5min（于脫色搖床上搖）。然后用

20、水沖洗掉沒染上的染液就可看到膜上的蛋白。將膜晾干備用。（一般不需要做這步）（五）免疫反應(yīng)（個(gè)人建議：還是使用雜交袋進(jìn)行一抗和二抗的孵育，節(jié)約抗體）      （1）將膜用TBS 從下向上浸濕后，移至含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖 動(dòng)封閉 1h。      （2）將一抗用TBST 稀釋至適當(dāng)濃度（在1.5ml 離心管中）；撕下適當(dāng)大小的一塊兒保鮮膜鋪于實(shí)驗(yàn)臺(tái)面上，四角用水浸濕以使保鮮膜保持平整；將抗體溶液加到保鮮膜上；從封閉液中取出膜，用濾紙吸去殘留液后，將膜蛋白面朝下放于抗體液面上，掀動(dòng)

21、膜四角以趕出殘留氣泡；室溫下孵育12h 后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次10min；再用TBS 洗一次，10min。      （3）同上方法準(zhǔn)備二抗稀釋液并與膜接觸，室溫下孵育12h 后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次 10min；再用TBS 洗一次，10min，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。（六）化學(xué)發(fā)光，顯影，定影      （1）將A 和B 兩種試劑在保鮮膜上等體積混合；1min 后，將膜蛋白面朝下與此混合液充分接觸；1min 后，將膜移至另一保鮮膜上，去盡殘液，包好，放入X-

22、光片夾中。      （2）在暗室中，將1×顯影液和定影液分別到入塑料盤中；在紅燈下取出X-片， 用切紙刀剪裁適當(dāng)大?。ū饶さ拈L(zhǎng)和寬均需大1cm）；打開X-光片夾，把X-光片放在膜上，一旦放上，便不能移動(dòng)，關(guān)上X-光片夾，開始計(jì)時(shí)；根據(jù)信號(hào)的強(qiáng)弱適當(dāng)調(diào)整曝光時(shí)間，一般為1min 或 5min，也可選擇不同時(shí)間多次壓片，以達(dá)最佳效果；曝光完成后，打開X-光片夾，取出X-光片，迅速浸入顯影液中顯影，待出現(xiàn)明顯條帶后，即刻終止顯影。顯影時(shí)間一般為12min（2025），溫度過低時(shí)（低于16）需適當(dāng)延長(zhǎng)顯影時(shí)間；顯影結(jié)束后，馬上把X-光片浸入

23、定影液中，定影時(shí)間一般為510min，以膠片透明為止；用自來水沖去殘留的定影液后，室溫下晾干。（如果使用柯達(dá)的顯影定影液，時(shí)間很快的，顯影結(jié)束后最好先用事先準(zhǔn)備好的自來水洗一下片子，然后再放到定影液中進(jìn)行定影，這樣可以延長(zhǎng)定影液使用時(shí)間，從而節(jié)約定影液）應(yīng)注意的是：顯影和定影需移動(dòng)膠片時(shí)，盡量拿膠片一角，手指甲不要?jiǎng)潅z片，否則會(huì)對(duì) 結(jié)果產(chǎn)生影響。（七）凝膠圖象分析        將膠片進(jìn)行掃描或拍照，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值。Western Blot原理    

24、;    Western Blot是把電泳分離的組分從凝膠轉(zhuǎn)移到一種固相支持體，并以針對(duì)特定氨基酸序列的特異性試劑作為探針檢測(cè)之。使用的探針是抗體，它與附著于固相支持體的靶蛋白所呈現(xiàn)的抗原表位發(fā)生特異性反應(yīng)。Western的作用是對(duì)非放射性標(biāo)記蛋白組成的復(fù)雜混合物中的某些特異蛋白進(jìn)行鑒別和鑒定。儀器高壓鍋、玻璃勻漿器、低溫高速離心機(jī)、ASP-3700紫外光/可見光微量分光光度計(jì)、-20低溫冰箱、穩(wěn)壓穩(wěn)流電流儀、垂直式電泳槽、JY-系列半干式轉(zhuǎn)移電泳槽、電熱恒溫培養(yǎng)箱、多用脫色搖床、雜交袋封口機(jī)、分析天平、pH值調(diào)節(jié)器、暗室紅燈、壓片暗盒、0.12.5µl

25、 /100µl/200µl/1000µl移液器雜品與耗材10µl/200µl/1000µl吸頭；200µl/1000µl離心管；各種規(guī)格的燒杯、量筒和平皿等玻璃器材；0.22umPVDF膜；3mm濾紙；吸水紙；乳膠手套；雜交袋；保鮮膜；搪瓷盤(>20×20cm)；柯達(dá)X-OMAT BT膠片；玻璃棒；計(jì)時(shí)器；ddH2O試劑單去污劑裂解液、0.01mol/LPBS(pH7.3)、10%分離膠、4%濃縮膠、G250考馬斯亮藍(lán)溶液、0.15mol/LNaCl溶液、2×（5×）SDS上樣緩

26、沖液、電泳緩沖液、轉(zhuǎn)移緩沖液、10×麗春紅染液、封閉液、TBST、TBS、洗脫抗體緩沖液、顯影液、定影液、抗體、化學(xué)發(fā)光試劑。試劑配制 （一）母液  1.0mol/L TrisHCl  Tris (MW121.14) 30.29g  蒸餾水 200ml溶解后，用濃鹽酸調(diào)pH 至所需點(diǎn)（見下所示），最后用蒸餾水定容至250ml，高溫滅菌后室溫下保存。 pH HCl 7.4 約17ml 7.5 約16ml 7.6 

27、60;約15ml 8.0  約10ml1.74mg/ml (10mmol/L)PMSF   PMSF 0.174g 異丙醇 100ml溶解后，分裝于1.5ml 離心管中，-20保存。  0.2mol/L NaH2PO4  NaH2PO4 (MW119.98) 12g  蒸餾水 至500ml溶解后，高壓滅菌，室溫保存。  0.2mol/LNa2HPO4  Na2HPO4 12H2O(MW 

28、358.14) 71.6g  蒸餾水 至1000ml溶解后，高壓滅菌，室溫保存。     10%SDS SDS 10g  蒸餾水 至 100ml50水浴下溶解，室溫保存。如在長(zhǎng)期保存中出現(xiàn)沉淀，水浴溶化后，仍可使用。  10%過硫酸胺（AP） 過硫酸胺 0.1g  超純水 1.0ml 溶解后，4保存，保存時(shí)間為1 周。（可先將過硫酸胺干粉稱好分量后放在EP管中，一次性多裝幾管，

29、使用時(shí)加入超純水即可）  1.5mol/L TrisHCl（pH8.8）  Tris (MW121.14) 45.43g  超純水 200ml溶解后，用濃鹽酸調(diào)pH 至8.8，最后用超純水定容至250ml，室溫下保存。  0.5mol/L TrisHCl（pH6.8） Tris (MW121.14)  15.14g  超純水 200ml溶解后，用濃鹽酸調(diào)pH 至6.8，最后用超純水定容至250ml，室溫下保存。   40%Ac

30、r/Bic（37.5：1）  丙稀酰胺（Acr） 37.5g  甲叉雙丙稀酰胺（Bic） 1g  超純水 至100ml 溶解后4保存。使用時(shí)恢復(fù)至室溫且無沉淀。  20% Tween20  Tween20 20ml  蒸餾水 至 100ml混勻后4保存。 （二）使用液?jiǎn)稳ノ蹌┝呀庖海?0mM Tris-HCl pH8.0、150mM NaCl、1% Triton X-100、100ug/ml PMSF） &

31、#160;1mol/L TrisHCl（pH8.0） 2.5ml NaCl  0.438 TritonX-100   0.5ml 蒸餾水 至50ml   混勻后4保存。使用時(shí)，加入PMSF至終濃度為100g/ml（0.87ml 裂解液加入1.74mg/ml PMSF50l）。（一般實(shí)際用的比較多的其實(shí)是RIPA 裂解配方：50 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl、1 mM PMSF、1 mM EDTA、1% Triton x-100、1%脫氧膽酸鈉、

32、0.1% SDS）  1mol/L TrisHCl（pH7.4） 2.5ml NaCl  0.87g 100mM EDTA 0.5ml TritonX-100   0.5ml 10% Na-deoxycholate（10%脫氧膽酸鈉） 5ml 10% SDS 0.5ml 蒸餾水 至50ml混勻后4保存。使用時(shí)，加入PMSF至終濃度為1 mM PMSF（1ml 裂解液加入1.74mg/ml PMSF100l）。 0.0

33、1mol/L PBS（pH 7.2-7.4） 0.2 mol/L NaH2PO4  19ml  0.2 mol/L Na2HPO4  81ml  NaCl   17g  蒸餾水 至 2000ml（如果用TBST 進(jìn)行洗膜的話，其實(shí)PBS 用得很少，大可不必自己配制，向試劑公司購(gòu)買20×的 PBS 濃縮液即可，500ml 的濃縮液不到50 元，很方便） G250 考馬斯亮藍(lán)溶液（蛋白定量專用） 考馬

34、斯亮藍(lán) G250  100mg  95乙醇  50ml  磷酸  100ml  蒸餾水 至1000ml配制時(shí)，先用乙醇溶解考馬斯亮藍(lán)染料，再加入磷酸和水，混勻后，用濾紙過濾，4保存。 0.15 mol/L NaCl  NaCl（MW58.44）  0.877g 蒸餾水 至100 ml高溫滅菌后，室溫保存。  100mg/ml 牛血清白蛋白（BSA） BSA 0.1g&

35、#160; 0.15 mol/L NaCl  1ml溶解后-20保存。制作蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，用 0.15 mol/L NaCl 進(jìn)行100 倍稀釋成1mg/ml，-20保存。10分離膠和4濃縮膠  10分離膠（兩塊膠，10ml） 4濃縮膠（兩塊膠，5ml） 超純水 4.85ml 3.16ml 40Acr/Bic（37.5：1）  2.5ml  0.5ml 1.5 mol/L TrisHCl（pH8.8） 2.5ml  

36、 0.5 mol/L TrisHCl（pH6.8）     1.26ml 10SDS  100 l  50 l 10%AP（過硫酸胺）  50 l  25 l TEMED  5 l   5 l加TEMED 后，立即混勻即可灌膠。（為了加快凝膠，可以將過硫酸胺和TEMED 量加大，一般加至原來的2-3 倍，根據(jù)實(shí)驗(yàn)當(dāng)時(shí)的溫度適當(dāng)調(diào)整） 還原型5×SDS 上樣緩沖液(0.

37、25 mol/L TrisHCl（pH6.8），0.5mol/L二硫叔糖醇，10%SDS，0.5% 溴酚藍(lán)，50%甘油)  0.5 mol/L TrisHCl（pH6.8） 2.5ml 二硫叔糖醇（DTT，MW154.5）  0.39g SDS  0.5g 溴酚藍(lán)  0.025 甘油  2.5ml混勻后，分裝于1.5ml 離心管中，4保存。  電泳液緩沖液 Tris（MW121.14） 3.03g 

38、; 甘氨酸（MW75.07） 18.77g  SDS  1g  蒸餾水至 1000ml溶解后室溫保存，此溶液可重復(fù)使用 35 次。（電泳液可以回收重復(fù)利用，一般將回收的電泳液加入垂直電泳槽的下半部分，上半部分最好使用新鮮的電泳緩沖液）（可以配制成10×電泳液緩沖液進(jìn)行保存，稀釋10 倍使用）  轉(zhuǎn)移緩沖液 甘氨酸（MW75.07）  2.9g  Tris（MW121.14） 5.8g  SDS &

39、#160;0.37g  甲醇  200ml  蒸餾水 至1000ml溶解后室溫保存，次溶液可重復(fù)使用35 次（此溶液最好保存在4 度冰箱，最多使用5次左右，不然影響轉(zhuǎn)移效率）。（先用蒸餾水溶解甘氨酸、Tris 和SDS，然后再加入甲醇，最后補(bǔ)足液體。如果先加入甲醇，溶解甘氨酸、Tris 和SDS等比較困難）（可以配制成2×轉(zhuǎn)移緩沖液進(jìn)行保存，稀釋后使用）  10× 麗春紅染液 麗春紅S  2g  三氯乙酸  30g  磺基水楊酸  30g  蒸餾水 至100ml使用時(shí)將其稀釋10 倍。 TBS 緩沖液 1 mol/L TrisHCl（pH7.5） 10ml