腦膜炎奈瑟菌實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作規(guī)范

1、附件7 腦膜炎奈瑟菌實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作規(guī)范一、腦膜炎奈瑟菌鑒定程序和標(biāo)準(zhǔn)1、 腦膜炎奈瑟菌細(xì)菌鑒定程序 腦膜炎奈瑟菌的鑒定通常是通過(guò)在CAP和BAP上生長(zhǎng)物通過(guò)革蘭染色鏡檢和生化反應(yīng)檢測(cè)以確定是否為腦膜炎奈瑟菌，在此基礎(chǔ)上再通過(guò)腦膜炎奈瑟菌分群診斷血清進(jìn)行血清分群。BAP,CAP生長(zhǎng)物革蘭氏染色為陰性雙球菌氧化酶反應(yīng)陽(yáng)性，進(jìn)行生化鑒定陰性，非腦膜炎奈瑟菌生化鑒定（糖氧化）Glu Mal Lac Suc 陽(yáng)性，為腦膜炎奈瑟菌進(jìn)行血清分群陰性，非腦膜炎奈瑟菌A、B、C、H、I、K、L、W135、X、Y、Z、Z´(29E)不同血清群圖xx 腦膜炎奈瑟菌鑒定程序2、 腦膜炎奈瑟菌感染確診實(shí)驗(yàn)室檢

2、測(cè)疑似流腦病例具有以下實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果之一，即可確診：1. 培養(yǎng)：自腦脊液或血液標(biāo)本中分離到腦膜炎奈瑟菌。2. 乳膠凝集檢測(cè)：采用乳膠凝集檢測(cè)試劑盒，腦脊液標(biāo)本乳膠凝集檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性，目前Bio-Rad乳膠凝集檢測(cè)試劑盒能檢測(cè)A群、B群、C群和W135/Y群腦膜炎奈瑟菌感染。3. PCR檢測(cè)：腦脊液標(biāo)本或血液標(biāo)本PCR擴(kuò)增特異性腦膜炎奈瑟菌DNA片段陽(yáng)性。 通過(guò)ctrA基因擴(kuò)增，鑒定腦膜炎奈瑟菌，通過(guò)擴(kuò)增orf-2、siaD(B)、siaD(C)、siaD(Y)、siaD（W135）等基因片段鑒別不同的血清群，或通過(guò)Real-time PCR檢測(cè)出特異性基因片段陽(yáng)性。4. 血清IgG抗體滴度4倍增

3、高：恢復(fù)期血清抗體滴度較急性期4倍增高。二、腦膜炎奈瑟菌標(biāo)本接種培養(yǎng)（一）腦脊液標(biāo)本 1腦脊液標(biāo)本預(yù)處理 腦脊液標(biāo)本送到實(shí)驗(yàn)室后，應(yīng)立即離心，2000rpm，20min，用巴斯德吸管吸取上清，進(jìn)行乳膠凝集實(shí)驗(yàn)檢測(cè)抗原。離心后的沉淀進(jìn)行劇烈振蕩或充分混合。取1滴沉淀準(zhǔn)備革蘭染色，1滴劃線接種原始培養(yǎng)基。（注意:如果獲得的腦脊液不足1mL則不進(jìn)行離心，直接用其進(jìn)行革蘭染色和涂板培養(yǎng)）。2. 腦脊液標(biāo)本初代培養(yǎng) 腦膜炎奈瑟菌的初代接種培養(yǎng)基為巧克力瓊脂平板。將離心后的腦脊液標(biāo)本沉淀滴加至巧克力瓊脂平板，取菌環(huán)劃線接種。置5%的CO2孵箱或燃有蠟燭的燭缸中培養(yǎng)。也可將一些沉淀接種備用肉湯培養(yǎng)基（如腦心

4、浸液肉湯培養(yǎng)基），進(jìn)行孵育培養(yǎng)。如果用T-I培養(yǎng)基進(jìn)行運(yùn)輸，在孵育24h后，用無(wú)菌的針或注射器轉(zhuǎn)移100 µl T-I培養(yǎng)基的液體部分到BAP及CAP上，并劃線分離。3. 腦脊液標(biāo)本革蘭染色（Hucker 改進(jìn)方法） 腦脊液標(biāo)本離心沉淀物革蘭染色或采用乳膠凝集方法檢測(cè)CSF中特殊的抗原成分兩種檢測(cè)方法，可作為流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌和腦膜炎奈瑟菌引起的細(xì)菌性腦膜炎的初步診斷。即使標(biāo)本培養(yǎng)陰性，革蘭染色或乳膠凝集檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性或其中任何一個(gè)檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性即可以作為感染的證據(jù)。（1） 腦脊液標(biāo)本離心，2000rpm，20min。（2） 酒精清洗并干燥的玻片，滴加1滴2滴沉淀物，允許多滴匯集成

5、一個(gè)大滴，不要鋪開(kāi)液體或使用過(guò)高濃度的沉淀物?？赡艿那闆r下，在生物安全柜中風(fēng)干玻片。（3） 將玻片三次快速通過(guò)火焰以固定涂片，不應(yīng)該灼干。也可以使用異丙醇（95-100）固定。（4） 草酸銨結(jié)晶紫染色玻片，1min。流水沖洗玻片1min，并去除多余的水分。（5） 革蘭氏碘液染色玻片，1min。流水沖洗玻片并干燥。（6） 95%的乙醇脫色（5s-10s足夠）。（7） 番紅精復(fù)染20s-30s或用酚紅復(fù)染10s-15s。流水沖洗玻片并拭干玻片。顯微鏡觀察染色的涂片，用亮視野的透鏡和油鏡。腦膜炎奈瑟菌通常出現(xiàn)在多形核白細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外，革蘭陰性、咖啡豆形雙球菌。（二）血液標(biāo)本1. 接種血培養(yǎng)瓶：采取血

6、液標(biāo)本后直接接種血培養(yǎng)瓶，應(yīng)在培養(yǎng)前排氣，放置在35，排氣通常是在血培養(yǎng)瓶的橡膠部分插入一個(gè)塞有棉花的無(wú)菌針頭來(lái)實(shí)現(xiàn)。2.傳代培養(yǎng)（1）血培養(yǎng)瓶觀察 血培養(yǎng)瓶在培養(yǎng)14h17h后開(kāi)始進(jìn)行觀察，以后每天都要進(jìn)行觀察，直至第7天。紅血球發(fā)生任何混濁或溶解都可能是細(xì)菌生長(zhǎng)的指示，應(yīng)該立即進(jìn)行傳代培養(yǎng)。腦膜炎奈瑟菌很脆弱，因此不管血培養(yǎng)瓶的表象是否變化，培養(yǎng)14h17h、48h和7天時(shí)都應(yīng)進(jìn)行傳代。出現(xiàn)渾濁和細(xì)菌生長(zhǎng)二者并不一定有相關(guān)性，不出現(xiàn)渾濁并不意味著細(xì)菌一定沒(méi)有生長(zhǎng)。在傳代前應(yīng)攪動(dòng)瓶子混勻內(nèi)容物。（2）血培養(yǎng)瓶培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種 用乙醇和聚烯吡酮碘拭子消毒血培養(yǎng)瓶橡膠塞表面，用帶針頭的注射器從血培養(yǎng)瓶

7、中吸取少量（0.5mL）液體，接種于巧克力瓊脂平板（CAP）和血瓊脂平板(BAP)。當(dāng)只使用一種瓊脂時(shí)，應(yīng)該接種CAP，因?yàn)镃AP含有流感嗜血桿菌生長(zhǎng)所必需的因子，而B(niǎo)AP是沒(méi)有的。劃線方式接種瓊脂平板，在CO2空氣中培養(yǎng)至48h。當(dāng)細(xì)菌的生長(zhǎng)已經(jīng)通過(guò)血瓊脂傳代而確定時(shí)，則不需要再繼續(xù)培養(yǎng)血培養(yǎng)瓶。瓶子應(yīng)該按照生物安全程序處理。（三）、T-I培養(yǎng)基T-I培養(yǎng)基接種標(biāo)本后，培養(yǎng)24h，用無(wú)菌針頭或注射器將100l T-I培養(yǎng)基液體加至BAP和CAP上，劃線，CO2空氣中35培養(yǎng)至48h。可通過(guò)革蘭染色檢測(cè)生長(zhǎng)物純度。如果BAP或CAP瓊脂上沒(méi)有細(xì)菌生長(zhǎng)，應(yīng)分別在第3天和第7天再次進(jìn)行傳代培養(yǎng)。培

8、養(yǎng)后的T-I培養(yǎng)瓶應(yīng)該按照生物安全程序處理。（四）、腦膜炎奈瑟菌形態(tài)學(xué)特征BAP平板上的腦膜炎奈瑟菌新鮮菌落呈現(xiàn)圓形，光滑、濕潤(rùn)、光澤、中央凸起、有完整的邊界，一些菌落與周圍的菌落接合。培養(yǎng)物灰色，不產(chǎn)生色素，陳舊菌落變成灰色半透明，有時(shí)導(dǎo)致底部瓊脂變暗。充分分開(kāi)的菌落可以在18h生長(zhǎng)成直徑為1mm，幾天后變?yōu)?mm，有時(shí)帶波浪形的邊界。 三、腦膜炎奈瑟菌生物化學(xué)特征和鑒定生長(zhǎng)一天的培養(yǎng)物檢測(cè)結(jié)果會(huì)好一些。革蘭染色檢查生長(zhǎng)物的純度是最常進(jìn)行的檢測(cè)（腦膜炎奈瑟菌是一種革蘭陰性、咖啡豆樣的雙球菌）。如果有必要，需要進(jìn)行再次傳代培養(yǎng)以保證純度。取BAP培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)物，進(jìn)行Kovac´s氧

9、化酶實(shí)驗(yàn)，并鑒定血清群。最后，用碳水化合物（糖類）反應(yīng)確認(rèn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。（一） Kovac´s氧化酶實(shí)驗(yàn)氧化酶實(shí)驗(yàn)測(cè)定的是細(xì)胞色素氧化酶。含有細(xì)胞色素酶C（呼吸鏈上的一種成分）的微生物可以將四甲基-p-苯二胺氯化物轉(zhuǎn)變?yōu)樽仙衔铩? 制備1的氧化酶試劑為防止儲(chǔ)存的粉狀氧化酶試劑變質(zhì)，應(yīng)將其置于封閉干燥的瓶子中，存放于陰涼處。用蒸餾水制備10mL 1的四甲基-p-苯二胺氯化物溶液，分裝為1mL的等份體積，-20凍存。使用時(shí)，融化1管1mL試劑，并在無(wú)孔表面（如：Petri碟、玻璃平皿等）潤(rùn)濕盡可能多的濾紙條。自然風(fēng)干濾紙條。等濾紙條完全干燥后，將其放入嚴(yán)密封蓋的試管或瓶子中，4保存，隨用

10、隨取。注意：氧化酶試劑只能做體外診斷用。避免沾染皮膚和眼睛。它可引起刺痛。不慎沾染時(shí)，立即用大量清水沖洗眼睛或皮膚至少15min。2.實(shí)驗(yàn)操作用鉑金接種環(huán)、一次性塑料環(huán)或木質(zhì)面簽，挑取一部分待測(cè)試的菌落，涂抹至制備好的濾紙條上。不要使用鎳鉻合金環(huán)，因?yàn)樗赡軐?dǎo)致假陽(yáng)性反應(yīng)。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判讀腦膜炎奈瑟菌不太可能出現(xiàn)延遲反應(yīng)，10秒鐘之內(nèi)呈紫色為陽(yáng)性反應(yīng)。這只是腦膜炎奈瑟菌的輔助識(shí)別實(shí)驗(yàn)，奈瑟菌屬的其它細(xì)菌以及其他無(wú)關(guān)的菌種，也可能會(huì)出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)。（二） 腦膜炎奈瑟菌碳水化合物利用檢測(cè)（胱氨酸胰酶解酪蛋白瓊脂法)碳水化合物利用實(shí)驗(yàn)可用來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證腦膜炎奈瑟菌菌株，不同的碳水化合物加到胱氨酸胰酶解

11、酪蛋白瓊脂中，終濃度為1。確定一個(gè)菌株是否是腦膜炎奈瑟菌，可使用四種單糖糖管（葡萄糖、麥芽糖、半乳糖和蔗糖），奈瑟氏菌屬細(xì)菌產(chǎn)酸是通過(guò)氧化碳水化合物而不是通過(guò)發(fā)酵碳水化合物。腦膜炎奈瑟菌能氧化葡萄糖和麥芽糖，不能氧化半乳糖和蔗糖。培養(yǎng)基中含有敏感的酚紅指示劑，當(dāng)有酸存在時(shí)（pH6.8）時(shí)顯示黃色。1.實(shí)驗(yàn)操作步驟用接種針頭從BAP或CAP過(guò)夜培養(yǎng)物中取少量菌培養(yǎng)物。幾次穿刺接種物至培養(yǎng)基上部10mm。接種不同的待測(cè)碳水化合物培養(yǎng)基，要使用單獨(dú)的針頭或灼燒針頭。旋緊管子的帽子，放入35孵箱（不需要CO2），至少培養(yǎng)72h，如果還是陰性就丟棄。2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果的讀取可見(jiàn)濁度加深并且培養(yǎng)基的上部變成黃色

12、說(shuō)明細(xì)菌生長(zhǎng)并產(chǎn)酸，可以認(rèn)為結(jié)果陽(yáng)性。雖然反應(yīng)有時(shí)可以在接種24h發(fā)生，但是一些反應(yīng)延遲，培養(yǎng)72h之前不能輕易認(rèn)定為陰性結(jié)果。3.奈瑟氏菌屬和摩拉克氏菌屬的一些種碳水化合物的利用見(jiàn)表菌種 產(chǎn)酸來(lái)源葡萄糖 麥芽糖 半乳糖 蔗糖腦膜炎奈瑟菌淋球菌干燥奈瑟氏菌乳糖奈瑟氏菌摩拉克氏菌+ + - -+ - - -+ + - + + + - - - -四、腦膜炎奈瑟菌免疫學(xué)檢測(cè)（一）腦膜炎奈瑟菌血清學(xué)鑒定1.腦膜炎奈瑟菌血清目前，基于莢膜多糖已確定了13個(gè)不同的血清群：A、B、C、H、I、K、L、W135、X、Y、Z、Z´(29E)，D 血清群已不再檢測(cè)。A、B、C、W135及Y是最常見(jiàn)的引起

13、腦膜炎的血清群。A群是導(dǎo)致非洲和亞洲腦膜炎流行的最主要血清群，其次是C群，現(xiàn)在已有商業(yè)化的分群血清，包括美國(guó)Remal血清、BD腦膜炎奈瑟菌診斷血清、法國(guó)Bio-Mureux 診斷血清等。2.血清學(xué)鑒定操作（1）用乙醇擦凈一塊載玻片，用蠟筆或其它記號(hào)筆將載玻片分為三個(gè)部分，每個(gè)部分10mm×4mm。（2）在每個(gè)部分的近底部處加10µl 0.5的生理鹽水，用無(wú)菌接種環(huán)、針、無(wú)菌涂棒或牙簽從巧克力平板或血平板上采取細(xì)菌培養(yǎng)物，在生理鹽水中，將培養(yǎng)物制成用于測(cè)試的略呈乳液狀的懸液。注意：出于安全考慮，推薦使用福爾馬林滅活的腦膜炎奈瑟菌懸液，而不是活菌的生理鹽水懸液。福爾馬林是一種

14、致癌物，在儲(chǔ)存和使用時(shí)須高度小心，操作應(yīng)在安全柜中進(jìn)行操作。（3）在每個(gè)部分的上部加上所選的血清各10µl以及10µl生理鹽水或PBS。（4）在亮光下或黑色背景下，將抗血清或生理鹽水與各自的培養(yǎng)菌懸液混合，搖動(dòng)玻片1min-2min（時(shí)間可能會(huì)因?yàn)檠宓闹圃煺卟煌兴町悾?.實(shí)驗(yàn)結(jié)果的讀?。?）凝集應(yīng)該只與一種血清凝集而與生理鹽水不發(fā)生凝集。（2）在生理鹽水中凝集說(shuō)明培養(yǎng)菌有自凝性。（3）和幾種抗血清凝集而無(wú)自凝現(xiàn)象，說(shuō)明培養(yǎng)菌的粗糙的。（4）和任何一種抗血清或生理鹽水都不能發(fā)生凝集，說(shuō)明菌株為不能分群菌株。這樣的結(jié)果在新鮮分離株中很少發(fā)生，但確實(shí)會(huì)偶爾發(fā)生。（二）腦

15、膜炎奈瑟菌乳膠凝集檢測(cè)1.乳膠凝集試劑現(xiàn)在有幾種商品化的試劑盒可用，目前商業(yè)化的試劑盒包括Bio-Rad公司產(chǎn)品以及BD公司產(chǎn)品。當(dāng)使用這些試劑盒時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格遵照制造商的操作說(shuō)明進(jìn)行，為了獲得最佳的結(jié)果，CSF樣本上清應(yīng)盡快檢測(cè)；如果不能立即檢測(cè)，樣本在幾個(gè)h內(nèi)應(yīng)冷藏在2-8，或保存在-20，可以凍存更長(zhǎng)的時(shí)間。試劑應(yīng)該2-8保存，在較高的溫度時(shí)，尤其是在熱帶地區(qū)，試劑會(huì)被破壞，即使在試劑盒的有效期內(nèi)測(cè)試結(jié)果也可能會(huì)導(dǎo)致偏差結(jié)果。乳膠懸液試劑不應(yīng)該凍存。2.乳膠凝集監(jiān)測(cè)操作步驟（1) CSF上清在沸水浴中加熱5min。（2) 輕搖乳膠懸液直至均勻。（3) 在環(huán)形玻片或一次性卡片上，每種乳膠懸液滴

16、加1滴。（4) 向每種懸液滴加30l-50l CSF。（5) 用手搖動(dòng)2min-10min，建議在可能的情況下100rpm機(jī)械搖動(dòng)。見(jiàn)3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果的讀取在亮光下讀取，不需要擴(kuò)大倍數(shù)。（1) 陰性反應(yīng)：懸液仍呈現(xiàn)均質(zhì)狀并出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)輕微的牛奶狀外觀。（2) 陽(yáng)性反應(yīng)：2min內(nèi)，乳膠顆粒凝集（或可見(jiàn)團(tuán)塊）。 注意：逆向免疫電泳可能也可用于CSF中直接抗原的檢測(cè)。五、 腦膜炎奈瑟菌分子檢測(cè)1. 引物序列 （1） 腦膜炎奈瑟菌種屬特異性引物 crgA 5-GCTGGCGCCGCTGGCAACAAAATTC-35-CTTCTGCAGATTGCGGCGTGCCGT-3（2） A群腦膜炎奈瑟菌引物 orf

17、-2(A) 5-CGCAATAGGTGTATATATTCTTCC-35-CGTAATAGTTTCGTATGCCTTCTT-3（3） B群腦膜炎奈瑟菌引物 siaD(B) 5-GGATCATTTCAGTGTTTTCCACCA-35-GCATGCTGGAGGAATAAGCATTAA-3（4） C群腦膜炎奈瑟菌引物 siaD(C) 5-TCAAATGAGTTTGCGAATAGAAGGT-35-CAATCACGATTTGCCCAATTGAC-3（5） Y群腦膜炎奈瑟菌引物 siaD(Y) 5-CTCAAAGCGAAGGCTTTGGTTA-35-CTGAAGCGTTTTCATTATAATTGCTAA-3（6） W135群腦膜炎奈瑟菌