RNA干擾和siRNA轉(zhuǎn)染實(shí)用

1、RNA干擾和siRNA轉(zhuǎn)染實(shí)用內(nèi)內(nèi) 容容第一部分 RNAi實(shí)驗(yàn)基本概念第二部分 RNAi實(shí)驗(yàn)具體設(shè)計(jì)第三部分 siRNA轉(zhuǎn)染過程相關(guān)問題及解答第一部分第一部分RNAi實(shí)驗(yàn)基本概念實(shí)驗(yàn)基本概念主要內(nèi)容主要內(nèi)容1.RNAi的概念2.RNAi的啟動途徑3.非哺乳動物系統(tǒng)的RNAi實(shí)驗(yàn)4.哺乳動物系統(tǒng)的RNAi實(shí)驗(yàn)5.RNAi效應(yīng)表現(xiàn)1.RNAi的概念的概念RNA干擾(RNA interference)是雙鏈RNA（dsRNA)特異性地結(jié)合到與之序列互補(bǔ)的mRNA上，導(dǎo)致mRNA降解，從而介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄水平基因表達(dá)抑制。2.RNAi的啟動途徑的啟動途徑(1) dsRNA途徑(2) siRNA途徑(3) s

2、hRNA表達(dá)載體途徑(1) dsRNA途徑途徑dsRNA:在非哺乳動物系統(tǒng)中，大于30bp的長雙鏈RNA(dsRNA)進(jìn)入細(xì)胞后，經(jīng)過胞質(zhì)內(nèi)雙鏈特異性核酸酶Dicer水解成21-23bp的siRNA，進(jìn)一步導(dǎo)致RNAi的發(fā)生。但在絕大多數(shù)哺乳動物系統(tǒng)中，超過30bp的dsRNA會引起細(xì)胞潛在的抗病毒機(jī)制（干擾素效應(yīng)）。(2) siRNA途徑途徑小干擾RNA，長21-23bp，雙鏈。作用機(jī)制：雙鏈的siRNA解鏈并裝配入RNA介導(dǎo)的靜默復(fù)合物(RISC)，siRNA的反義鏈引導(dǎo)RISC與mRNA分子互補(bǔ)結(jié)合，并降解mRNA，最終導(dǎo)致特定基因表達(dá)的抑制。(3) shRNA表達(dá)載體途徑表達(dá)載體途徑s

3、hRNA表達(dá)載體在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)shRNA后，在Dicer作用下形成siRNA分子，導(dǎo)致RNAi的發(fā)生。3.非哺乳動物系統(tǒng)的非哺乳動物系統(tǒng)的RNAi實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)如線蟲、果蠅等可通過與靶基因序列互補(bǔ)的長鏈dsRNA（通常200bp）介導(dǎo)RNAi的發(fā)生 。長鏈dsRNA通?？梢酝ㄟ^體外轉(zhuǎn)錄獲得。4.哺乳動物系統(tǒng)的哺乳動物系統(tǒng)的RNAi實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)通過轉(zhuǎn)染siRNA：通常在3-7天可以維持較高的基因表達(dá)抑制效應(yīng)，效應(yīng)期的長短主要取決于細(xì)胞的增殖速度和siRNA的有效性。大部分RNAi實(shí)驗(yàn)可以在此時間段獲得結(jié)果，而且可以通過再次轉(zhuǎn)染獲得超過1周的基因表達(dá)抑制時間。通過轉(zhuǎn)染shRNA表達(dá)載體，可以獲得超過2周的基因

4、表達(dá)抑制時間，在長效RNAi實(shí)驗(yàn)時，選擇shRNA表達(dá)載體較為合適。5.RNAi效應(yīng)表現(xiàn)效應(yīng)表現(xiàn)RNAi效應(yīng)導(dǎo)致的靶基因下調(diào)可在mRNA水平和蛋白水平表現(xiàn)，也可能會在細(xì)胞形態(tài)等生理學(xué)方面表現(xiàn)。第二部分哺乳動物系統(tǒng)的RNAi實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)主要內(nèi)容主要內(nèi)容1. 需要短期抑制還是長效抑制?2. 采用siRNA進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的途徑3. 構(gòu)建shRNA表達(dá)載體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)4. siRNA設(shè)計(jì)需要注意的問題5. 脫靶效應(yīng)6. 轉(zhuǎn)染是RNAi實(shí)驗(yàn)的瓶頸1.需要短期抑制還是長效抑制需要短期抑制還是長效抑制?1周以內(nèi)，采用siRNA較好，無需構(gòu)建載體，節(jié)省時間，還可以采用2次轉(zhuǎn)染的方法，延長RNAi作用的時間到2周。2周以上長

5、效RNAi實(shí)驗(yàn)，采用shRNA表達(dá)載體較好，效應(yīng)持續(xù)時間長。2. 采用采用siRNA進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的途徑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的途徑(1) 化學(xué)合成：首選的siRNA制備方法，最快、最方便(2) 體外轉(zhuǎn)錄(3) Dicer/RNase酶解這三種方法均可做熒光標(biāo)記，可及時得知轉(zhuǎn)染效率3.構(gòu)建構(gòu)建shRNA表達(dá)載體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)表達(dá)載體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)需要構(gòu)建相關(guān)質(zhì)?？衫幂d體上的抗生素等標(biāo)記篩選，做長效表達(dá)不能做熒光標(biāo)記，無法直觀知道轉(zhuǎn)染效率4.siRNA設(shè)計(jì)需要注意的問題設(shè)計(jì)需要注意的問題(1) siRNA序列設(shè)計(jì)(2) 陰性對照的作用(3) 陽性對照的重要性(4) siRNA熒光標(biāo)記的問題(1) siRNA的設(shè)計(jì)的設(shè)計(jì)理想的

6、siRNA序列是特異性強(qiáng)，抑制效率高?？赏ㄟ^檢索相關(guān)基因的文獻(xiàn)報(bào)道序列，或者通過在線設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行，一些技術(shù)力量較強(qiáng)的化學(xué)合成公司可提供免費(fèi)設(shè)計(jì)。如果有可能，多設(shè)計(jì)幾條siRNA 序列，以篩選最特異、最有效的siRNA序列。(2) 陰性對照陰性對照siRNA的作用的作用陰性對照siRNA通常在進(jìn)入細(xì)胞后不會引起任何基因表達(dá)的改變，從而反映出小分子RNA片段進(jìn)入細(xì)胞后對基因表達(dá)的非特異影響。(3) 陽性對照陽性對照siRNA的重要性的重要性陽性對照siRNA采用確認(rèn)有效的siRNA，針對某些較容易檢測基因，如甘油醛3-磷酸脫氫酶（GAPDH）基因；用于確認(rèn)RNAi實(shí)驗(yàn)過程的有效性，包括轉(zhuǎn)染條件、檢

7、測方法是否可行等；陽性對照siRNA在RNAi實(shí)驗(yàn)初期或在新的轉(zhuǎn)染體系進(jìn)行RNAi實(shí)驗(yàn)時很重要，容易被忽視，缺乏陽性對照siRNA，實(shí)驗(yàn)出問題無法找原因，耽誤時間。(4) siRNA熒光標(biāo)記的問題熒光標(biāo)記的問題采用熒光標(biāo)記的siRNA可以用來確定轉(zhuǎn)染效率和優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，這種方法操作快速，實(shí)驗(yàn)費(fèi)用也不高，但由于熒光標(biāo)記的siRNA攝入與siRNA導(dǎo)致的抑制效果時常會出現(xiàn)不相關(guān)性，這種情況在某些細(xì)胞系和應(yīng)用某些轉(zhuǎn)染試劑時，如脂質(zhì)體時更為嚴(yán)重。因此在應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件時，不推薦使用熒光標(biāo)記的siRNA。5.RNAi Off-target(脫靶效應(yīng)脫靶效應(yīng))(1) 什么是RNAi Off-

8、target(脫靶效應(yīng))?(2) 脫靶效應(yīng)如何檢測？(3) siRNA濃度是否和脫靶效應(yīng)相關(guān)？(4) 轉(zhuǎn)染試劑是否也會造成脫靶效應(yīng)？(5) 如何避免脫靶效應(yīng)？(1) RNAi Off-target(脫靶效應(yīng)脫靶效應(yīng))是什么？是什么？RNAi Off-target(脫靶效應(yīng))：簡單地說，就是siRNA轉(zhuǎn)染中的非特異反應(yīng)，這不僅包括siRNA序列，還包括轉(zhuǎn)染試劑本身或其他相關(guān)因素對轉(zhuǎn)染細(xì)胞的其他相關(guān)基因發(fā)生非特異性的表達(dá)變化，從而導(dǎo)致假陽性和假陰性。目前已廣泛引起研究者重視。(2) 脫靶效應(yīng)如何檢測？脫靶效應(yīng)如何檢測？多種方法可以用于預(yù)測和檢測脫靶效應(yīng)，最常見的方法是基因表達(dá)譜芯片的方法。(3)

9、siRNA濃度是否和脫靶效應(yīng)相關(guān)？濃度是否和脫靶效應(yīng)相關(guān)？以前認(rèn)為高濃度會產(chǎn)生脫靶效應(yīng)，實(shí)際上低濃度同樣會產(chǎn)生脫靶效應(yīng)。(4) 轉(zhuǎn)染試劑是否也會造成脫靶效應(yīng)？轉(zhuǎn)染試劑是否也會造成脫靶效應(yīng)？有人采用基因芯片檢測對轉(zhuǎn)染試劑造成的細(xì)胞基因表達(dá)影響發(fā)現(xiàn)，某脂質(zhì)體L2K可以引發(fā)1908個基因的表達(dá)變化，既包括下調(diào)，也包括上調(diào)。如果恰好轉(zhuǎn)染試劑本身會導(dǎo)致某基因表達(dá)上調(diào)，可能出現(xiàn)轉(zhuǎn)染siRNA后該基因可能會出現(xiàn)表達(dá)不變甚至增強(qiáng)的現(xiàn)象，從而出現(xiàn)假陰性現(xiàn)象，如果恰好轉(zhuǎn)染試劑本身會導(dǎo)致某基因表達(dá)下調(diào)，則會出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象。(5) 如何避免脫靶效應(yīng)？如何避免脫靶效應(yīng)？脫靶效應(yīng)并不能絕對避免，但可以采取措施減少脫靶效應(yīng)

10、的發(fā)生，如針對同一靶基因設(shè)計(jì)2條以上抑制效率在70以上的不同siRNA序列，分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，可避免siRNA造成的脫靶效應(yīng)；采用不同轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)可避免轉(zhuǎn)染試劑造成的脫靶效應(yīng)等。6.轉(zhuǎn)染是轉(zhuǎn)染是RNAi實(shí)驗(yàn)的瓶頸實(shí)驗(yàn)的瓶頸 轉(zhuǎn)染是siRNA實(shí)驗(yàn)的瓶頸，轉(zhuǎn)染質(zhì)量的好壞直接關(guān)系RNAi實(shí)驗(yàn)的成敗。(1) 選擇轉(zhuǎn)染方法的原則(2) siRNA轉(zhuǎn)染的方法(3) siRNA轉(zhuǎn)染試劑的主要種類(4) 脂質(zhì)體(5) 非脂質(zhì)體聚合物類(1) 選擇轉(zhuǎn)染方法的原則選擇轉(zhuǎn)染方法的原則高轉(zhuǎn)染效率：較高的轉(zhuǎn)染效率可以取得更好的抑制效果，更有利于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的觀察；低細(xì)胞毒性：因?yàn)镽NAi是抑制性實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)染試劑的毒性多導(dǎo)致細(xì)

11、胞凋亡等結(jié)果，這種結(jié)果是對細(xì)胞正常生理功能嚴(yán)重干擾（主要表現(xiàn)為抑制），細(xì)胞無法進(jìn)行正常轉(zhuǎn)錄表達(dá)而出現(xiàn)凋亡。轉(zhuǎn)染試劑的毒性不僅干擾細(xì)胞正常的生理狀態(tài)，甚至還可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果；方法簡單、操作簡單：越簡單，操作越少的實(shí)驗(yàn)過程，自然出錯的機(jī)會就少，重復(fù)性就好，工作量也少；成本較低：由于siRNA轉(zhuǎn)染需要篩選有效的siRNA，有效siRNA后續(xù)大量研究還需要不斷進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染，siRNA轉(zhuǎn)染的成本尤其是轉(zhuǎn)染試劑的成本在實(shí)驗(yàn)開始之初就需要充分考慮。(2) siRNA轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染的方法到目前為止，轉(zhuǎn)染的方法主要采用化學(xué)方法，化學(xué)方法不能轉(zhuǎn)染的采用電轉(zhuǎn)化等物理方法。(3) siRNA轉(zhuǎn)染試劑的主要種類轉(zhuǎn)

12、染試劑的主要種類脂質(zhì)體類非脂質(zhì)體聚合物類(4) 脂質(zhì)體脂質(zhì)體開發(fā)較早，主要針對轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA等大分子開發(fā)，現(xiàn)在也被改良用于siRNA的轉(zhuǎn)染；適合siRNA與質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)以及一些對毒性要求不高的siRNA轉(zhuǎn)染；代表產(chǎn)品有invitrogen公司的lipofectamineTM 2000和RNAiMAX。(5) 非脂質(zhì)體聚合物類非脂質(zhì)體聚合物類為克服脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的毒性，并提高轉(zhuǎn)染效率而開發(fā)，現(xiàn)在已從高分子聚合物類發(fā)展到納米聚合物，這兩年默克（Merck）、Qiagen和Clontech均相繼推出了納米聚合物類的轉(zhuǎn)染試劑。英格恩生物(Engreen Biosystem)也推出了納米聚合物轉(zhuǎn)染試劑En

13、transterTM系列，其中EntransterTM-R專用于siRNA轉(zhuǎn)染。第三部分第三部分siRNA轉(zhuǎn)染過程相關(guān)問題及解答轉(zhuǎn)染過程相關(guān)問題及解答1.siRNA轉(zhuǎn)染過程相關(guān)問題2.siRNA轉(zhuǎn)染疑問解答1.siRNA轉(zhuǎn)染過程相關(guān)問題轉(zhuǎn)染過程相關(guān)問題(1) 轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)量的問題(2) 轉(zhuǎn)染時siRNA工作濃度(3) 轉(zhuǎn)染時血清的問題(4) 轉(zhuǎn)染時抗生素的問題(5) 轉(zhuǎn)染過程(6) 轉(zhuǎn)染后換液的問題(7) 轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化的問題(8) RNAi效應(yīng)檢測方法(1) 轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)量的問題轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)量的問題細(xì)胞數(shù)量：以轉(zhuǎn)染時，細(xì)胞的匯合度在20-40為宜，這個匯合度比通常DNA轉(zhuǎn)染的匯合度要小，這是因?yàn)檗D(zhuǎn)染

14、后需要培養(yǎng)的時間通常比DNA轉(zhuǎn)染的時間要長，同時較低的細(xì)胞數(shù)量也有利于提高抑制效率。需要注意的是：轉(zhuǎn)染時細(xì)胞的匯合度（細(xì)胞數(shù)量）會對RNAi結(jié)果產(chǎn)生一定的影響。一些轉(zhuǎn)染試劑，如脂質(zhì)體，需要的匯合度會高一些，這是為了減輕轉(zhuǎn)染試劑的毒性，一般來說，細(xì)胞數(shù)量較少更能提高抑制效率。(2) 轉(zhuǎn)染時轉(zhuǎn)染時siRNA工作濃度工作濃度siRNA濃度：需要根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)的優(yōu)化。過低的siRNA濃度達(dá)不到相應(yīng)的抑制效果，過高的siRNA濃度可能會引起一些非特異的改變。需要注意的是這里siRNA濃度指siRNA在反應(yīng)時的終濃度，也就是以轉(zhuǎn)染時細(xì)胞的總體積來計(jì)算的。一般siRNA的有效反應(yīng)濃度在10nM-20

15、0nM。需要注意的是：siRNA的分子量，對21nt雙鏈siRNA oligo來說，平均分子量約為13300g/mol，合成siRNA其OD值和nmol換算關(guān)系由于OD值受產(chǎn)物中其他成分影響，如熒光標(biāo)記、純度等，具體請?jiān)儐柡铣晒?，一?OD duplex2.5-5 nmols33-66 ug。 (3) 轉(zhuǎn)染時血清的問題轉(zhuǎn)染時血清的問題一些轉(zhuǎn)染試劑要求在轉(zhuǎn)染前換無血清培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染后4-6h再更換成有血清培養(yǎng)基，這其實(shí)是為了減輕轉(zhuǎn)染造成的細(xì)胞毒性。較好的轉(zhuǎn)染試劑，如英格恩公司的EntransterTM-R采用有血清轉(zhuǎn)染，不用在有血清和無血清之間更換，增加工作量，同時有血清轉(zhuǎn)染不僅不造成細(xì)胞毒性，

16、甚至還有助于提高轉(zhuǎn)染效率。(4) 轉(zhuǎn)染時抗生素的問題轉(zhuǎn)染時抗生素的問題一些轉(zhuǎn)染試劑，如脂質(zhì)體，需要在轉(zhuǎn)染時采用無抗生素培養(yǎng)基，這是由于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染會同時將培養(yǎng)基的一些成份包括抗生素也帶進(jìn)細(xì)胞，造成細(xì)胞毒性。較好的轉(zhuǎn)染試劑，如英格恩公司的EntransterTM-R，由于不會將抗生素帶進(jìn)細(xì)胞，所以可以采用有抗生素轉(zhuǎn)染，避免細(xì)胞污染。(5) 轉(zhuǎn)染過程轉(zhuǎn)染過程轉(zhuǎn)染過程：轉(zhuǎn)染的過程其實(shí)很簡單。一般是分別稀釋轉(zhuǎn)染試劑和siRNA，然后二者混合，滴加到細(xì)胞表面，然后細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)。這點(diǎn)根據(jù)不同轉(zhuǎn)染試劑的Protocol操作即可。(6) 轉(zhuǎn)染后換液的問題轉(zhuǎn)染后換液的問題一些轉(zhuǎn)染試劑要求在轉(zhuǎn)染后4-6h換液，其目

17、的就是去除在培養(yǎng)基中的游離轉(zhuǎn)染試劑，減輕細(xì)胞毒性。較好的轉(zhuǎn)染試劑，如英格恩公司的EntransterTM-R，大多數(shù)情況下無需轉(zhuǎn)染后4-6h換液，只需第二天正常換液即可，減少了工作量，尤其大大減輕下午轉(zhuǎn)染，夜里還需要換液的工作量。(7) 轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化的問題轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化的問題優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件不僅是為得到最高的基因抑制效率，更重要的是降低轉(zhuǎn)染各條件對細(xì)胞的毒性。優(yōu)化的方面主要有：轉(zhuǎn)染試劑的用量、siRNA的用量、轉(zhuǎn)染時細(xì)胞密度、轉(zhuǎn)染的過程（培養(yǎng)基、抗生素對細(xì)胞的影響），轉(zhuǎn)染后細(xì)胞多長時間換液等。(8) RNAi效應(yīng)檢測方法效應(yīng)檢測方法mRNA水平：最簡單和靈敏的檢測方法是用qRT-PCR，一般在轉(zhuǎn)染后24h-48h檢測。蛋白水平：常見的是Western Blot、免疫熒光