薄層色譜技術(shù)

1、1. 薄層色譜技術(shù) 概 述 中藥是祖國(guó)醫(yī)藥寶庫(kù)的重要組成部分，是祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)賴以防病治病的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。中藥的真?zhèn)蝺?yōu)劣直接關(guān)系到人民用藥的安全和有效。在檢驗(yàn)中藥真?zhèn)畏矫嫱ǔ２捎玫臋z測(cè)手段有形態(tài)鑒別、理化鑒別和光譜色譜分析等。而作為色譜技術(shù)一個(gè)分支的薄層色譜由于其獨(dú)具的長(zhǎng)處而被廣泛應(yīng)用于中藥分析。層鑒別作為法定的檢驗(yàn)項(xiàng)目是各級(jí)藥品檢驗(yàn)部門(mén)和藥品生產(chǎn)、經(jīng)營(yíng)部門(mén)的質(zhì)檢人員檢驗(yàn)中藥的強(qiáng)制性檢驗(yàn)項(xiàng)目。在可預(yù)見(jiàn)的將來(lái)，薄層色譜技術(shù)仍將是中藥鑒別最主要的手段之一 。 無(wú)須贅言，如同其它色譜技術(shù)一樣，一個(gè)樣品分析結(jié)果好壞，取決于能否得到一個(gè)分離度和重現(xiàn)性良好的色譜。為了更好地執(zhí)行國(guó)家藥典中藥薄層鑒別項(xiàng)目，中藥

2、檢驗(yàn)室基本設(shè)備和配套和檢驗(yàn)人員操作技術(shù)的規(guī)范化是獲得較高質(zhì)量的薄層色譜最基本的要求。 薄層色譜分析與其他色譜分析相比，其顯著不同之一是得到的圖譜是直觀性很強(qiáng)的圖象。一個(gè)比較復(fù)雜的中藥薄層色譜，尤其是成分未明而斑點(diǎn)較多的薄層色譜往往是很難用文字描述的；何況藥典正文因體例的限制，也不可能作過(guò)多的文字?jǐn)⑹觥?關(guān)于同一品種的藥材商品的個(gè)體差異，如何判斷的問(wèn)題。在實(shí)際的樣品分析中，的確存在著由于商品個(gè)體差異，致使薄層色譜難以和對(duì)照藥材和色譜完全吻合。其實(shí)，在藥材的形態(tài)鑒別中，這是司空見(jiàn)慣的問(wèn)題，只要鑒別特征可靠，基礎(chǔ)工作比較扎實(shí)，一般不會(huì)由于個(gè)體之間的形態(tài)差異而無(wú)法判斷。因?yàn)橥黄贩N的不同個(gè)體雖然有差異

3、（即使對(duì)照藥材也有這個(gè)問(wèn)題），但是既然是同一品種，也必然存在著共性特征。外在的形態(tài)是如此，反映內(nèi)在成分的色譜也是如此。譬如有無(wú)牲成分就是共性，如黃連均含小檗堿，小檗堿的有無(wú)固名可以作為黃連真?zhèn)舞b別的依據(jù)，但小檗堿未必就是黃連的問(wèn)題。所以觀察完整的色譜結(jié)合特征成分的辨認(rèn)，就進(jìn)一步提高了鑒別的準(zhǔn)確度；經(jīng)過(guò)比較，取大同棄小異，做出合理的判斷。對(duì)于分布地區(qū)廣泛，商品規(guī)格較多的品種，需要反復(fù)比較；有些品種個(gè)體之間成分變異較大，需要做大量的基礎(chǔ)研究，掌握規(guī)律，方可設(shè)立對(duì)照藥材，不能一蹴而就，所以藥典中并非所有的品種都設(shè)有對(duì)照藥材。在中藥制劑中，由于制備工藝的不同或成分之間的相互干擾，圖譜常常不能與原藥材的

4、色譜完全吻合，這就是更需要分析人員有較強(qiáng)的判斷能力 -器材與操作薄層板 可用預(yù)制板或手工自制板，目前最常用的仍然是手工自制板。用于制備薄層板的玻璃要求表面光潔、平整，最好使用厚薄12mm的優(yōu)質(zhì)平板玻璃，普通玻璃一般不宜制作薄層板，玻璃板需洗凈至不掛水，晾干，貯存于干燥潔凈處備用。玻璃板反復(fù)使用時(shí)，應(yīng)注意經(jīng)常用洗液及堿液清洗，保持玻璃板面的光潔是保證薄層板質(zhì)量的最起碼要求，如選用預(yù)制板應(yīng)注意生產(chǎn)廠家提供的有關(guān)參數(shù)，經(jīng)挑選，試用是否符合要求。 涂布器 應(yīng)能使吸附劑在玻璃板上涂成一層符合厚度要求的均勻薄層。涂層的工具有手工、半自動(dòng)、全自動(dòng)薄層涂布器。 點(diǎn)樣器材 最常用也最方便的是定量點(diǎn)樣毛細(xì)管（微升

5、毛細(xì)管），規(guī)格有0.5ul、1.0ul、2.0ul、5.0ul、10ul等多種。選用時(shí)要求標(biāo)示容量準(zhǔn)確，管端平整光滑，管壁潔凈，液流通暢，無(wú)堵塞，無(wú)污染。也可使用色譜用的微量移液管或薄層用微升注射器。 為了提高點(diǎn)樣效率，還可以選用點(diǎn)樣輔助設(shè)備，如點(diǎn)樣支架，半自動(dòng)或自動(dòng)點(diǎn)樣器。先用點(diǎn)樣器材和輔助設(shè)備應(yīng)注意器材本身的質(zhì)量，依賴劣質(zhì)的器材不能保證點(diǎn)樣的質(zhì)量。一般的概念定性鑒別沒(méi)有定量的要求，但為了對(duì)樣品在定性鑒別時(shí)能同時(shí)給以“量化”評(píng)價(jià)，點(diǎn)樣要求最好還是用定量的點(diǎn)樣器材。 展開(kāi)箱（層析缸） 應(yīng)當(dāng)用薄層色譜專用的展開(kāi)箱，展開(kāi)箱有水平式及直立式兩種類型；日常用的最多的是直立式展開(kāi)箱，它又分為平底展開(kāi)箱和

6、雙槽展開(kāi)箱。雙-槽展開(kāi)箱具有節(jié)省溶劑、便于平衡、可控制展開(kāi)箱內(nèi)的濕度等優(yōu)點(diǎn)，推薦使用此種展開(kāi)箱。水平式展開(kāi)箱需要使用預(yù)制板或“加固”的自制板（如加羧甲基纖維素鈉），用水平式展開(kāi)箱還可以從薄層板的兩側(cè)向中間展開(kāi)，這樣可使一塊薄層板所承受的樣品個(gè)數(shù)比常規(guī)上行展開(kāi)的薄層板增加一倍，但是由于展距短（約5cm），所以適合于高效預(yù)制板。 用不合規(guī)格的玻璃器皿，如生物標(biāo)本缸等不能保證展開(kāi)的質(zhì)量。 顯色與檢測(cè)儀器 載有樣品的薄層板展開(kāi)后，有的需要用某些試劑（如顯色劑）使之顯色。涂布顯色劑的方法有噴霧法及浸漬法。噴霧用的噴霧瓶應(yīng)能在一定壓力下使試劑噴成均勻的細(xì)霧狀。浸漬法用的浸漬為特制的扁平玻璃槽，使用時(shí)，將展

7、開(kāi)后的薄層板平穩(wěn)垂直地放入浸漬槽中一至數(shù)秒鐘后取出，揩凈薄層板背面殘余的試劑（需要時(shí)加熱）使之顯色。通常使用最多的仍然是噴霧法。 觀察薄層色譜用的紫外燈裝有長(zhǎng)波段（365nm）和短波段（254nm）紫外光管兩種。前者用于觀察具有熒光的色譜，后者一般用于觀察硅膠GF254板在熒光背景下熒光淬滅斑點(diǎn)。選用紫外光應(yīng)注意熒光管的功率和濾光片的規(guī)格。 薄層掃描不僅可供薄層色譜的原位定量測(cè)定，薄層掃描圖對(duì)定性鑒別也能提供有用的信息。 薄層板的制備 除另有規(guī)定外，將1份吸附劑加適量的水（如1份硅膠G一般加3份水），在研缽中用杵沿一個(gè)方向小心研磨至成均勻的有適當(dāng)粘稠度的膠漿，立即傾入涂布器中，均勻地向前推進(jìn)涂

8、布在玻璃板上；或按照不同涂布器的規(guī)定操作涂布；涂布好的薄層板于室溫下在水平臺(tái)上晾干，再在規(guī)定的溫度（一般為105110）下烘約30分鐘活化，貯于干燥器中備用。應(yīng)當(dāng)注意的是不同廠家或不同批號(hào)的硅膠G質(zhì)量不一，要求的加水量和研磨時(shí)間的長(zhǎng)短有所不同，如加有其它改性劑更是如此，宜在操作中細(xì)心體會(huì)。薄層的厚度一般為0.20.3nm，由于國(guó)產(chǎn)商品硅膠的顆粒大小分布較寬（1040um），特別用顆粒較粗的硅膠，涂布的太薄反而降低分離能力，所以有的品種（如人參）要求用0.5mm厚的薄層板。薄層板一般要求新鮮制備，當(dāng)天使用。使用前應(yīng)在反射光和透射光下檢查板面是否均勻；板面不均勻、有氣泡或有麻點(diǎn)、破損或已污染如灰塵

9、日光下檢查、纖維紫外光燈下檢查者應(yīng)棄去不用。 點(diǎn)樣 除加有規(guī)定外，按規(guī)定用微升毛細(xì)管（或其它符合要求的點(diǎn)樣的工具）分別吸取供試液或?qū)φ找?，以垂直的方向小心接觸薄層板面，做點(diǎn)狀點(diǎn)樣或條帶狀點(diǎn)樣。點(diǎn)樣基線與底邊距離，相距11.5cm，高效板810mm.，圓點(diǎn)直徑一般不大于3mm,高效板一般不大于2mm。如點(diǎn)樣量較大或?yàn)榱烁纳品蛛x度，也可點(diǎn)成510mm狹細(xì)的窄長(zhǎng)條帶，高效板為48mm（長(zhǎng)度視情況而不同），點(diǎn)樣時(shí)須注意盡量不要損傷薄層板面，如條帶點(diǎn)樣，應(yīng)注意條帶的均勻；預(yù)制板或加固的自制板，用專門(mén)的條帶點(diǎn)樣器械（如噴霧狀條帶點(diǎn)樣器），可保證點(diǎn)樣的質(zhì)量。點(diǎn)間距離可視斑點(diǎn)擴(kuò)散情況以相鄰斑點(diǎn)不相干擾為宜，一

10、般不少于8mm,高效板不少于5mm. 點(diǎn)樣后的薄層板置入加有展開(kāi)劑的展開(kāi)箱（層析缸）中，密閉，上行展開(kāi)，薄層板浸入展開(kāi)劑中的深度一般要求溶劑的液面距原點(diǎn)約0.51cm，展開(kāi)至815cm(高效板58cm)后，立即將薄層板取出，晾干，以備檢測(cè)。如規(guī)定在展開(kāi)前需將展開(kāi)箱用展開(kāi)劑或規(guī)定的溶劑預(yù)平衡者，可在雙槽展開(kāi)箱的一側(cè)加入適量的溶劑，密閉放置1530分鐘后，再將薄層板放入展開(kāi)箱中展開(kāi)。一般可將薄層板置于展開(kāi)箱中一起飽和。 展開(kāi)劑要求新鮮配制，不要多次反復(fù)使用。展開(kāi)劑如需分層，則按要求放置分層后分取需要的一相（上層或下層），備用。 檢測(cè) 色譜斑點(diǎn)本身有顏色者可直接在日光下觀察可見(jiàn)光譜，斑點(diǎn)在紫外光激發(fā)

11、下可發(fā)射熒光者，可直接在紫外光燈下觀察熒光色譜；需加試劑方能顯色或發(fā)射熒光者，則需將試劑均勻噴灑于薄層板面，直接觀察或加熱顯色后觀察。用浸漬法，板面顯色均勻是其優(yōu)點(diǎn)，但有的樣品經(jīng)試劑浸漬后，斑點(diǎn)容易被浸潤(rùn)擴(kuò)散，或產(chǎn)生拖尾。加熱顯色者須注意加熱時(shí)間和溫度，尤其含羧甲基纖維素鈉的薄層板，加熱溫度過(guò)高或加熱時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，容易引起板面的焦化，如用硫酸等顯色劑，更易造成板面的炭化而影響顯色的效果（需要加熱顯色的將薄層板放在烤箱下層）。有的成分加試劑后，如揮發(fā)油成分經(jīng)香草醛硫酸顯色，加熱溫度和時(shí)間長(zhǎng)短不同或放置時(shí)間不同無(wú)援可能使斑點(diǎn)的顯色有所改變。 有的品種可熏以試劑或試液的蒸氣（如碘蒸氣、氨蒸氣）顯色。 必

12、要時(shí)，可進(jìn)行薄層掃描，掃描圖譜不僅用于定量測(cè)定，對(duì)于定性鑒別也很有用。 小結(jié) 1. 羧甲基纖維素鈉水溶液的配制：一般為0.5%的羧甲基纖維素鈉，由于羧甲基纖維素鈉比較難溶，可將其煮沸或靜置幾天使其溶解。使用前將溶液過(guò)濾，這樣鋪的板麻點(diǎn)比較少。2. 固定相和流動(dòng)相混合：先調(diào)好濃度，混合液大致混勻后，將研磨棒拿起一定高度，若液體流下成線，則濃度適中，反之則太稀。調(diào)好濃度后研磨15-20分鐘，在再超聲15-20分鐘。研磨時(shí)要?jiǎng)蛩佟?. 鋪板時(shí)要?jiǎng)蛩伲伒每靹t板厚，鋪得慢則較薄。4. 展開(kāi)劑如果需要分層，最好分久一些（20分鐘以上，宮炎平則需要1小時(shí)以上），這樣展開(kāi)的效果會(huì)比較好。配制時(shí)要看清楚所需的

13、溫度，是要上層還是下層。例如復(fù)方丹參片鑒別展開(kāi)劑需要10度以下分層，展開(kāi)劑放到展開(kāi)缸中后需放置10分鐘使溫度達(dá)到室溫再展開(kāi)。5. 點(diǎn)樣的大小需要經(jīng)驗(yàn)來(lái)掌握，有的需要很小，例如咳特靈片的鑒別；有的要一針到底；如宮炎平的鑒別；比較稠的需要點(diǎn)成條帶狀防止拖尾。必要的時(shí)候可以點(diǎn)一個(gè)小的圓點(diǎn)，再點(diǎn)一個(gè)條帶狀的點(diǎn)。-影響薄層色譜分析的主要因素常規(guī)薄層色譜由于同板同時(shí)可以檢測(cè)多個(gè)樣品，分析時(shí)間短，固定相（吸附劑）價(jià)廉，即用即棄，不必?fù)?dān)心樣品中雜質(zhì)的污染，檢測(cè)不受溶劑的干擾，色譜的直觀性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)而在中藥分析方面被廣泛使用。另一方面因?yàn)樗且环N“敞開(kāi)系統(tǒng)”的色譜技術(shù)，與柱色譜的區(qū)別之一是除材料及器材以外，外界環(huán)

14、境條件對(duì)被分離的物質(zhì)的層析行為影響很大，分離機(jī)制也很復(fù)雜；其次是由于分析的全過(guò)程是橫向的離線多步驟操作，所以操作技巧也明顯的影響色譜質(zhì)量；因而薄層色譜，尤其是常規(guī)薄層色譜，又被視為是一種較難駕馭的技術(shù)。為了充分發(fā)揮薄層色譜技術(shù)在中藥分析方面的優(yōu)勢(shì)，提高色譜的分離度和重現(xiàn)性，注意控制影響色譜質(zhì)量的因素是非常重要的。以下所述的幾個(gè)方面不僅對(duì)定量分析是必須注意的問(wèn)題，對(duì)提高定性分析的質(zhì)量也是不可忽視的。 樣品的預(yù)處理及供試液的制備 一般認(rèn)為薄層色譜所用的固定相（薄層板）可即用即棄，不怕供試液中雜質(zhì)的污染，因而樣品無(wú)需凈化精制，這是問(wèn)題的一個(gè)方面；在實(shí)踐中，由于中藥的成分復(fù)雜，未知成分多，供試液中溶出

15、的物質(zhì)較多，其中既有欲測(cè)成分也有其他“雜質(zhì)”，常常由于相互干擾或背景污染而難以得到滿意的分離效果，甚至難以辨認(rèn)，尤其是成方制劑更是如此。這是問(wèn)題的另一方面，所以在許多情況下為了得到一個(gè)重要的有時(shí)甚至是關(guān)鍵的步驟。制備樣品供試液得以凈化，往往是一個(gè)重要的有時(shí)甚至是關(guān)鍵的步驟。制備樣品供試液所用的溶劑一般要求溶解度不宜太大，粘度不宜太高，沸點(diǎn)適中，而對(duì)于中藥材又常常希望將成分盡可能多的被提取出來(lái)，所以最常被選用的是甲醇或乙醇，因此欲測(cè)成分和許多其它“雜質(zhì)”均被提取出來(lái)，供試液的凈化就顯得更為必要。例如：復(fù)方丹參中的三七的鑒別。 樣品供試液凈化的方法： 1、單一溶劑萃取法，如浙貝母、平貝母、華山參、

16、洋金花等均利用在堿性介質(zhì)下用氯仿或苯將其生物堿有選擇地萃取出而舍棄其它成分。 使試液得以凈化。 2、分段萃取法，如龍膽瀉肝丸先用正已烷萃取，供當(dāng)歸鑒別用；繼用丙酮萃取，供用以鑒別馬兜鈴酸（關(guān)木通）；最后用甲醇萃取再經(jīng)氧化鋁小柱甲醇洗脫，以鑒別龍膽苦甙，是利用了各自不同的溶解度，有不同極性的溶劑分段萃取，達(dá)到樣品供試液凈化的目的。 3、液液萃取法。 4、固液萃取法，如八珍丸、牛黃上清丸、烏雞白鳳丸、導(dǎo)赤丸等均先用硅藻土研勻，在固態(tài)下用溶劑萃取，以去除蜜糖的干擾。嚴(yán)格地講，這仍屬于單一黨課萃取。真正的固液萃取是固定相為固態(tài)，如將樣品的水提液（固定相）加入硅藻土小柱中使之成為“固態(tài)”，再用適當(dāng)?shù)娜軇?/p>

17、（移動(dòng)相）通過(guò)硅藻土小柱萃取，萃取液再經(jīng)濃縮等處理后作為供試液。用固液萃取或洗脫的方法制備樣品是色譜分析常用的方法，目前常用的還有化學(xué)鍵合相小柱以及硅膠小柱、氧化鋁小柱，如青葉膽、黃芪、斷血流、烏雞白鳳丸（芍藥甙）、龍膽瀉肝丸、參苓白術(shù)散（人參與甘草）、首烏丸（補(bǔ)骨脂）等。此外，益母草是用活性炭和中性氧化鋁小柱，國(guó)公灑（辛弗林）用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱。用氧化鋁須注意顆粒不可堿度粗或太細(xì)（一般可用100200目），活性能保持在23級(jí)，用適當(dāng)?shù)牟Ａ≈ㄈ?ml及10ml注射針筒）裝填。氧化鋁吸附力較強(qiáng)，選用時(shí)應(yīng)有針對(duì)性。 薄層色譜的上樣技術(shù) 上樣（點(diǎn)樣）是薄層色譜分析的第一步，也是非常關(guān)鍵的一步。蛇

18、既關(guān)系到通融得到可以重現(xiàn)的有良好分離度的薄層色譜，也關(guān)系到定量測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確，因?yàn)椴涣嫉纳蠘邮亲钪饕恼`差來(lái)源。 1、薄層板的原點(diǎn)位置對(duì)樣品容積的負(fù)荷量是極為有限的，如上樣容積過(guò)大將明顯降低分離效率。中藥供試液中一般被測(cè)成分與“雜質(zhì)”共存，尤其是被測(cè)成分含量較低而其他干擾物質(zhì)較為大量時(shí)，常常習(xí)慣于或不得不加大點(diǎn)樣的容積，另一方面也是由于對(duì)上樣容積超負(fù)荷的嚴(yán)重后果認(rèn)識(shí)不足?，F(xiàn)代商品預(yù)制板硅膠顆粒細(xì)（常規(guī)預(yù)制板1112um，高效預(yù)制板57um）而均勻，明顯提高了分離的效率，對(duì)上樣的要求更高了。如常規(guī)預(yù)制板展距100mm，原點(diǎn)直徑3mm，展開(kāi)后如斑點(diǎn)直徑擴(kuò)散到6mm，則斑點(diǎn)容量或稱分離數(shù)SN=10，

19、而用高效預(yù)制板原點(diǎn)直徑1mm，展開(kāi)50mm，斑點(diǎn)直徑如擴(kuò)散為2mm，則SN=50。但如果上樣量不適當(dāng)?shù)丶哟螅缭诟咝О迳显c(diǎn)直徑點(diǎn)成3mm，展開(kāi)50mm后斑擴(kuò)散為4mm，結(jié)果SN=6，即使用延長(zhǎng)展距至100mm，SN也僅僅達(dá)到11，還可能達(dá)到15。由此可見(jiàn)即使用高質(zhì)量的薄層板，如上樣容積不適當(dāng)?shù)丶哟?，分辨率也同樣不?huì)得到提高。這就是為什么要求點(diǎn)樣原點(diǎn)直徑應(yīng)盡量小于3mm的原因。 2、溶解樣品的黨課均有不同程度的洗脫力，所以在上樣的同時(shí)，樣品在原點(diǎn)位置就呈環(huán)形展開(kāi)，原點(diǎn)直徑的擴(kuò)散促進(jìn)了這種展開(kāi)，即所謂“上樣環(huán)形色譜效應(yīng)”如樣品在溶劑中溶解度度很大，原點(diǎn)將變成空心圈，這種效應(yīng)對(duì)隨后的線性展開(kāi)造成很

20、不利的影響。所以原則通過(guò)上應(yīng)選擇對(duì)被測(cè)成分可以溶解但溶解度不是很大的溶劑，中藥成分復(fù)雜，難以兼顧，不可能面面俱到，通常在欲測(cè)成分不甚清楚或欲測(cè)成分覆蓋的極性范圍很寬的情況下，寧愿選擇溶解“范圍”較寬的溶劑，如甲醇、乙醇等。有的品種欲測(cè)成分明確，如苦參、貝母中的生物堿、白術(shù)中的蒼術(shù)酮等可有針對(duì)性地選擇溶劑。有的品種選用了乙醚，由于乙醚沸點(diǎn)很低，最終的供試液則需要低溫?fù)]去乙醚后，改用其他合適的溶劑制成。 3、供試液的溶劑在原點(diǎn)的殘留，也會(huì)改變展開(kāi)的選擇性，特別是供試液的溶劑極性與展開(kāi)劑的溶劑極性相差較大時(shí)更為明顯；再者，親水性溶劑殘留在原點(diǎn)吸收大氣中的水分（特別在高濕度環(huán)境）對(duì)色譜質(zhì)量的影響也可可

21、低估因此上樣時(shí)同步干燥或上樣后繼后干燥以除去原點(diǎn)殘存的溶劑是需要的。但應(yīng)盡可能避免高溫加熱，以免遇熱不穩(wěn)定的成分的破壞或促進(jìn)硅膠有催化作用的活性表面起固態(tài)化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致樣品中某些成分的變性。 4、上樣裝置（微升毛細(xì)管或色譜注射器）對(duì)薄層的機(jī)械損傷對(duì)色譜質(zhì)量尤其是對(duì)定量分析將帶來(lái)災(zāi)難性的影響。特別是已載有樣品的硅膠表面顆粒被劃傷和刮除后果就更嚴(yán)重。一個(gè)壁厚0.02mm外徑0.3mm的注射針頭在薄層表面施加5g的機(jī)械力，表面局部承受的壓力為30巴，足以造成硅膠薄層表面的損傷，對(duì)棉布較軟的硅膠G薄層板損傷更嚴(yán)重。對(duì)如硅膠G這種軟板雖然劃傷表面難以避免（所以不太適合定量分析），但點(diǎn)樣時(shí)小心操作把損傷降

22、低到最低限度還是可以做到的。近年來(lái)上樣器械和上樣技術(shù)的不斷更新和改進(jìn)已恰外樣質(zhì)量得到很大的提高。 提高上樣操作水平是獲得高質(zhì)量的色譜關(guān)鍵之一，一個(gè)組簡(jiǎn)單的樣品的鑒別比較容易，一般只要在同一薄層板上供試樣品與對(duì)照品在相同位置上顯相同的斑點(diǎn)就基本上達(dá)到目的。但成分復(fù)雜的中藥材樣品的鑒別除檢出特定成分以外，常常需要以整個(gè)色譜與對(duì)照藥材的色譜作比較，甚至要依靠薄層“指紋圖譜”才能達(dá)到準(zhǔn)確鑒別的目的。因此高質(zhì)量的上樣不僅是定量分析的需要，也常常是定性分析的要求。 -吸附劑的活性與相對(duì)濕度對(duì)薄層色譜的影響 吸附劑的活性是由表面能與表面積決定的。表面能越大，單位重量的表面積（比表面積）越大，吸附力越大，即活

23、性越高，反之，吸附力越小，活性越低。如硅膠之所以有吸附力，是由于其表面含眾多的硅醇基，硅醇基的活潑羥基及游離羥基與極性化合物或不飽化合物形成氫鍵所致。活潑型及游離型的硅醇基數(shù)目決定著硅膠的活性。硅醇基是親水基團(tuán)，很容易吸附水而成為水合硅醇基而失去活性。自制的薄層板在105110烘干，就是使水合硅醇基變?yōu)橛坞x硅醇基而活化；反之，活化后的硅膠薄層板可以吸附大氣中的水蒸氣分子而降低活性。也就是說(shuō)硅膠表面吸附水分的作用是可逆的，在不同的相對(duì)濕度下，可以達(dá)到不同程度的吸附平衡，在相對(duì)濕度改變的情況下會(huì)重新達(dá)到新的吸附平衡，而不論在此以前硅膠板是處于何種相對(duì)濕度狀態(tài)。在日常實(shí)踐中，當(dāng)活化后的硅膠（或氧化鋁

24、）薄層板從干燥器中取出，從準(zhǔn)備點(diǎn)樣到展開(kāi)前，薄層板是暴露在實(shí)驗(yàn)室的大氣中，薄層板的活性就取決于實(shí)驗(yàn)環(huán)境的相對(duì)濕度。其他條件相同的情況下，相對(duì)濕度對(duì)色譜質(zhì)量的影響是很明顯的。通常認(rèn)為薄層色說(shuō)的重現(xiàn)性差，薄層板處在不同的相對(duì)溫度下操作是主要原因之一。 有些樣品的成分和所選用的展開(kāi)劑對(duì)相對(duì)溫度有較寬的適應(yīng)能力，即對(duì)相對(duì)濕度的要求不甚嚴(yán)格，大致在相對(duì)濕度30%70%下得到相當(dāng)穩(wěn)定的色譜。有的樣品在環(huán)境條件（溫度和相對(duì)濕度）恰好適合的情況下，似乎不必控制條件也能把試驗(yàn)做好，但為了不同實(shí)驗(yàn)室之間及不同季節(jié)均可重現(xiàn)試驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)盡可能在相對(duì)濕度可控的條件下展開(kāi)為宜。至少必須記錄試驗(yàn)時(shí)實(shí)際的相對(duì)溫度。 相對(duì)溫度

25、的控制方法，可在雙槽展開(kāi)箱的一側(cè)槽中加入適當(dāng)濃度的硫酸，將點(diǎn)樣后的薄層板放入另一側(cè)槽中，密閉放置1530分鐘，再加展開(kāi)劑展開(kāi)；另一種方法是在預(yù)先準(zhǔn)備好條件控制箱（狀如平臥式展開(kāi)箱，內(nèi)盛適當(dāng)濃度的硫酸，或用大小適宜的干燥器）內(nèi)進(jìn)行。 控制相對(duì)濕度用的硫酸溶液如表1相對(duì)濕度 硫酸（ML） 水（ML） 32% 68 100 42% 57 100 58% 39.5 100 65% 34 100 72% 27.5 100 88% 10.8 100 硫酸D=1.86（）溶劑蒸氣在薄層色譜中的作用 薄層色譜與柱色譜的區(qū)別之一就是溶劑的蒸氣在相在展開(kāi)箱中也參與色譜展開(kāi)而形成三維的層析過(guò)程。展開(kāi)箱的氣體空間在層

26、析過(guò)程中起著重要的作用。 通常所謂的“展開(kāi)箱飽和”應(yīng)嚴(yán)格區(qū)分以下幾種情況： 5、展開(kāi)箱飽和：是指展開(kāi)前及展開(kāi)中溶劑系統(tǒng)中所有組分在展開(kāi)箱的整修氣體空間達(dá)到平衡，即達(dá)到飽和狀態(tài)；但在日常的實(shí)踐中，較少需要在“飽和”狀態(tài)下展開(kāi)，而只需用展開(kāi)劑（或規(guī)定的溶劑）的蒸氣在展開(kāi)箱中預(yù)平衡一定的時(shí)間，即本書(shū)中所稱的“預(yù)平衡”。 6、預(yù)吸附：通常是指薄層板的干燥板面（即未被溶劑濕潤(rùn)的部分）對(duì)展開(kāi)箱空間氣體分子任何程度的吸附，即通常所謂的“預(yù)飽和”。 7、吸附飽和：是指薄層板的未被溶劑濕潤(rùn)的部分與展開(kāi)箱的飽和氣體空間達(dá)到平衡狀態(tài)，即“完全飽和”，這是預(yù)吸附的極限狀態(tài)。 8、毛細(xì)管飽和：是指薄層板所有的自由空隙借

27、毛細(xì)管的作用被溶劑充滿的過(guò)程，即相當(dāng)于展開(kāi)完成后的狀態(tài)。 飽和和情況與展開(kāi)箱的類型有關(guān)，常老人家的平底展開(kāi)箱在展開(kāi)前較難達(dá)到展開(kāi)箱飽和，所以普通的做法是在內(nèi)壁加貼與之等寬等高的用溶劑濕潤(rùn)的濾紙，有助于達(dá)到飽和。用雙槽展開(kāi)箱在其一側(cè)槽中加溶劑可以較容易地達(dá)到吸附飽和和及展開(kāi)箱飽和。如用夾心式展開(kāi)箱，由于箱內(nèi)空間很小，展開(kāi)前因?yàn)榭臻g沒(méi)有溶劑分子，而且很難有空間擴(kuò)散，所以實(shí)際上是非飽和的。在這種非飽和和來(lái)心式展開(kāi)箱中薄層板不產(chǎn)生預(yù)吸附現(xiàn)象。通常誤認(rèn)為來(lái)心式展開(kāi)箱空間小很容易飽和，其實(shí)只有在展開(kāi)守成后才達(dá)到飽和，但這時(shí)對(duì)層析過(guò)程已不起作用。 在常規(guī)薄層色譜分析中，預(yù)吸附和吸附飽和對(duì)層析過(guò)程有很大的影響

28、。吸附劑表面的空間是很有限的，當(dāng)用多組分溶劑展開(kāi)時(shí)，不同溶劑分子在吸附區(qū)相互競(jìng)爭(zhēng)，發(fā)生“取代效應(yīng)”，尤其在薄層板的下部，一個(gè)級(jí)分的等溫吸附線會(huì)受到另外組分的性質(zhì)和相對(duì)飽和程度的影響。 如硅膠是親水性吸附劑，它首先對(duì)溶劑組分中的極性分子有更大的親合力，的以在吸附平衡的過(guò)程中，被吸附的各組分的濃度比與氣體空間的很不相同，與溶劑的液相組成差別更大?？梢韵胂笤诓患涌刂频那闆r下情況是很復(fù)雜的。簡(jiǎn)言之，薄層板在沒(méi)有預(yù)吸附時(shí)，混合溶劑系統(tǒng)中的一部分溶劑分子有選擇地被吸附在薄層板面上而形成固定相，同時(shí)在板上形成溶劑梯度從而直接影響層析過(guò)程，溶劑的蒸氣相、液相和固定相一起構(gòu)成了一個(gè)作用機(jī)制復(fù)雜的三維層析過(guò)程。

29、例如藥典收載的黃連生物堿的薄層鑒別，其展開(kāi)劑為苯-醋酸乙酯-甲醇-異丙醇-濃氨試液（6：3：11.5:0.5），其中的濃氨溶液實(shí)際上起著雙重的作用，氨是以蒸氣相在薄層板上預(yù)吸附參與使生物堿分離，在液相（展開(kāi)劑）中起作用的是水，如在雙槽展開(kāi)相的一側(cè)槽中加濃氨試液5ml，使展開(kāi)箱預(yù)平衡15分鐘，將展開(kāi)劑中的濃氨試液改為0.3ml水，可以得到相似的分離效果；如氨蒸氣的濃度不夠，分離度明顯降低;如展開(kāi)前不用氨蒸氣預(yù)平衡，直接展開(kāi)，則各生物堿斑點(diǎn)Rf值偏低，小檗堿、巴馬汀等均滯留在原點(diǎn)附近，難以預(yù)平衡直接展開(kāi)所得的色譜有明顯的不同，即經(jīng)預(yù)平衡后展開(kāi)的色譜分離度明顯提高，而且重現(xiàn)性良好。 關(guān)于薄層色譜的優(yōu)化及溶劑系統(tǒng)（展開(kāi)劑）的選擇 依靠色譜分離混合特質(zhì)需要解決的主要問(wèn)題有兩個(gè)：（1）相鄰物質(zhì)對(duì)的分離；（2）在一個(gè)寬極性范圍內(nèi)的多組分混合物的分離。就薄層色譜而言，解決這兩類不同的問(wèn)題，所需要的優(yōu)化技術(shù)是不同的。解決相鄰物質(zhì)的分離，主要就兩個(gè)相鄰物質(zhì)的理化性持，考慮選用正相薄層板還是反相薄層板，再考慮選用單一組成的展開(kāi)劑還是混合溶劑以及極性大小或酸堿性等，甚至考慮選用什么的展開(kāi)技術(shù)，如低Rf值的物質(zhì)對(duì)可考慮用U-型展開(kāi)箱，作徑向展開(kāi)等。對(duì)復(fù)雜混合物的分離，問(wèn)題要復(fù)雜得多，一般即使采用了梯度展開(kāi)技術(shù)，也不大可