微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)

1、【精品文檔】如有侵權(quán)，請聯(lián)系網(wǎng)站刪除，僅供學(xué)習(xí)與交流微生物學(xué)實(shí)驗(yàn).精品文檔.實(shí)驗(yàn)一 實(shí)驗(yàn)室和人體表面微生物的檢查一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 證明實(shí)驗(yàn)室環(huán)境與體表存在微生物2 比較來自不同場所與不同條件下細(xì)菌的數(shù)量和類型3 體會無菌操作的重要性二 實(shí)驗(yàn)原理平板培養(yǎng)基含有細(xì)菌生長所需要的營養(yǎng)成分，當(dāng)取自不同來源的樣品接種于培養(yǎng)基上，在適宜溫度下培養(yǎng)，1-2d內(nèi)每一菌體能通過很多次細(xì)胞分裂而進(jìn)行繁殖，形成一個可見的細(xì)胞群體的集落，稱為菌落。每一種細(xì)菌所形成的菌落都有它自己的特點(diǎn)，例如菌落的大小、表面干燥或濕潤、隆起或扁平、粗糙或光滑等。因此可通過平板培養(yǎng)基來檢查環(huán)境中微生物的數(shù)量和類型。三、器材1、培養(yǎng)基 牛肉

2、膏蛋白胨瓊脂平板2、儀器或其他用具 無菌水、滅菌棉簽（裝在試管內(nèi)），接種環(huán)，試管架，酒精燈，記號筆，廢物缸。四、操作步驟1、寫標(biāo)簽任何一個實(shí)驗(yàn)，在動手操作前均需首先將器皿用記號筆做上記號（包括班級、姓名、日期、樣品來源等），字盡量小些，寫在皿底的一邊，不要寫在當(dāng)中，以免影響觀察結(jié)果。注：培養(yǎng)皿的記號一般寫在皿底上，如果寫在皿蓋上，同時觀察兩個以上培養(yǎng)皿的結(jié)果，打開皿蓋時容易混淆。2、實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌檢查（1）空氣 將一個肉膏蛋白胨瓊脂平板放在實(shí)驗(yàn)臺上，移去皿蓋，使瓊脂培養(yǎng)基表面暴露在空氣中，將另一塊肉膏蛋白胨瓊脂平板放在潔凈工作臺內(nèi)或無人走動的實(shí)驗(yàn)室中，移去皿蓋，1h后蓋上兩個皿蓋。（2）實(shí)驗(yàn)臺 用

3、記號筆在皿底外面中央畫一直線，再在此線中間處畫一垂直線。取棉簽 左手拿含有棉簽的試管，在火焰旁用右手的手掌邊緣和小指、無名指夾持棉塞，將其取出，將管口很快地通過酒精燈的火焰，燒灼管口；輕輕地傾斜試管，用右手的拇指和食指將棉簽小心地取出。放回棉塞，并將空試管放在試管架上。弄濕棉簽 左手取滅菌水試管，如上法拔出棉塞并燒灼管口，將棉簽插入水中，再提出水面，在管壁上擠壓一下以除去過多的水分，小心將棉簽取出，燒灼管口，放回棉塞，并將滅菌水試管放在試管架上。取樣 將濕棉簽在實(shí)驗(yàn)臺面或門旋鈕上擦拭約2cm2的范圍。接種 在火焰旁用左手拇指和食指或中指使平皿開啟成一縫。再將棉簽伸入，在瓊脂表面頂端接種（滾動一

4、下），立即閉合皿蓋。將原放棉簽的空試管拔出棉塞，燒灼管口，插入用過的棉簽，將試管放回試管架。劃線 另取接種環(huán)在火焰上滅菌，先將環(huán)端燒熱，然后將接種環(huán)提起垂直放在火焰上，以使火焰接觸金屬絲的范圍廣一些，待接種環(huán)燒紅，再將接種環(huán)斜放，沿環(huán)向上，燒至可能碰到培養(yǎng)皿的部分，再移向環(huán)端，如此很快地來回通過火焰數(shù)次。左手拿起平板，同樣開啟一縫，將滅過菌并冷卻了的接種環(huán)（可在瓊脂表面邊緣空白處試溫度，若發(fā)出濺潑聲，表示太燙），通過瓊脂頂端的接種區(qū)，向下劃線，直到平板的一半處。注意：接種環(huán)與瓊脂表面的角度要小，移動的壓力不能太大，否則會刺破瓊脂。 閉合皿蓋，左手將平板向左轉(zhuǎn)動至空白處，右手拿的接種環(huán)再在火焰上

5、燒灼，使冷。接種環(huán)通過前面劃的線條再在瓊脂的另一半，從上向下來回劃線至12處。燒灼接種環(huán)，轉(zhuǎn)動平板，劃最后14，立刻蓋上皿蓋，燒灼接種環(huán)，放回原處。整個劃線操作均要求無菌操作，即靠近火焰，而且動作要快。3、人體細(xì)菌的檢查（1）手指（洗手前與洗手后）（2）鼻腔 按照實(shí)驗(yàn)臺檢查法的步驟，取出棉簽，并將其弄濕。用濕棉簽在鼻腔內(nèi)滾動數(shù)次，按實(shí)驗(yàn)臺檢查法的步驟和接種與劃線，然后蓋上皿蓋。4、將所有的瓊脂平板翻轉(zhuǎn)，使皿底朝上，放37培養(yǎng)箱，培養(yǎng)1-2d5、結(jié)果記錄方法（1）菌落計數(shù) 在劃線的平板上，如果菌落很多而重疊，則數(shù)平板最后1/4面積內(nèi)的菌落數(shù)，不是劃線的平板，也一分為四，數(shù)1/4面積的菌落數(shù)。（2

6、）根據(jù)菌落大小、形狀、高度、干濕等特征觀察不同的菌落類型。菌落特征：大小、顏色、干濕情況、形態(tài)、高度、透明程度、邊緣。菌落特征描寫方法如下：大小 大、中、小、針尖狀。可先將整個平板上的菌落粗略觀察一下，再決定大、中、小的標(biāo)準(zhǔn)，或由教師指出一個大小范圍。顏色 黃色、金黃色、灰色、乳白色、紅色、粉紅色等。干濕情況 干燥、濕潤、粘稠。形態(tài) 圓形、不規(guī)則等。（e）高度扁平、隆起、凹下。透明程度 透明、半透明、不透明。邊緣 整齊、不整齊。五、實(shí)驗(yàn)報告P13：結(jié)果1、思考題3、41 比較各種來源的樣品，哪一種樣品的平板菌落數(shù)與菌落類型最多？2 人多的實(shí)驗(yàn)室與無菌室（或無人走動的實(shí)驗(yàn)室）相比，平板上的菌落數(shù)

7、與菌落類型有什么區(qū)別？你能解釋一下造成這種區(qū)別的原因嗎？3 通過本次實(shí)驗(yàn)，在防止培養(yǎng)物的污染與防止細(xì)菌的擴(kuò)散方面，你學(xué)到些什么？有什么體會？六、實(shí)驗(yàn)總結(jié)實(shí)驗(yàn)二 細(xì)菌簡單染色和普通光學(xué)顯微油鏡的使用和細(xì)菌形態(tài)觀察一、目的要求1學(xué)習(xí)微生物涂片、染色的基本技術(shù)，掌握細(xì)菌的單染色方法及無菌操作技術(shù)。2熟悉普通光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造及各部分的功能。3學(xué)習(xí)并掌握油鏡的原理和使用方法。三、油鏡物鏡的基本原理微生物學(xué)研究用的顯微鏡的物鏡通常有低倍物鏡（16mm，10×）、高倍物鏡（4mm，4045×）和油鏡（1.8 mm，95100×）三種。油鏡通常標(biāo)有黑圈或紅圈，也有的以“OI（oi

8、l immer-sion）字樣表示，它是三者中放大倍數(shù)最大的。根據(jù)使用不同放大倍數(shù)的目鏡，可使被檢物體放大10002 000多倍。油鏡的焦距和工作距離（標(biāo)本在焦點(diǎn)上看得最清晰時，物鏡與樣品之間的距離）最短，光圈則開得最大，因此，在使用油鏡觀察時，鏡頭離標(biāo)本十分近，需特別小心。使用時，油鏡與其他物鏡的不同是載玻片與物鏡之間不是隔一層空氣，而是隔一層油質(zhì)，稱為油浸系。這種油常選用香柏油，因香柏油的折射率n=1.52，與玻璃相同。當(dāng)光線通過載玻片后，可直接通過香柏油進(jìn)入物鏡而不發(fā)生折射。如果玻片與物鏡之間的介質(zhì)為空氣，則稱為干燥系，當(dāng)光線通過玻片后，受到折射發(fā)生散射現(xiàn)象，進(jìn)入物鏡的光線顯然減少，這樣

9、就減低了視野的照明度。利用油鏡不但能增加照明度，更主要的是能增加數(shù)值孔徑，因?yàn)轱@微鏡的放大效能是由其數(shù)值孔徑?jīng)Q定的。所謂數(shù)值孔徑，即光線投射到物鏡上的最大角度（稱為鏡口角）的一半正弦，乘上玻片與物鏡間介質(zhì)的折射率所得的乘積，可用下列公式表示：NAn·sin 式中 NA=數(shù)值孔徑；n=介質(zhì)折射率；=最大入射角的半數(shù)，即鏡口角的半數(shù)。因此，光線投射到物鏡的角度愈大，顯微鏡的效能就愈大，該角度的大小決定于物鏡的直徑和焦距。所謂單染色法是利用單一染料對細(xì)菌進(jìn)行染色的一種方法。此法操作簡便，適用于菌體一般形態(tài)的觀察。在中性、堿性或弱酸性溶液中，細(xì)菌細(xì)胞通常帶負(fù)電荷，所以常用堿性染料進(jìn)行染色。堿

10、性染料并不是堿，和其他染料一樣是一種鹽，電離時染料離子帶正電，易與帶負(fù)電荷的細(xì)菌結(jié)合而使細(xì)菌著色。例如，美藍(lán)（亞甲藍(lán)）實(shí)際上是氯化亞甲藍(lán)鹽（methylenebluechloride，縮寫為MBC），它可被電離成正、負(fù)離子：MBCmethylene blue+chloride-帶正電荷的染料離子可使細(xì)菌細(xì)胞染成藍(lán)色。常用的堿性染料除美藍(lán)外，還有結(jié)晶紫（crystal violet）、堿性復(fù)紅（basicfu-chsin）、番紅（又稱沙黃，safranine）等。細(xì)菌體積小，較透明，如未經(jīng)染色常不易識別，而經(jīng)著色后，與背景形成鮮明的對比，使易于在顯微鏡下進(jìn)行觀察。三、器材 顯微鏡，酒精燈，載玻片

11、，接種環(huán)，香柏油，二甲苯，擦鏡紙，生理鹽水；結(jié)晶紫染色液，堿性復(fù)紅染色液；金黃色葡萄球菌，大腸桿菌。四、操作步驟1、涂片 取兩塊干凈的載玻片，各滴一小滴生理鹽水于載玻片中央，用無菌操作（參照實(shí)驗(yàn)一），分別挑取金黃色葡萄球菌和大腸桿菌于二載玻片的水滴中（每一種菌制一片），調(diào)勻并涂成薄膜。注意滴生理鹽水時不宜過多，涂片必須均勻。2、干燥 于室溫中自然干燥。3、固定 涂片面向上，于火焰上通過23次，使細(xì)胞質(zhì)凝固，以固定細(xì)菌的形態(tài)，并使其不易脫落。但不能在火焰上烤，否則細(xì)菌形態(tài)將毀壞。4、染色 放標(biāo)本于水平位置，分別滴加染色液于涂片薄膜上，染色時間長短隨不同染色液而定。結(jié)晶紫染色液染23分鐘，石炭酸復(fù)

12、紅染色液約染12分鐘。5、水洗 染色時間到后，用自來水沖洗，直至沖下之水無色時為止。注意沖洗水流不宜過急，過大，水由玻片上端流下，避免直接沖在涂片處。沖洗后，將標(biāo)本晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹干，待完全干燥后才可置油鏡下觀察。6、鏡檢（1）、低倍鏡觀察（2）、高倍鏡觀察（3）、油鏡觀察用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒提起約2cm，將油鏡轉(zhuǎn)至正下方。在玻片標(biāo)本的鏡檢部位滴上一滴香柏油。從側(cè)面注視，用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒小心地降下，使油鏡浸在香柏油中，其鏡頭幾乎與標(biāo)本相接，應(yīng)特別注意不能壓在標(biāo)本上，更不可用力過猛，否則不僅壓碎玻片，也會損壞鏡頭。從接目鏡內(nèi)觀察，進(jìn)一步調(diào)節(jié)光線，使光線明亮，再用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒徐徐上升，直至視野出現(xiàn)物

13、像為止，然后用細(xì)調(diào)節(jié)器校正焦距。如油鏡已離開油面而仍未見物像，必須再從側(cè)面觀察，將油鏡降下，重復(fù)操作至物像看清為止。用同樣的方法觀察枯草芽孢桿菌染色標(biāo)本。觀察完畢，上旋鏡筒。先用擦鏡紙拭去鏡頭上的油，然后用擦鏡紙蘸少許二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去鏡頭上殘留油跡，最后再用干凈擦鏡紙擦去殘留的二甲苯。切忌用手或其他紙擦鏡頭，以免損壞鏡頭。用綢布擦凈顯微鏡的金屬部件。將各部分還原，反光鏡垂直于鏡座，將接物鏡轉(zhuǎn)成八字形，再向下旋。同時把聚光鏡降下，以免接物鏡與聚光鏡發(fā)生碰撞危險。六、實(shí)驗(yàn)報告1結(jié)果：繪出你所觀察到的經(jīng)單染色的兩種細(xì)菌形態(tài)圖。（注明物鏡放大倍數(shù)和總放大率）2思考題P18 思考題1、P2

14、8 思考題2、3（1）根據(jù)實(shí)驗(yàn)體會，你認(rèn)為制備染色標(biāo)本時，應(yīng)注意哪些事項？（2）制片為什么要完全干燥后才能用油鏡觀察？（3）在明視野顯微鏡下，觀察細(xì)菌形態(tài)時，你認(rèn)為用染色標(biāo)本好，還是用未染色的活標(biāo)本好，為什么？使用油鏡按下列步驟操作：1、先用粗調(diào)節(jié)旋鈕將鏡筒提升（或?qū)⑤d物臺下降）約2cm，并將高倍鏡轉(zhuǎn)出。2、在玻片標(biāo)本的鏡檢部位滴上一滴香柏油。3、從側(cè)面注視，用粗調(diào)節(jié)旋鈕將載物臺緩緩地上升，（或鏡筒下降），使油浸物鏡浸入香柏油中，使鏡頭幾乎與標(biāo)本接觸。4、從接目鏡內(nèi)觀察，放大視場光闌及聚光鏡上的虹彩光圈（帶視場光闌油鏡開大視場光闌），上調(diào)聚光器，使光線充分照明。用粗調(diào)節(jié)旋鈕將載物臺徐徐下降（或

15、鏡筒上升），當(dāng)出現(xiàn)物像一閃后改用細(xì)調(diào)節(jié)旋鈕調(diào)至最清晰為止。如油鏡已離開油面而仍未見到物象，必須再從側(cè)面觀察，重復(fù)上述操作。5、觀察完畢，下降載物臺，將油鏡頭轉(zhuǎn)出，先用擦鏡紙擦去鏡頭上的油，再用擦鏡紙蘸少許乙醚酒精混合液（乙醚2份，純酒精3份）或二甲苯，擦去鏡頭上殘留油跡，最后再用擦鏡紙擦拭23下即可，（注意向一個方向擦拭）。6、將各部分還原，轉(zhuǎn)動物鏡轉(zhuǎn)換器，使物鏡頭不與載物臺通光孔相對，而是成八字形位置，再將鏡筒下降至最低，降下聚光器，反光鏡與聚光器垂直，用一個干凈手帕將接目鏡罩好，以免目鏡頭沾污灰塵。最后用柔軟紗布清潔載物臺等機(jī)械部分，然后將顯微鏡放回柜內(nèi)或鏡箱中。六、實(shí)驗(yàn)總結(jié)實(shí)驗(yàn)三 細(xì)菌的

16、革蘭氏染色一、目的要求了解革蘭氏染色的原理，學(xué)習(xí)并掌握革蘭氏染色的方法。二、基本原理革蘭氏染色反應(yīng)是細(xì)菌分類和鑒定的重要性狀。它是1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立的。革蘭氏染色法（Gram stain）不僅能觀察到細(xì)菌的形態(tài)而且還可將所有細(xì)菌區(qū)分為兩大類：染色反應(yīng)呈藍(lán)紫色的稱為革蘭氏陽性細(xì)菌，用G+表示；染色反應(yīng)呈紅色（復(fù)染顏色）的稱為革蘭氏陰性細(xì)菌，用G-表示。三、器材大腸桿菌，金黃色葡萄球菌；草酸銨結(jié)晶紫，番水水溶液，碘液，95%乙醇，載玻片，顯微鏡等。四、操作步驟1涂片將培養(yǎng)24小時的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌分別作涂片（注意涂片切不可過于濃厚），干燥、固定。固定時通過火焰12次即可，不可

17、過熱，以載玻片不燙手為宜。2染色（1）初染加草酸銨結(jié)晶紫一滴，約一分鐘，水洗。（2）媒染滴加碘液沖去殘水，并覆蓋約一分鐘，水洗。（3）脫色將載玻片上面的水甩凈，并襯以白背景，用95酒精滴洗至流出酒精剛剛不出現(xiàn)紫色時為止，約2030秒鐘，立即用水沖凈酒精。（4）復(fù)染用番紅液染12分鐘，水洗。（5）鏡檢干燥后，置油鏡觀察。革蘭氏陰性菌呈紅色，革蘭氏陽性菌呈紫色。以分散開的細(xì)菌的革蘭氏染色反應(yīng)為準(zhǔn)，過于密集的細(xì)菌，常常呈假陽性。（6）同法在一載玻片上以大腸桿菌與金黃色葡萄球菌混合制片，作革蘭氏染色對比。革蘭氏染色的關(guān)鍵在于嚴(yán)格掌握酒精脫色程度，如脫色過度，則陽性菌可被誤染為陰性菌；而脫色不夠時，陰性

18、菌可被誤染為陽性菌。此外，菌齡也影響染色結(jié)果，如陽性菌培養(yǎng)時間過長，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈陰性反應(yīng)。五、實(shí)驗(yàn)報告1結(jié)果在你所作的革蘭氏染色制片中，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌各染成何色？它們是革蘭氏陰性菌還是革蘭氏陽性菌2思考題P30 思考題1、2、4（1）作革蘭氏染色涂片為什么不能過于濃厚？其染色成敗的關(guān)鍵一步是什么？（2）當(dāng)你對一株未知菌進(jìn)行革蘭氏染色時，怎樣能確證你的染色技術(shù)操作正確，結(jié)果可靠？六、實(shí)驗(yàn)總結(jié)實(shí)驗(yàn)四 放線菌形態(tài)的觀察、一、目的要求:掌握觀察放線菌形態(tài)的基本方法，并觀察放線菌的形態(tài)特征。二、基本原理和細(xì)菌的單染色一樣，放線菌也可用石炭酸復(fù)紅或呂氏堿性美藍(lán)等染料著色后，

19、在顯微鏡下觀察其形態(tài)。玻璃紙具有半透膜特性，其透光性與載玻片基本相同，使放線菌生長在玻璃紙瓊脂平皿上，然后將長菌的玻璃紙剪取一小片，貼放在載玻片上，用顯微鏡即可觀察到放線菌自然生長的個體形態(tài)。放線菌是由不同長短的纖細(xì)的菌絲所形成的單細(xì)胞菌絲體。菌絲體分為兩部分，即潛入培養(yǎng)基中的營養(yǎng)菌絲（或稱基內(nèi)菌絲）和生長在培養(yǎng)基表面的氣生菌絲。有些氣生菌絲分化成各種孢子絲，呈螺旋形、波浪形或分枝狀等。孢子常呈圓形、橢圓形或桿形。氣生菌絲及孢子的形狀和顏色常作為分類的重要依據(jù)。三、器材灰色鏈霉菌（Sgriseus）；石炭酸復(fù)紅染液，呂氏堿性美藍(lán)染液，加拿大樹膠，玻璃紙，高氏1號培養(yǎng)基；顯微鏡，載玻片，蓋玻片，

20、玻璃棒，接種鏟，小刀，鑷子等。四、操作步驟1放線菌自然生長狀態(tài)的觀察(1)將滅菌后的高氏1號培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿，每皿倒15mL左右，凝固后備用。(2)用經(jīng)火焰滅過菌的小鑷子將滅菌優(yōu)質(zhì)玻璃紙平鋪在平皿培養(yǎng)基上，如果瓊脂培養(yǎng)基和玻璃紙之間有氣泡，可以用滅過菌的玻璃棒將氣泡除去。(3)將35ml無菌水倒入弗氏鏈霉菌的斜面培養(yǎng)物里，制成菌懸液，再適當(dāng)稀釋。(4)用無菌吸管取0.1mL的孢子懸液稀釋液，接種在玻璃紙上，并用無菌玻璃棒涂勻后，置28培養(yǎng)，直至菌長好，備用。(5)在潔凈的載玻片上滴一小滴水，稍涂布。取出培養(yǎng)皿，打開皿蓋，用鑷子將玻璃紙與培養(yǎng)基分開，再用剪刀剪取小片長有菌的玻璃紙，菌面朝上放在載

21、玻片的水面上，使紙平貼載玻片。(6)將載玻片置顯微鏡下觀察。附：玻璃紙滅菌方法在玻璃紙滅菌時，若直接將干燥的玻璃紙滅菌，它就會縮小，不便使用。故需作如下處理：將玻璃紙和濾紙剪成培養(yǎng)皿大小的圓形紙片，用水浸泡后把濕濾紙和玻璃紙交互重疊地放在培養(yǎng)皿中，借濾紙將玻璃紙隔開。然后進(jìn)行濕熱滅菌，備用。2營養(yǎng)菌絲的觀察 (1)用接種鏟連同培養(yǎng)基挑取細(xì)黃鏈霉菌菌苔置載玻片中央。 (2)用另一載玻片將其壓碎，棄去培養(yǎng)基，制成涂片，干燥、固定。 (3)用呂氏堿性美藍(lán)染液或石炭酸復(fù)紅染液染0.51分鐘，水洗。 (4)干燥后，用油鏡觀察營養(yǎng)菌絲的形態(tài)。3氣生菌絲與營養(yǎng)菌絲的比較觀察 (1)將高氏1號培養(yǎng)基倒入無菌培

22、養(yǎng)皿，制成4mm左右的培養(yǎng)基平板，經(jīng)培養(yǎng)檢驗(yàn)后無菌，備用。 (2)用火焰滅菌的鑷子將無菌蓋玻片以45度傾斜角插入平皿培養(yǎng)基瓊脂內(nèi)，然后將灰色鏈霉菌的孢子懸液（濃度以稀釋10-210-3為好），接種在蓋玻片與平皿培養(yǎng)基的界面上。 (3)倒置于28培養(yǎng)45天后，小心地將蓋玻片取出，把有菌的一面朝上，放在載玻片上，置顯微鏡下進(jìn)行觀察。一般情況是氣生菌絲顏色較深，并比營養(yǎng)菌絲粗二倍左右。4孢子絲及孢子的觀察(1)將培養(yǎng)34天的細(xì)黃鏈霉菌的培養(yǎng)皿打開，放在顯微鏡低倍鏡下尋找菌落的邊緣，直接觀察氣生菌絲和孢子絲的形態(tài)，注意其分枝情況、卷曲情況等。(2)取清潔的蓋玻片一塊，在菌落上面輕輕按壓一下，然后將印有

23、痕跡的一面朝下放在有一滴呂氏堿性美藍(lán)染液的載玻片上，將孢子等印浸在染液中，制成印片。用油鏡觀察孢子的形狀、孢子絲等。 (3)取干凈載玻片一塊，在玻片中央加一小滴加拿大樹膠，使樹膠攤成一薄層，放置數(shù)分鐘，使略微晾干（但不要過分干燥）。然后用小刀切取灰色鏈霉菌培養(yǎng)體一塊（帶培養(yǎng)基切下）。將培養(yǎng)體表面貼在涂有樹膠的玻片上，用另一玻片輕輕按壓（不要壓碎），然后將放線菌培養(yǎng)體小心棄去，注意不要使培養(yǎng)體在玻片上滑動，否則印痕模糊不清。將制好的印片通過火焰固定，用石炭酸復(fù)紅染色1分鐘，水洗，晾干（不能用吸水紙吸干）。用油鏡觀察孢子絲的形態(tài)及孢子排列情況。五、實(shí)驗(yàn)報告1結(jié)果:繪圖說明你所觀察到的放線菌的形態(tài)特

24、征。2思考題用玻璃紙覆蓋在培養(yǎng)基上，能否培養(yǎng)細(xì)菌，為什么？你認(rèn)為此方法在研究微生物方面可能有些什么用途？六 實(shí)驗(yàn)總結(jié)實(shí)驗(yàn)五 酵母菌及子囊孢子的形態(tài)觀察一、目的要求、觀察酵母菌的細(xì)胞形態(tài)及出芽生殖方式。、學(xué)習(xí)并掌握酵母菌子囊孢子的觀察方法。二、基本原理酵母菌是多形的、不運(yùn)動的單細(xì)胞微生物，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)已有明顯的分化，菌體比細(xì)菌大。繁殖方式也較復(fù)雜，無性繁殖主要是出芽生殖，僅裂殖酵母屬是以分裂方式繁殖；有性繁殖是通過接合產(chǎn)生子囊孢子。酵母菌的子囊孢子生成與否及其形狀，是酵母分類上的重要依據(jù)。一部分酵母菌只有當(dāng)它在最適條件下，才能觀察到形成的子囊孢子，不同種屬的酵母菌，形成子囊孢子的條件不同。葡萄

25、糖-醋酸鹽培養(yǎng)基特別有利于釀酒酵母子囊孢子的形成。本實(shí)驗(yàn)用生長在此培養(yǎng)基上的釀酒酵母為材料，進(jìn)行子囊孢子的觀察。三、器材釀酒酵母裝片；釀酒酵母；呂氏堿性美藍(lán)染液，石炭酸復(fù)紅染液，3的酸性酒精，孔雀綠芽孢染液，麥芽汁瓊脂斜面培養(yǎng)基，葡萄糖-醋酸鹽培養(yǎng)基等；顯微鏡。四、操作步驟一）酵母菌的形態(tài)觀察二）酵母菌子囊孢子的觀察1將釀酒酵母先移種到新鮮麥芽汁瓊脂斜面上，25培養(yǎng)24小時左右。如此活化二次后，備用。2用接種環(huán)取活化后的培養(yǎng)物，接種到葡萄糖-醋酸鹽斜面上，25培養(yǎng)二周左右。3用接種環(huán)挑取少許生長在葡萄糖-醋酸鹽培養(yǎng)基上的釀酒酵母于載玻片上，制成涂片，干燥、固定。4用兩種方法進(jìn)行染色。一種方法是

26、加石炭酸復(fù)紅染液于固定涂片處，在火焰上加熱510分鐘（不能沸騰），用酸性酒精沖洗3060秒鐘，再用水洗去酒精，加呂氏堿性美藍(lán)染液數(shù)滴，數(shù)秒鐘后用水洗去，水干后置顯微鏡下觀察，結(jié)果孢子為赤色，菌體為青色；另一種方法是用孔雀綠芽孢染液進(jìn)行染色，但無需加熱，干后置油鏡下觀察子囊孢子。1.菌落觀察取啤酒酵母、假酵母菌以三點(diǎn)點(diǎn)植法接種于麥芽汁平板培養(yǎng)基上，置于2830下培養(yǎng)3天，形成菌落。觀察菌落表面、高度、邊緣、質(zhì)地和顏色等方面的特點(diǎn)。2.觀察出芽生殖在載玻片上滴1滴蒸餾水，挑取少量啤酒酵母放入蒸餾水中，蓋好蓋玻片，制成臨時裝片（注意不要產(chǎn)生氣泡）。觀察菌體細(xì)胞的大小與出芽方式。五、實(shí)驗(yàn)報告1、結(jié)果：

27、（1）繪圖說明你所觀察到的酵母菌的形態(tài)特征。（2）繪圖說明你所觀察到的酵母菌子囊孢子的形態(tài)特征。2、思考題六、實(shí)驗(yàn)總結(jié)實(shí)驗(yàn)六 細(xì)菌的特殊染色（芽孢、鞭毛和莢膜）一實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆占?xì)菌的莢膜、芽孢、鞭毛染色原理及方法，辨認(rèn)放線菌的營養(yǎng)菌絲、氣絲菌絲、孢子絲、孢子的形態(tài)，學(xué)習(xí)放線菌的觀察方法。二實(shí)驗(yàn)原理：1 夾膜染色 由于莢膜與染料間的親和力弱，不易著色，通常采用負(fù)染色法染莢膜，即設(shè)法使菌體和背景著色而莢膜不著色，從而使莢膜在菌體周圍呈一透明圈，由于莢膜的含水量在90%以上，故染色時一般不加熱固定，以免莢膜皺縮變形。2 芽孢染色 由于芽孢壁厚、透性低、不易著色，應(yīng)當(dāng)用石碳酸復(fù)紅、結(jié)晶紫等進(jìn)行染色菌體

28、和芽孢囊著色，而芽孢囊內(nèi)的芽孢不著色或僅顯很淡的顏色，游離的芽孢呈淡紅色或淺藍(lán)紫色的圓或橢圓形的圈。用著色強(qiáng)的染色劑孔雀綠或石碳酸復(fù)紅，在加熱條件下染色，是染料不僅進(jìn)入菌體也可進(jìn)入芽孢內(nèi)，進(jìn)入菌體的燃料經(jīng)水洗后被染色，而芽孢一經(jīng)染色難以被水洗脫，當(dāng)用對比度大的復(fù)染劑染色后，芽孢仍保留初染劑的顏色，而菌體和芽孢囊被染成復(fù)染劑的顏色，使芽孢和菌體便于區(qū)分。3 鞭毛染色 在染色前用媒染劑進(jìn)行處理，使它沉積在鞭毛上，使鞭毛的直徑加粗，然后在進(jìn)行染色。三 實(shí)驗(yàn)器材1.活材料：培養(yǎng)3-5天的膠質(zhì)芽胞桿菌（Bacillus mucilaginosus，俗稱“鉀細(xì)菌”）。該菌在甘露醇作碳源的培養(yǎng)基上生長時，莢

29、膜豐厚；細(xì)黃鏈霉菌培養(yǎng)平皿、棘孢小單孢菌的玻璃紙培養(yǎng)平皿；普通變形菌及牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面2.染色液和試劑 ：Tyler法染色液：用濾紙過濾后的繪圖墨水、復(fù)紅染色液、6%葡萄糖水溶液、1%甲基紫水溶液、甲醇、20%CuSO4水溶液、香柏油、二甲苯、蒸餾水、5%孔雀綠水溶液、0.5%沙黃水溶液（或0.05%堿性復(fù)紅，石碳酸復(fù)紅染液、0.1%美藍(lán)染色液3.器材： 載玻片、玻片擱架， 擦鏡紙、顯微鏡、接種環(huán)、載玻片、吸水紙、試管、小滴管、酒精燈、鑷子、涂布器、打孔器、細(xì)玻棒、凹載玻片等四 實(shí)驗(yàn)方法步驟（一）夾膜染色1.負(fù)染色法：（1）制片：取潔凈的載玻片一塊，加蒸餾水一滴，取少量菌體放入水滴中混勻

30、并涂布。（2）干燥：將涂片放在空氣中晾干或用電吹風(fēng)冷風(fēng)吹干。（3）染色：在涂面上加復(fù)紅染色液染色23min。（4）水洗：用水洗去復(fù)紅染液。（5）干燥：將染色片放空氣中晾干或用電吹風(fēng)冷風(fēng)吹干。（6）涂黑素：在染色涂面左邊加一小滴黑素，用一邊緣光滑的載玻片輕輕接觸黑素，使黑素沿玻片邊緣散開，然后向右一拖，使黑素在染色涂面上成為一薄層，并迅速風(fēng)干。（7）鏡檢：先低倍鏡，再高倍鏡觀察。結(jié)果：背影灰色，菌體紅色，莢膜無色透明。2.濕墨水法（1）制菌液：加1滴墨水于潔凈的載玻片上，挑少量菌體與其充分混合均勻。（2）加蓋玻片 放一清潔蓋玻片于混合液上，然后在蓋玻片上放一張濾紙，向下輕壓，吸去多余的菌液。（3

31、）鏡檢：先用低倍鏡、再用高倍鏡觀察。結(jié)果：背景灰色，菌體較暗，在其周圍呈現(xiàn)一明亮的透明圈即為莢膜。3.干墨水法（1）制菌液：加1滴6%葡萄糖液于潔凈載玻片一端，挑少量膠質(zhì)芽胞桿菌與其充分混合，再加1環(huán)墨水，充分混勻。（2）制片：左手執(zhí)玻片，右手另拿一邊緣光滑的載玻片，將載玻片的一邊與菌液接觸，使菌液沿玻片接觸處散開，然后以30度角，迅速而均勻地將菌液拉向玻片的一端，使菌液鋪成一薄膜。（3）干燥：空氣中自然干燥。（4）固定：用甲醇浸沒涂片，固定1 min，立即傾去甲醇。（5）干燥：在酒精燈上方，用文火干燥。（6）染色：用甲基紫染12min。（7）水洗：用自來水輕洗，自然干燥。（8）鏡檢：先用低倍

32、鏡再高倍鏡觀察。結(jié)果：背景灰色，菌體紫色，莢膜呈一清晰透明圈。4.Tyler法（1）涂片：按常規(guī)法涂片，可多挑些菌體與水充分混合，并將粘稠的菌液盡量涂開，但涂布的面積不宜過大。（2）干燥：在空氣中自然干燥。（3）染色：用Tyler染色液染57min。（4）脫色：用20%CuSO4水溶液洗去結(jié)晶紫，脫色要適度（沖洗2遍）。用吸水紙吸干，并立即加12滴香柏油于涂片處，以防止CuSO4結(jié)晶的形成。（5）鏡檢：先用低倍鏡再用高倍鏡觀察。觀察完畢后注意用二甲苯擦去鏡頭上的香柏油。結(jié)果：背景藍(lán)紫色，菌體紫色，莢膜無色或淺紫色。5 注意事項1.加蓋玻片時不可有氣泡，否則會影響觀察。2.應(yīng)用干墨水法時，涂片要

33、放在火焰較高處并用文火干燥，不可使玻片發(fā)熱。3.在采用Tyler法染色時，標(biāo)本經(jīng)染色后不可用水洗，必須用20%CuSO4沖洗。（二）芽孢染色1.改良的Schaeffer和Fulton氏染色法（1）制備菌液：加12滴無菌水于小試管中，用接種環(huán)從斜面上挑取23環(huán)的菌體于試管中并充分打勻，制成濃稠的菌液。（2）加染色液：加5%孔雀綠水溶液23滴于小試管中，用接種環(huán)攪拌使染料與菌液充分混合。（3）加熱：將此試管浸于沸水?。?，加熱1520min。（4）涂片：用接種環(huán)從試管底部挑數(shù)環(huán)菌液于潔凈的載玻片上，做成涂面，晾干。（5）固定：將涂片通過酒精燈火焰3次。（6）脫色：用水洗直至流出的水中無孔雀綠顏

34、色為止。（7）復(fù)染：加蕃紅水溶液染色5min后，傾去染色液，不用水洗，直接用吸水紙吸干。（8）鏡檢：先低倍，再高倍，最后用油鏡觀察。結(jié)果：芽胞呈綠色，芽胞囊和菌體為紅色。2.Schaeffer與Fulton氏染色法（1）涂片：按常規(guī)方法將待檢細(xì)菌制成一薄的涂片。（2）晾干固定：待涂片晾干后在酒精燈火焰上通過23次。（3）染色：加染色液：加5%孔雀綠水溶液于涂片處（染料以鋪滿涂片為度），然后將涂片放在銅板上，用酒精燈火焰加熱至染液冒蒸汽時開始計算時間，約維持15-20min。加熱過程中要隨時添加染色液，切勿讓標(biāo)本干涸。（加熱時溫度不能太高）。水洗：待玻片冷卻后 ，用水輕輕地沖洗，直至流出的水中無

35、染色液為止。復(fù)染：用蕃紅液染色5min。（4）水洗、晾干或吸干。（5）鏡檢：先低倍，再高倍，最后在油鏡下觀察芽胞和菌體的形態(tài)。結(jié)果：芽胞呈綠色，菌體為紅色。3 注意事項（1）.供芽胞染色用的菌種應(yīng)控制菌齡。（2）.改良法在節(jié)約染料、簡化操作及提高標(biāo)本質(zhì)量等方面都較常規(guī)涂片法優(yōu)越，可優(yōu)先使用。（3）.用改良法時，欲得到好的涂片，首先要制備濃稠的菌液，其次是從小試管中取染色的菌液時，應(yīng)先用接種環(huán)充分?jǐn)嚢?，然后再挑取菌液，否則菌體沉于管底，涂片時菌體太少。（三）鞭毛染色1.鍍銀法染色（1）清洗玻片  選擇光滑無裂痕的玻片，最好選用新的。為了避免玻片相互重疊，應(yīng)將玻片插在專用金屬架上，然后將

36、玻片置洗衣粉過濾液中（洗衣粉煮沸后用濾紙過濾，以除去粗顆粒），煮沸20min。取出稍冷后用自來水沖洗、晾干，再放入濃洗液中浸泡56天，使用前取出玻片，用自來水沖去殘酸，再用蒸餾水洗。將水瀝干后，放入95%乙醇中脫水。（2）菌液的制備及制片：菌齡較老的細(xì)菌容易失落鞭毛，所以在染色前應(yīng)將待染細(xì)菌在新配制的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面上（培養(yǎng)基表面濕潤，斜面基部含有冷凝水）連續(xù)移接3-5代，以增強(qiáng)細(xì)菌的運(yùn)動力。最后一代菌種放恒溫箱中培養(yǎng)1216h。然后，用接種環(huán)挑取斜面與冷凝水交接處的菌液數(shù)環(huán)，移至盛有12mL無菌水的試管中，使菌液呈輕度混濁。將該試管放在37恒溫箱中靜置10min（放置時間不宜太長，否則

37、鞭毛會脫落），讓幼齡菌的鞭毛松展開。然后，吸取少量菌液滴在潔凈玻片的一端，立即將玻片傾斜，使菌液緩慢地流向另一端，用吸水紙吸去多余的菌液。涂片放空氣中自然干燥。用于鞭毛染色的菌體也可用半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)。方法是將0.3-0.4%的瓊脂肉膏培養(yǎng)基熔化后倒入無菌平皿中，待凝固后在平板中央點(diǎn)接活化了3-4代的細(xì)菌，恒溫培養(yǎng)12-16h后，取擴(kuò)散菌落的邊緣制作涂片。（3）染色滴加A液，染46min。用蒸餾水充分洗凈A液。用B液沖去殘水，再加B液于玻片上，在酒精燈火焰上加熱至冒氣，約維持0.51min（加熱時應(yīng)隨時補(bǔ)充蒸發(fā)掉的染料，不可使玻片出現(xiàn)干涸區(qū)）。用蒸餾水洗，自然干燥。（4）鏡檢：先低倍，再高倍，

38、最后用油鏡檢查。結(jié)果：菌體呈深褐色，鞭毛呈淺褐色。2.改良Leifson染色法（1）清洗玻片法同1。（2）配制染料  見附錄二（一）9。染料配好后要過濾15-20次后染色效果才好。（3）菌液的制備及涂片菌液的制備同1。用記號筆在潔凈的玻片上劃分34個相等的區(qū)域。放1滴菌液于第一個小區(qū)的一端，將玻片傾斜，讓菌液流向另一端，并用濾紙吸去多余的菌液。干燥  在空氣中自然干燥。（4）染色加染色液于第一區(qū)，使染料覆蓋涂片。隔數(shù)分鐘后再將染料加入第二區(qū)，依此類推（相隔時間可自行決定），其目的是確定最合適的染色時間，而且節(jié)約材料。水洗：在沒有傾去染料的情況下，就用蒸餾水輕輕地沖去染料，否

39、則會增加背景的沉淀。干燥：自然干燥。（5）鏡檢  先低倍觀察，再高倍觀察，最后再用油鏡觀察，觀察時要多找一些視野，不要企圖在1-2個視野中就能看到細(xì)菌的鞭毛。結(jié)果：菌體和鞭毛均染成紅色。3 注意事項（1）.鍍銀法染色比較容易掌握，但染色液必須每次現(xiàn)配現(xiàn)用，不能存放，比較麻煩。（2）.Leifson染色法受菌種、菌齡和室溫等因素的影響，且染色液須經(jīng)15-20次過濾，要掌握好染色條件必須經(jīng)過一些摸索。（3）.細(xì)菌鞭毛極細(xì)，很易脫落，在整個操作過程中，必須仔細(xì)小心，以防鞭毛脫落。（4）.染色用玻片干凈無油污是鞭毛染色成功的先決條件。五 實(shí)驗(yàn)作業(yè)：1繪出所用材料的芽胞和菌體的形態(tài)圖2 給出鞭

40、毛菌的形態(tài)圖六、實(shí)驗(yàn)總結(jié)實(shí)驗(yàn)七 培養(yǎng)基的配制及消毒與滅菌及LB培養(yǎng)基的制備一、目的要求1、 了解培養(yǎng)基的種類、掌握培養(yǎng)基的配制、分裝方法和滅菌前的準(zhǔn)備工作；高壓滅菌的原理、使用范圍和注意事項。2 、明確培養(yǎng)基的配制原理。3 、通過對LB培養(yǎng)基的配制，掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟。二、基本原理LB培養(yǎng)基是一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基，有時又稱為普通培養(yǎng)基。它含有酵母提取物、蛋白胨和NaCl。其中酵母提取物為微生物提供碳源和能源，磷酸鹽、蛋白胨主要提供氮源，而NaCl提供無機(jī)鹽。在配制固體培養(yǎng)基時還要加入一定量瓊脂作凝固劑。瓊脂在常用濃度下96時溶化，一般實(shí)際應(yīng)用時在沸水浴中或下面墊以

41、石棉網(wǎng)煮沸溶化，以免瓊脂燒焦。瓊脂在40時凝固，通常不被微生物分解利用。固體培養(yǎng)基中瓊脂的含量根據(jù)瓊脂的質(zhì)量和氣溫的不同而有所不同。由于這種培養(yǎng)基多用于培養(yǎng)細(xì)菌，因此，要用稀酸或稀堿將其pH調(diào)至中性或微堿性，以利于細(xì)菌的生長繁殖。LB培養(yǎng)基的配方如下：酵母提取物 5g、蛋白胨 10g、NaCl 5g、瓊脂 1520g、水 1000mL、pH 7.47.6三、器材酵母提取物，蛋白胨， NaCl，瓊脂；1mol/L NaOH， 1mol/L HCl；試管，三角燒瓶，燒杯，量筒，玻棒，培養(yǎng)基分裝器，天平，牛角匙，高壓蒸汽滅菌鍋，pH試紙（pH 5.59.0），棉花，牛皮紙，記號筆，麻繩，紗布等。四、

42、操作步驟1稱量 按培養(yǎng)基配方比例依次準(zhǔn)確地稱取酵母提取物、蛋白胨、NaCl放入燒杯中。蛋白胨很易吸潮，在稱取時動作要迅速。另外，稱藥品時嚴(yán)防藥品混雜，一把牛角匙用于一種藥品，或稱取一種藥品后，洗凈、擦干，再稱取另一藥品，瓶蓋也不要蓋錯。2溶化在上述燒杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒攪勻，然后，在石棉網(wǎng)上加熱使其溶解。待藥品完全溶解后，補(bǔ)充水分到所需的總體積。如果配制固體培養(yǎng)基，將稱好的瓊脂放入已溶化的藥品中，再加熱溶化，在瓊脂溶化的過程中，需不斷攪拌，以防瓊脂糊底使燒杯破裂。最后補(bǔ)足所失的水分。3調(diào)pH在未調(diào)pH前，先用精密pH試紙測量培養(yǎng)基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培養(yǎng)基中逐滴

43、加入1mol/L NaOH，邊加邊攪拌，并隨時用pH試紙測其pH值，直至pH達(dá)7.6。反之，則用1mol/L HCl進(jìn)行調(diào)節(jié)。注意pH值不要調(diào)過頭，以避免回調(diào)，否則，將會影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度。對于有些要求pH值較精確的微生物，其pH的調(diào)節(jié)可用酸度計進(jìn)行（使用方法，可參考有關(guān)說明書）。4分裝 按實(shí)驗(yàn)要求，可將配制的培養(yǎng)基分裝入試管內(nèi)或三角燒瓶內(nèi)。分裝過程中注意不要使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。(1)液體分裝分裝高度以試管高度的1/4左右為宜。(2)固體分裝分裝試管，其裝量不超過管高的1/5，滅菌后制成斜面，分裝三角燒瓶的量以不超過三角燒瓶容積的一半為宜。(3)半固體分裝試

44、管一般以試管高度的1/3為宜，滅菌后垂直待凝。5加塞培養(yǎng)基分裝完畢后，在試管口或三角燒瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物進(jìn)入培養(yǎng)基內(nèi)而造成污染，并保證有良好的通氣性能。6包扎加塞后，將全部試管用麻繩捆扎好，再在棉塞外包一層牛皮紙，以防止滅菌時冷凝水潤濕棉塞，其外再用一道麻繩扎好。用記號筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、日期。三角燒瓶加塞后，外包牛皮紙，用麻繩以活結(jié)形式扎好，使用時容易解開，同樣用記號筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、日期。7滅菌將上述培養(yǎng)基以1.05kg/cm2（15磅/英寸2），121.3，20分鐘高壓蒸汽滅菌。如因特殊情況不能及時滅菌，則應(yīng)放入冰箱內(nèi)暫存。8擱置斜面將滅菌的試管培養(yǎng)基冷至50左右

45、，將試管棉塞端擱在玻棒上，擱置的斜面長度以不超過試管總長的一半為宜。9無菌檢查將滅菌的培養(yǎng)基放入37的溫室中培養(yǎng)2448小時，以檢查滅菌是否徹底。五、實(shí)驗(yàn)報告 1 分析（1） 指出你所配制的培養(yǎng)基中的碳源、氮源、能源、無機(jī)鹽及生長因子的來源（2） 使用高壓滅菌鍋的注意事項2 思考題（1）培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基應(yīng)具備哪些條件？為什么？（2）在配制培養(yǎng)基的操作過程中應(yīng)注意些什么問題？為什么？（3）培養(yǎng)基配好后，為什么必須立即滅菌？如何檢查滅菌后的培養(yǎng)基是無菌的？六、實(shí)驗(yàn)總結(jié) 實(shí)驗(yàn)八 微生物細(xì)胞大小測定和微生物的數(shù)量測定一、微生物的顯微直接計數(shù)法（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆诊@微鏡下直接計數(shù)的技能。二、實(shí)驗(yàn)原理測定

46、微生物細(xì)胞數(shù)量的方法很多，通常采用的有顯微直接計數(shù)法和平板計數(shù)法。顯微計數(shù)法適用于各種含單細(xì)胞菌體的純培養(yǎng)懸浮液，如有雜菌或雜質(zhì)，常不易分辨。菌體較大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球計數(shù)板，一般細(xì)菌則采用彼得羅夫·霍澤（Petrof Hausser）細(xì)菌計數(shù)板。兩種計數(shù)板的原理和部件相同，只是細(xì)菌計數(shù)板較薄，可以使用油鏡觀察。而血球計數(shù)板較厚，不能使用油鏡，計數(shù)板下部的細(xì)菌不易看清。血球計數(shù)板是一塊特制的厚型載玻片，載玻片上有4條槽而構(gòu)成3個平臺。中間的平臺較寬，其中間又被一短橫槽分隔成兩半，每個半邊上面各有一個計數(shù)區(qū)（圖21-1），計數(shù)區(qū)的刻度有兩種：一種是計數(shù)區(qū)分為16個大方格（大方

47、格用三線隔開），而每個大方格又分成25個小方格；另一種是一個計數(shù)區(qū)分成25個大方格（大方格之間用雙線分開），而每個大方格又分成16個小方格。但是不管計數(shù)區(qū)是哪一種構(gòu)造，它們都有一個共同特點(diǎn)，即計數(shù)區(qū)都由400個小方格組成。計數(shù)區(qū)邊長為1mm，則計數(shù)區(qū)的面積為l mm2，每個小方格的面積為1/400mm2。蓋上蓋玻片后，計數(shù)區(qū)的高度為0.1mm，所以每個計數(shù)區(qū)的體積為0.1mm3，每個小方格的體積為1/4000mm3。使用血球計數(shù)板計數(shù)時，先要測定每個小方格中微生物的數(shù)量，再換算成每毫升菌液（或每克樣品）中微生物細(xì)胞的數(shù)量。已知：1mm3體積=10 mm×10 mm×10 m

48、m= 1000mm3所以：1mm3體積應(yīng)含有小方格數(shù)為1000mm3/1/4000mm3=4×106個小方格，即系數(shù)K=4×106 。因此：每ml菌懸液中含有細(xì)胞數(shù)= 每個小格中細(xì)胞平均數(shù)（N）×系數(shù)（K）×菌液稀釋倍數(shù)（d）三、實(shí)驗(yàn)器材 1活材料：釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）斜面或培養(yǎng)液。2器材：顯微鏡、血球計數(shù)板、蓋玻片（22mm×22mm）、吸水紙、計數(shù)器、滴管、擦鏡紙。四、實(shí)驗(yàn)方法   1視待測菌懸液濃度，加無菌水適當(dāng)稀釋（斜面一般稀釋到10-2），以每小格的菌數(shù)可數(shù)為度。2取潔凈的血

49、球計數(shù)板一塊，在計數(shù)區(qū)上蓋上一塊蓋玻片。3將酵母菌懸液搖勻，用滴管吸取少許，從計數(shù)板中間平臺兩側(cè)的溝槽內(nèi)沿蓋玻片的下邊緣摘入一小滴（不宜過多），讓菌懸液利用液體的表面張力充滿計數(shù)區(qū)，勿使氣泡產(chǎn)生，并用吸水紙吸去溝槽中流出的多余菌懸液。也可以將菌懸液直接滴加在計數(shù)區(qū)上，不要使計數(shù)區(qū)兩邊平臺沾上菌懸液，以免加蓋蓋玻片后，造成計數(shù)區(qū)深度的升高。然后加蓋蓋玻片（勿使產(chǎn)生氣泡）。4靜置片刻，將血球計數(shù)板置載物臺上夾穩(wěn)，先在低倍鏡下找到計數(shù)區(qū)后，再轉(zhuǎn)換高倍鏡觀察并計數(shù)。由于生活細(xì)胞的折光率和水的折光率相近，觀察時應(yīng)減弱光照的強(qiáng)度。5計數(shù)時若計數(shù)區(qū)是由16個大方格組成，按對角線方位，數(shù)左上、左下、右上、右下

50、的4個大方格（即100小格）的菌數(shù)。如果是25個大方格組成的計數(shù)區(qū)，除數(shù)上述四個大方格外，還需數(shù)中央l個大方格的菌數(shù)（即80個小格）。如菌體位于大方格的雙線上，計數(shù)時則數(shù)上線不數(shù)下線，數(shù)左線不數(shù)右線，以減少誤差。6對于出芽的酵母菌，芽體達(dá)到母細(xì)胞大小一半時，即可作為兩個菌體計算。每個樣品重復(fù)計數(shù)23次（每次數(shù)值不應(yīng)相差過大，否則應(yīng)重新操作），求出每一個小格中細(xì)胞平均數(shù)（N），按公式計算出每ml（g）菌懸液所含酵母菌細(xì)胞數(shù)量。7測數(shù)完畢，取下蓋玻片，用水將血球計數(shù)板沖洗干凈，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免損壞網(wǎng)格刻度。洗凈后自行晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹干，放入盒內(nèi)保存。五、實(shí)驗(yàn)作業(yè) 將實(shí)驗(yàn)結(jié)果填入下表中：計

51、數(shù)次數(shù)每個大方格菌數(shù)稀 釋倍 數(shù)試管斜面中的總菌數(shù)平均值12345第一次 第二次 二、微生物細(xì)胞大小的測定（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私饽跨R測微尺和鏡臺測微尺的構(gòu)造和使用原理，掌握微生物細(xì)胞大小的測定方法。（二）實(shí)驗(yàn)原理  微生物細(xì)胞的大小是微生物重要的形態(tài)特征之一，由于菌體很小，只能在顯微鏡下來測量。用于測量微生物細(xì)胞大小的工具有目鏡測微尺和鏡臺測微尺。目鏡測微尺（圖20-1）是一塊圓形玻片，在玻片中央把5mm長度刻成50等分，或把10 mm長度刻成100等分。測量時，將其放在接目鏡中的隔板上(此處正好與物鏡放大的中間像重疊)來測量經(jīng)顯微鏡放大后的細(xì)胞物象。由于不同目鏡、物鏡組合的放大倍數(shù)不相

52、同，目鏡測微尺每格實(shí)際表示的長度也不一樣，因此目鏡測微尺測量微生物大小時須先用置于鏡臺上的鏡臺測微尺校正，以求出在一定放大倍數(shù)下，目鏡測微尺每小格所代表的相對長度。鏡臺測微尺（圖20-2）是中央部分刻有精確等分線的載玻片，一般將lmm等分為100格，每格長l0m（即0.0lmm），是專門用來校正目鏡測微尺的。校正時，將鏡臺測微尺放在載物臺上，圖 20-1目鏡測微尺由于鏡臺測微尺與細(xì)胞標(biāo)本是處于同一位置，都要經(jīng)過物鏡和目鏡的兩次放大成象進(jìn)入視野，即鏡臺測微尺隨著顯微鏡總放大倍數(shù)的放大而放大，因此從鏡臺測微尺上得到的讀數(shù)就是細(xì)胞的真實(shí)大小，所以用鏡臺測微尺的已知長度在一定放大倍數(shù)下校正目鏡測微尺，

53、即可求出目鏡測微尺每格所代表的長度，然后移去鏡臺測微尺，換上待測標(biāo)本片，用校正好的目鏡測微尺在同樣放大倍數(shù)下測量微生物大小。（三）、實(shí)驗(yàn)器材1活材料：釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)斜面菌種、枯草桿菌(Baccillus subtilis)染色標(biāo)本片。2器材：顯微鏡、目鏡測微尺、鏡臺測微尺、蓋玻片、載玻片、滴管、雙層瓶、擦鏡紙。（四）、實(shí)驗(yàn)方法1目鏡測微尺的校正  把目鏡的上透鏡旋下，將目鏡測微尺的刻度朝下輕輕地裝入目鏡的隔板上，把鏡臺測微尺置于載物臺上，刻度朝上。先用低倍鏡觀察，對準(zhǔn)焦距，視野中看清鏡臺測微尺的刻度后，轉(zhuǎn)動目鏡，使目鏡測微尺與鏡臺測微尺的

54、刻度平行，移動推動器，使兩尺重疊，再使兩尺的“0”刻度完全重合，定位后，仔細(xì)尋找兩尺第二個完全重合的刻度(圖20-3)，計數(shù)兩重合刻度之間目鏡測微尺的格數(shù)和鏡臺測微尺的格數(shù)。因?yàn)殓R臺測微尺的刻度每格長l0m，所以由下列公式可以算出目鏡測微尺每格所代表的長度。例如目鏡測微尺5小格正好與鏡臺測微尺5小格重疊，已知鏡臺測微尺每小格為l0m，則目鏡測微尺上每小格長度為=5×10m/510m用同法分別校正在高倍鏡下和油鏡下目鏡測微尺每小格所代表的長度。由于不同顯微鏡及附件的放大倍數(shù)不同，因此校正目鏡測微尺必須針對特定的顯微鏡和附件（特定的物鏡、目鏡、鏡筒長度）進(jìn)行，而且只能在特定的情況下重復(fù)使

55、用，當(dāng)更換不同放大倍數(shù)的目鏡或物鏡時，必須重新校正目鏡測微尺每一格所代表的長度。2細(xì)胞大小的測定 (1)將酵母菌斜面制成一定濃度的菌懸液（10-2） (2)取一滴酵母菌菌懸液制成水浸片。 (3)移去鏡臺測微尺，換上酵母菌水浸片，先在低倍鏡下找到目的物，然后在高倍鏡下用目鏡測微尺來測量酵母菌菌體的長，寬各占幾格（不足一格的部分估計到小數(shù)點(diǎn)后一位數(shù)）。測出的格數(shù)乘上目鏡測微尺每格的校正值，即等于該菌的長和寬。一般測量菌體的大小要在同一個標(biāo)本片上測定1020個菌體，求出平均值，才能代表該菌的大小。而且一般是用對數(shù)生長期的菌體進(jìn)行測定。（4）同法用油鏡測定枯草桿菌染色標(biāo)本的長和寬。（五）、實(shí)驗(yàn)作業(yè)：將

56、實(shí)驗(yàn)結(jié)果填入下列表格表20-1   目鏡測微目尺校正結(jié)果物鏡 目尺格數(shù) 臺尺格數(shù) 目尺校正值（m）10×40×100×表20-2  酵母菌大小測定記錄  （格）1  2  3  4  5  6  7  8  9  10  11  12  13  14  15  平均值長寬表20-3 枯草桿菌大小測定記錄  （格）  細(xì)胞數(shù)   1

57、0; 2  3  4  5  6  7  8  9  10  11  12  13  14  15  平均值長寬結(jié)果計算  長m平均格數(shù)×校正值寬m平均格數(shù)×校正值大小表示：寬m×長m六、實(shí)驗(yàn)總結(jié)實(shí)驗(yàn)九、十 環(huán)境因素對微生物的影響一、目的要求了解某些物理因素、化學(xué)因素和生物因素對微生物生長的影響及芽孢對不良環(huán)境的抵抗能力。二、基本原理 環(huán)境因素(包括物理因素、化學(xué)因素和生物因素)，如溫度、滲透壓、紫外線、pH、氧氣、某些化學(xué)藥品及拮抗菌等對微生物的生長繁殖、生理生化過程產(chǎn)生影響。不良的環(huán)境條件使微生物的生長受到抑制，甚至導(dǎo)致菌體的死亡。但是某些微生物產(chǎn)生的芽孢，對惡