HPLC原理參考模板

1、HPLC原理及方法簡介 I概論一、液相色譜理論發(fā)展簡況色譜法的分離原理是：溶于流動相(mobile phase)中的各組分經(jīng)過固定相時，由于與固定相(stationary phase)發(fā)生作用（吸附、分配、離子吸引、排阻、親和）的大小、強弱不同，在固定相中滯留時間不同，從而先后從固定相中流出。又稱為色層法、層析法。色譜法最早是由俄國植物學(xué)家茨維特（Tswett）在1906年研究用碳酸鈣分離植物色素時發(fā)現(xiàn)的，色譜法(Chromatography)因之得名。后來在此基礎(chǔ)上發(fā)展出紙色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法、液相色譜法。液相色譜法開始階段是用大直徑的玻璃管柱在室溫和常壓下用液位差輸送流動相，稱為

2、經(jīng)典液相色譜法，此方法柱效低、時間長（常有幾個小時）。高效液相色譜法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上，于60年代后期引入了氣相色譜理論而迅速發(fā)展起來的。它與經(jīng)典液相色譜法的區(qū)別是填料顆粒小而均勻，小顆粒具有高柱效，但會引起高阻力，需用高壓輸送流動相，故又稱高壓液相色譜法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。又因分析速度快而稱為高速液相色譜法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。二、HPLC的特點和優(yōu)點HPLC有以下特點：高

3、壓壓力可達150-300 Kg/cm2。色譜柱每米降壓為75 Kg/cm2以上。高速流速為0.1-10.0 mL/min。高效可達5000塔板每米。在一根柱中同時分離成份可達100種。高靈敏度紫外檢測器靈敏度可達0.01 ng。同時消耗樣品少。HPLC與經(jīng)典液相色譜相比有以下優(yōu)點：速度快通常分析一個樣品在15-30 min，有些樣品甚至在5 min內(nèi)即可完成。分辨率高可選擇固定相和流動相以達到最佳分離效果。靈敏度高紫外檢測器可達0.01 ng，熒光和電化學(xué)檢測器可達0.1 pg。柱子可反復(fù)使用用一根色譜柱可分離不同的化合物。樣品量少，容易回收樣品經(jīng)過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。

4、三、色譜法分類按兩相的物理狀態(tài)可分為：氣相色譜法(GC)和液相色譜法(LC)。氣相色譜法適用于分離揮發(fā)性化合物。GC根據(jù)固定相不同又可分為氣固色譜法(GSC)和氣液色譜法(GLC)，其中以GLC應(yīng)用最廣。液相色譜法適用于分離低揮發(fā)性或非揮發(fā)性、熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)。LC同樣可分為液固色譜法(1 / 23LSC)和液液色譜法(LLC)。此外還有超臨界流體色譜法(SFC)，它以超臨界流體（界于氣體和液體之間的一種物相）為流動相（常用CO2），因其擴散系數(shù)大，能很快達到平衡，故分析時間短，特別適用于手性化合物的拆分。按原理分為吸附色譜法(AC)、分配色譜法(DC)、離子交換色譜法(IEC)、排阻色譜法(

5、EC，又稱分子篩、凝膠過濾(GFC)、凝膠滲透色譜法(GPC）和親和色譜法。按操作形式可分為紙色譜法(PC)、薄層色譜法(TLC)、柱色譜法。四、色譜分離原理高效液相色譜法按分離機制的不同分為液-固吸附色譜法、液-液分配色譜法（正相與反相）、離子交換色譜法、離子對色譜法及分子排阻色譜法。1液-固色譜法使用固體吸附劑，被分離組分在色譜柱上分離原理是根據(jù)固定相對組分吸附力大小不同而分離。分離過程是一個吸附-解吸附的平衡過程。常用的吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度5-10 m。適用于分離分子量200-1000的組分，大多數(shù)用于非離子型化合物，離子型化合物易產(chǎn)生拖尾。常用于分離同分異構(gòu)體。2液-液色譜法使用

6、將特定的液態(tài)物質(zhì)涂于擔(dān)體表面，或化學(xué)鍵合于擔(dān)體表面而形成的固定相，分離原理是根據(jù)被分離的組分在流動相和固定相中溶解度不同而分離。分離過程是一個分配平衡過程。涂布式固定相應(yīng)具有良好的惰性；流動相必須預(yù)先用固定相飽和，以減少固定相從擔(dān)體表面流失；溫度的變化和不同批號流動相的區(qū)別常引起柱子的變化；另外在流動相中存在的固定相也使樣品的分離和收集復(fù)雜化。由于涂布式固定相很難避免固定液流失，現(xiàn)在已很少采用?，F(xiàn)在多采用的是化學(xué)鍵合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。液液色譜法按固定相和流動相的極性不同可分為正相色譜法(NPC)和反相色譜法(RPC)。正相色譜法采用極性固定相（如聚乙二醇、氨基與腈

7、基鍵合相）；流動相為相對非極性的疏水性溶劑（烷烴類如正已烷、環(huán)已烷），常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調(diào)節(jié)組分的保留時間。常用于分離中等極性和極性較強的化合物（如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等）。反相色譜法一般用非極性固定相（如C18、C8）；流動相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機溶劑以調(diào)節(jié)保留時間。適用于分離非極性和極性較弱的化合物。RPC在現(xiàn)代液相色譜中應(yīng)用最為廣泛，據(jù)統(tǒng)計，它占整個HPLC應(yīng)用的80%左右。隨著柱填料的快速發(fā)展，反相色譜法的應(yīng)用范圍逐漸擴大，現(xiàn)已應(yīng)用于某些無機樣品或易解離樣品的分析。為控制樣品在分析過程的解離，常用緩沖液控制

8、流動相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常為2.5-7.5（2-8），太高的pH值會使硅膠溶解，太低的pH值會使鍵合的烷基脫落。有報告新商品柱可在pH 1.5-10范圍操作。3離子交換色譜法固定相是離子交換樹脂，常用苯乙烯與二乙烯交聯(lián)形成的聚合物骨架，在表面未端芳環(huán)上接上羧基、磺酸基（稱陽離子交換樹脂）或季氨基（陰離子交換樹脂）。被分離組分在色譜柱上分離原理是樹脂上可電離離子與流動相中具有相同電荷的離子及被測組分的離子進行可逆交換，根據(jù)各離子與離子交換基團具有不同的電荷吸引力而分離。緩沖液常用作離子交換色譜的流動相。被分離組分在離子交換柱中的保留時間除跟組分離子與樹脂上的離子

9、交換基團作用強弱有關(guān)外，它還受流動相的pH值和離子強度影響。pH值可改變化合物的解離程度，進而影響其與固定相的作用。流動相的鹽濃度大，則離子強度高，不利于樣品的解離，導(dǎo)致樣品較快流出。離子交換色譜法主要用于分析有機酸、氨基酸、多肽及核酸。4離子對色譜法又稱偶離子色譜法，是液液色譜法的分支。它是根據(jù)被測組分離子與離子對試劑離子形成中性的離子對化合物后，在非極性固定相中溶解度增大，從而使其分離效果改善。主要用于分析離子強度大的酸堿物質(zhì)。分析堿性物質(zhì)常用的離子對試劑為烷基磺酸鹽，如戊烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉等。另外高氯酸、三氟乙酸也可與多種堿性樣品形成很強的離子對。分析酸性物質(zhì)常用四丁基季銨鹽，如四丁基

10、溴化銨、四丁基銨磷酸鹽。離子對色譜法常用ODS柱（即C18），流動相為甲醇-水或乙腈-水，水中加入3-10 mmol/L的離子對試劑，在一定的pH值范圍內(nèi)進行分離。被測組分保時間與離子對性質(zhì)、濃度、流動相組成及其pH值、離子強度有關(guān)。5排阻色譜法固定相是有一定孔徑的多孔性填料，流動相是可以溶解樣品的溶劑。小分子量的化合物可以進入孔中，滯留時間長；大分子量的化合物不能進入孔中，直接隨流動相流出。它利用分子篩對分子量大小不同的各組分排阻能力的差異而完成分離。常用于分離高分子化合物，如組織提取物、多肽、蛋白質(zhì)、核酸等。II基本概念和理論一、基本概念和術(shù)語1色譜圖和峰參數(shù)Ø色譜圖(chrom

11、atogram)樣品流經(jīng)色譜柱和檢測器，所得到的信號-時間曲線，又稱色譜流出曲線(elution profile)。Ø基線(base line)經(jīng)流動相沖洗，柱與流動相達到平衡后，檢測器測出一段時間的流出曲線。一般應(yīng)平行于時間軸。Ø噪音(noise)基線信號的波動。通常因電源接觸不良或瞬時過載、檢測器不穩(wěn)定、流動相含有氣泡或色譜柱被污染所致。Ø漂移(drift)基線隨時間的緩緩變化。主要由于操作條件如電壓、溫度、流動相及流量的不穩(wěn)定所引起，柱內(nèi)的污染物或固定相不斷被洗脫下來也會產(chǎn)生漂移。Ø色譜峰(peak)組分流經(jīng)檢測器時響應(yīng)的連續(xù)信號產(chǎn)生的曲線。流出曲

12、線上的突起部分。正常色譜峰近似于對稱形正態(tài)分布曲線（高斯Gauss曲線）。不對稱色譜峰有兩種：前延峰(leading peak)和拖尾峰(tailing peak)。前者少見。Ø拖尾因子(tailing factor，Tf )用以衡量色譜峰的對稱性。也稱為對稱因子(symmetry factor)或不對稱因子(asymmetry factor)。用于形容色譜峰拖尾和前伸的程度，多數(shù)為拖尾峰。h 進樣 進樣 A B 1/10h 拖尾 前伸 A、B如上圖所示通常 Tf1.2-1.3 ，若 Tf2 則峰不合格。峰拖尾的原因是硅膠基質(zhì)上的SiOH羥基未被全部鍵合而與溶質(zhì)發(fā)生反應(yīng)。改進拖尾要用

13、封尾技術(shù)：即用小分子的含甲基的物質(zhì)再次對硅膠進行鍵合，封閉硅羥基；還可在流動相中加入帶 NH2氨基(對羥基敏感)的物質(zhì)，將殘余的羥基掩閉。Ø峰底基線上峰的起點至終點的距離。Ø峰高(peak height，h)峰的最高點至峰底的距離。Ø峰寬(peak width，W)峰兩側(cè)拐點處所作兩條切線與基線的兩個交點間的距離。W4Ø半峰寬(peak width at half-height，Wh/2)峰高一半處的峰寬。Wh/22.355Ø標準偏差(standard deviation，)正態(tài)分布曲線x±1時（拐點）的峰寬之半。正常峰的拐點在峰高的

14、0.607倍處。標準偏差的大小說明組分在流出色譜柱過程中的分散程度。小，分散程度小、極點濃度高、峰形瘦、柱效高；反之，大，峰形胖、柱效低。Ø峰面積(peak area，A)峰與峰底所包圍的面積。A××h2.507 h1.064 Wh/2 h2定性參數(shù)（保留值）Ø死時間(dead time，t0)不保留組分的保留時間。即流動相（溶劑）通過色譜柱的時間。在反相HPLC中可用苯磺酸鈉來測定死時間。Ø死體積(dead volume，V0)由進樣器進樣口到檢測器流動池未被固定相所占據(jù)的空間。它包括4部分：進樣器至色譜柱管路體積、柱內(nèi)固定相顆粒間隙（被流動

15、相占據(jù)，Vm）、柱出口管路體積、檢測器流動池體積。其中只有Vm參與色譜平衡過程，其它3部分只起峰擴展作用。為防止峰擴展，這3部分體積應(yīng)盡量減小。V0F×t0（F為流速）Ø保留時間(retention time，tR)從進樣開始到某個組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值的時間。Ø保留體積(retention volume，VR)從進樣開始到某組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值時流出溶劑的體積。又稱洗脫體積。VRF×tRØ調(diào)整保留時間(adjusted retention time，t'R)扣除死時間后的保留時間。也稱折合保留時間(reduced retenti

16、on time)。在實驗條件（溫度、固定相等）一定時，t'R只決定于組分的性質(zhì)，因此，t'R（或tR）可用于定性。t'RtRt0Ø調(diào)整保留體積(adjusted retention volume，V'R)扣除死體積后的保留體積。V'RVRV0或V'RF×t'R3柱效參數(shù)Ø理論塔板數(shù)(theoretical plate number，N)用于定量表示色譜柱的分離效率（簡稱柱效）。N取決于固定相的種類、性質(zhì)（粒度、粒徑分布等）、填充狀況、柱長、流動相種類和流速及測定柱效所用物質(zhì)的性質(zhì)。如果峰形對稱并符合正態(tài)分布，

17、N可近似表示為：N為常量時，W隨tR成正比例變化。在一張多組分色譜圖上，如果各組分含量相當，則后洗脫的峰比前面的峰要逐漸加寬，峰高則逐漸降低。用半峰寬計算理論塔數(shù)比用峰寬計算更為方便和常用，因為半峰寬更易準確測定，尤其是對稍有拖尾的峰。N與柱長成正比，柱越長，N越大。用N表示柱效時應(yīng)注明柱長，如果未注明，則表示柱長為1米時的理論塔板數(shù)。（一般HPLC柱的N在1000以上。）若用調(diào)整保留時間(t'R)計算理論塔板數(shù)，所得值稱為有效理論塔板數(shù)(N有效或Neff)。Ø理論塔板高度(theoretical plate height，H)每單位柱長的方差。HL/N。實際應(yīng)用時往往用柱長

18、L和理論塔板數(shù)計算。提高柱效的方法：固定相填料要均一，顆粒細，裝填均勻。流動相粘度低。低流速。升高柱溫。4相平衡參數(shù)Ø分配系數(shù)(distribution coefficient，K)在一定溫度下，化合物在兩相間達到分配平衡時，在固定相與流動相中的濃度之比。分配系數(shù)與組分、流動相和固定相的熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān)，也與溫度、壓力有關(guān)。在不同的色譜分離機制中，K有不同的概念：吸附色譜法為吸附系數(shù)，離子交換色譜法為選擇性系數(shù)（或稱交換系數(shù)），凝膠色譜法為滲透參數(shù)。但一般情況可用分配系數(shù)來表示。在條件（流動相、固定相、溫度和壓力等）一定，樣品濃度很低時（Cs、Cm很小）時，K只取決于組分的性質(zhì)，而與濃

19、度無關(guān)。這只是理想狀態(tài)下的色譜條件，在這種條件下，得到的色譜峰為正常峰；在許多情況下，隨著濃度的增大，K減小，這時色譜峰為拖尾峰；而有時隨著溶質(zhì)濃度增大，K也增大，這時色譜峰為前延峰。因此，只有盡可能減少進樣量，使組分在柱內(nèi)濃度降低，K恒定時，才能獲得正常峰。在同一色譜條件下，樣品中K值大的組分在固定相中滯留時間長，后流出色譜柱；K值小的組分則滯留時間短，先流出色譜柱。混合物中各組分的分配系數(shù)相差越大，越容易分離，因此混合物中各組分的分配系數(shù)不同是色譜分離的前提。在HPLC中，固定相確定后，K主要受流動相的性質(zhì)影響。實踐中主要靠調(diào)整流動相的組成配比及pH值，以獲得組分間的分配系數(shù)差異及適宜的保

20、留時間，達到分離的目的。Ø容量因子(capacity factor，k)化合物在兩相間達到分配平衡時，在固定相與流動相中的量之比。也稱質(zhì)量分配系數(shù)。容量因子與保留時間之間有如下關(guān)系：，t'Rk t0。上式說明容量因子的物理意義：表示一個組分在固定相中停留的時間（t'R）是不保留組分保留時間（t0）的幾倍。k0時，化合物全部存在于流動相中，在固定相中不保留，t'R0；k越大，說明固定相對此組分的容量越大，出柱慢，保留時間越長。容量因子與分配系數(shù)的不同點是：K取決于組分、流動相、固定相的性質(zhì)及溫度，而與體積Vs、Vm無關(guān)；k除了與性質(zhì)及溫度有關(guān)外，還與Vs、Vm有

21、關(guān)。由于t'R、t0較Vs、Vm易于測定，所以容量因子比分配系數(shù)應(yīng)用更廣泛。Ø選擇性因子(selectivity factor，)相鄰兩組分的分配系數(shù)或容量因子之比。k2/k1 （設(shè)k2k1）。因kt'R/t0，則t'R2/ t'R1，所以又稱為相對保留時間。要使兩組分得到分離，必須使1。與化合物在固定相和流動相中的分配性質(zhì)、柱溫有關(guān)，與柱尺寸、流速、填充情況無關(guān)。從本質(zhì)上來說，的大小表示兩組分在兩相間的平衡分配熱力學(xué)性質(zhì)的差異，即分子間相互作用力的差異。5分離參數(shù)Ø分離度(resolution，R)相鄰兩峰的保留時間之差與平均峰寬的比值。也

22、叫分辨率，表示相鄰兩峰的分離程度。當R1時，稱為4分離，兩峰基本分離，裸露峰面積為95.4%，內(nèi)側(cè)峰基重疊約2%。R1.5時，稱為6分離，裸露峰面積為99.7%。R1.5稱為完全分離。Ø基本分離方程分離度與三個色譜基本參數(shù)有如下關(guān)系：其中稱為柱效項，為柱選擇性項，為柱容量項。柱效項與色譜過程動力學(xué)特性有關(guān)，后兩項與色譜過程熱力學(xué)因素有關(guān)。從基本分離方程可看出，提高分離度有三種途徑：增加塔板數(shù)。方法之一是增加柱長，但這樣會延長保留時間、增加柱壓。更好的方法是降低塔板高度，提高柱效。增加選擇性。當1時，R0，無論柱效有多高，組分也不可能分離。一般可以采取以下措施來改變選擇性：a. 改變流

23、動相的組成及pH值；b. 改變柱溫；c. 改變固定相。改變?nèi)萘恳蜃?。這常常是提高分離度的最容易方法，可以通過調(diào)節(jié)流動相的組成來實現(xiàn)。k2趨于0時，R也趨于0；k2增大，R也增大。但k2不能太大，否則不但分離時間延長，而且峰形變寬，會影響分離度和檢測靈敏度。一般k2在1-10范圍內(nèi)，最好為2-5，窄徑柱可更小些。IIIHPLC系統(tǒng)HPLC系統(tǒng)一般由輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器、數(shù)據(jù)記錄及處理裝置等組成。其中輸液泵、色譜柱、檢測器是關(guān)鍵部件。有的儀器還有梯度洗脫裝置、在線脫氣機、自動進樣器、預(yù)柱或保護柱、柱溫控制器等，現(xiàn)代HPLC儀還有微機控制系統(tǒng)，進行自動化儀器控制和數(shù)據(jù)處理。制備型HPLC儀

24、還備有自動餾分收集裝置。目前常見的HPLC儀生產(chǎn)廠家國外有Waters公司、Agilent公司（原HP公司）、島津公司等，國內(nèi)有大連依利特公司、上海分析儀器廠、北京分析儀器廠等。一、輸液泵1泵的構(gòu)造和性能輸液泵是HPLC系統(tǒng)中最重要的部件之一。泵的性能好壞直接影響到整個系統(tǒng)的質(zhì)量和分析結(jié)果的可靠性。輸液泵應(yīng)具備如下性能：流量穩(wěn)定，其RSD應(yīng)0.5%，這對定性定量的準確性至關(guān)重要；流量范圍寬，分析型應(yīng)在0.1-10 mL/min范圍內(nèi)連續(xù)可調(diào)，制備型應(yīng)能達到100 ml/min；輸出壓力高，一般應(yīng)能達到150-300 kg/cm2；液缸容積小；密封性能好，耐腐蝕。泵的種類很多，按輸液性質(zhì)可分為恒

25、壓泵和恒流泵。恒流泵按結(jié)構(gòu)又可分為螺旋注射泵、柱塞往復(fù)泵和隔膜往復(fù)泵。恒壓泵受柱阻影響，流量不穩(wěn)定；螺旋泵缸體太大，這兩種泵已被淘汰。目前應(yīng)用最多的是柱塞往復(fù)泵。柱塞往復(fù)泵的液缸容積小，可至0.1ml，因此易于清洗和更換流動相，特別適合于再循環(huán)和梯度洗脫；改變電機轉(zhuǎn)速能方便地調(diào)節(jié)流量，流量不受柱阻影響；泵壓可達400 kg/cm2。其主要缺點是輸出的脈沖性較大，現(xiàn)多采用雙泵系統(tǒng)來克服。雙泵按連接方式可分為并聯(lián)式和串聯(lián)式，一般說來并聯(lián)泵的流量重現(xiàn)性較好（RSD為0.1%左右，串聯(lián)泵為0.2-0.3%），但出故障的機會較多（因多一單向閥），價格也較貴。各品牌輸液泵的基本參數(shù)：項目Waters 51

26、5HP 1100LC-10ATvpElite P200 II檢定要求流速范圍0.001-100.001-100.001-9.9990.01-4.99調(diào)節(jié)精度0.0010.0010.0010.01流量精密度RSD 0.1%0.15%（<0.3%）0.3%0.5%1.5%流量準確度±2.0%±5.0%±2.0%最高壓力4000 Psi40 MPa39.2 MPa40.0 MPa2泵的使用和維護注意事項為了延長泵的使用壽命和維持其輸液的穩(wěn)定性，必須按照下列注意事項進行操作：防止任何固體微粒進入泵體，因為塵埃或其它任何雜質(zhì)微粒都會磨損柱塞、密封環(huán)、缸體和單向閥，因此

27、應(yīng)預(yù)先除去流動相中的任何固體微粒。流動相最好在玻璃容器內(nèi)蒸餾，而常用的方法是濾過，可采用Millipore濾膜（0.2 µm或0.45 µm）等濾器。泵的入口都應(yīng)連接砂濾棒（或片）。輸液泵的濾器應(yīng)經(jīng)常清洗或更換。流動相不應(yīng)含有任何腐蝕性物質(zhì)，含有緩沖液的流動相不應(yīng)保留在泵內(nèi)，尤其是在停泵過夜或更長時間的情況下。如果將含緩沖液的流動相留在泵內(nèi)，由于蒸發(fā)或泄漏，甚至只是由于溶液的靜置，就可能析出鹽的微細晶體，這些晶體將和上述固體微粒一樣損壞密封環(huán)和柱塞等。因此，必須泵入純水將泵充分清洗后，再換成適合于色譜柱保存和有利于泵維護的溶劑（對于反相鍵合硅膠固定相，可以是甲醇或甲醇-水）

28、。泵工作時要留心防止溶劑瓶內(nèi)的流動相被用完，否則空泵運轉(zhuǎn)也會磨損柱塞、缸體或密封環(huán)，最終產(chǎn)生漏液。輸液泵的工作壓力決不要超過規(guī)定的最高壓力，否則會使高壓密封環(huán)變形，產(chǎn)生漏液。流動相應(yīng)該先脫氣，以免在泵內(nèi)產(chǎn)生氣泡，影響流量的穩(wěn)定性，如果有大量氣泡，泵就無法正常工作。如果輸液泵產(chǎn)生故障，須查明原因，采取相應(yīng)措施排除故障：沒有流動相流出，又無壓力指示。原因可能是泵內(nèi)有大量氣體，這時可打開泄壓閥，使泵在較大流量（如5 mL/min）下運轉(zhuǎn)，將氣泡排盡，也可用一個50 mL針筒在泵出口處幫助抽出氣體。另一個可能原因是密封環(huán)磨損，需更換。壓力和流量不穩(wěn)。原因可能是氣泡，需要排除；或者是單向閥內(nèi)有異物，可卸

29、下單向閥，浸入丙酮內(nèi)超聲清洗。有時可能是砂濾棒內(nèi)有氣泡，或被鹽的微細晶?；蜃躺奈⑸锊糠侄氯@時，可卸下砂濾棒浸入流動相內(nèi)超聲除氣泡，或?qū)⑸盀V棒浸入稀酸（如4mol/L硝酸）內(nèi)迅速除去微生物，或?qū)Ⅺ}溶解，再立即清洗。壓力過高的原因是管路被堵塞，需要清除和清洗。壓力降低的原因則可能是管路有泄漏。檢查堵塞或泄漏時應(yīng)逐段進行。3梯度洗脫HPLC有等強度(isocratic)和梯度(gradient)洗脫兩種方式。等度洗脫是在同一分析周期內(nèi)流動相組成保持恒定，適合于組分數(shù)目較少，性質(zhì)差別不大的樣品。梯度洗脫是在一個分析周期內(nèi)程序控制流動相的組成，如溶劑的極性、離子強度和pH值等，用于分析組分數(shù)目多

30、、性質(zhì)差異較大的復(fù)雜樣品。采用梯度洗脫可以縮短分析時間，提高分離度，改善峰形，提高檢測靈敏度，但是常常引起基線漂移和降低重現(xiàn)性。梯度洗脫有兩種實現(xiàn)方式：低壓梯度（外梯度）和高壓梯度（內(nèi)梯度）。兩種溶劑組成的梯度洗脫可按任意程度混合，即有多種洗脫曲線：線性梯度、凹形梯度、凸形梯度和階梯形梯度。線性梯度最常用，尤其適合于在反相柱上進行梯度洗脫。在進行梯度洗脫時，由于多種溶劑混合，而且組成不斷變化，因此帶來一些特殊問題，必須充分重視：要注意溶劑的互溶性，不相混溶的溶劑不能用作梯度洗脫的流動相。有些溶劑在一定比例內(nèi)混溶，超出范圍后就不互溶，使用時更要引起注意。當有機溶劑和緩沖液混合時，還可能析出鹽的晶

31、體，尤其使用磷酸鹽時需特別小心。梯度洗脫所用的溶劑純度要求更高，以保證良好的重現(xiàn)性。進行樣品分析前必須進行空白梯度洗脫，以辨認溶劑雜質(zhì)峰，因為弱溶劑中的雜質(zhì)富集在色譜柱頭后會被強溶劑洗脫下來。用于梯度洗脫的溶劑需徹底脫氣，以防止混合時產(chǎn)生氣泡?；旌先軇┑恼扯瘸ｋS組成而變化，因而在梯度洗脫時常出現(xiàn)壓力的變化。例如甲醇和水粘度都較小，當二者以相近比例混合時粘度增大很多，此時的柱壓大約是甲醇或水為流動相時的兩倍。因此要注意防止梯度洗脫過程中壓力超過輸液泵或色譜柱能承受的最大壓力。每次梯度洗脫之后必須對色譜柱進行再生處理，使其恢復(fù)到初始狀態(tài)。需讓10-30倍柱容積的初始流動相流經(jīng)色譜柱，使固定相與初始

32、流動相達到完全平衡。二、進樣器早期使用隔膜和停流進樣器，裝在色譜柱入口處?，F(xiàn)在大都使用六通進樣閥或自動進樣器。進樣裝置要求：密封性好，死體積小，重復(fù)性好，保證中心進樣，進樣時對色譜系統(tǒng)的壓力、流量影響小。HPLC進樣方式可分為：隔膜進樣、停流進樣、閥進樣、自動進樣。1隔膜進樣。用微量注射器將樣品注入專門設(shè)計的與色譜柱相連的進樣頭內(nèi)，可把樣品直接送到柱頭填充床的中心，死體積幾乎等于零，可以獲得最佳的柱效，且價格便宜，操作方便。但不能在高壓下使用（如10 MPa以上）；此外隔膜容易吸附樣品產(chǎn)生記憶效應(yīng)，使進樣重復(fù)性只能達到1-2%；加之能耐各種溶劑的橡皮不易找到，常規(guī)分析使用受到限制。2停流進樣。

33、可避免在高壓下進樣。但在HPLC中由于隔膜的污染，停泵或重新啟動時往往會出現(xiàn)“鬼峰”；另一缺點是保留時間不準。在以峰的始末信號控制餾分收集的制備色譜中，效果較好。3閥進樣。一般HPLC分析常用六通進樣閥（以美國Rheodyne公司的7725和7725i型最常見），其關(guān)鍵部件由圓形密封墊（轉(zhuǎn)子）和固定底座（定子）組成。由于閥接頭和連接管死體積的存在，柱效率低于隔膜進樣（約下降5-10%左右），但耐高壓（35-40 MPa），進樣量準確，重復(fù)性好（0.5%），操作方便。六通閥的進樣方式有部分裝液法和完全裝液法兩種。用部分裝液法進樣時，進樣量應(yīng)不大于定量環(huán)體積的50%（最多75），并要求每次進樣體積

34、準確、相同。此法進樣的準確度和重復(fù)性決定于注射器取樣的熟練程度，而且易產(chǎn)生由進樣引起的峰展寬。用完全裝液法進樣時，進樣量應(yīng)不小于定量環(huán)體積的5-10倍（最少3倍），這樣才能完全置換定量環(huán)內(nèi)的流動相，消除管壁效應(yīng)，確保進樣的準確度及重復(fù)性。六通閥使用和維護注意事項：樣品溶液進樣前必須用0.45 µm濾膜過濾，以減少微粒對進樣閥的磨損。轉(zhuǎn)動閥芯時不能太慢，更不能停留在中間位置，否則流動相受阻，使泵內(nèi)壓力劇增，甚至超過泵的最大壓力；再轉(zhuǎn)到進樣位時，過高的壓力將使柱頭損壞。為防止緩沖鹽和樣品殘留在進樣閥中，每次分析結(jié)束后應(yīng)沖洗進樣閥。通常可用水沖洗，或先用能溶解樣品的溶劑沖洗，再用水沖洗。4

35、自動進樣。用于大量樣品的常規(guī)分析。三、色譜柱色譜是一種分離分析手段，分離是核心，因此擔(dān)負分離作用的色譜柱是色譜系統(tǒng)的心臟。對色譜柱的要求是柱效高、選擇性好，分析速度快等。市售的用于HPLC的各種微粒填料如多孔硅膠以及以硅膠為基質(zhì)的鍵合相、氧化鋁、有機聚合物微球（包括離子交換樹脂）、多孔碳等，其粒度一般為3，5，7，10 m等，柱效理論值可達5-16萬/米。對于一般的分析只需5000塔板數(shù)的柱效；對于同系物分析，只要500即可；對于較難分離物質(zhì)對則可采用高達2萬的柱子，因此一般10-30 cm左右的柱長就能滿足復(fù)雜混合物分析的需要。柱效受柱內(nèi)外因素影響，為使色譜柱達到最佳效率，除柱外死體積要小外

36、，還要有合理的柱結(jié)構(gòu)（盡可能減少填充床以外的死體積）及裝填技術(shù)。即使最好的裝填技術(shù)，在柱中心部位和沿管壁部位的填充情況總是不一樣的，靠近管壁的部位比較疏松，易產(chǎn)生溝流，流速較快，影響沖洗劑的流形，使譜帶加寬，這就是管壁效應(yīng)。這種管壁區(qū)大約是從管壁向內(nèi)算起30倍粒徑的厚度。在一般的液相色譜系統(tǒng)中，柱外效應(yīng)對柱效的影響遠遠大于管壁效應(yīng)。1柱的構(gòu)造色譜柱由柱管、壓帽、卡套（密封環(huán)）、篩板（濾片）、接頭、螺絲等組成。柱管多用不銹鋼制成，壓力不高于70 kg/cm2 時，也可采用厚壁玻璃或石英管，管內(nèi)壁要求有很高的光潔度。為提高柱效，減小管壁效應(yīng)，不銹鋼柱內(nèi)壁多經(jīng)過拋光。也有人在不銹鋼柱內(nèi)壁涂敷氟塑料以

37、提高內(nèi)壁的光潔度，其效果與拋光相同。還有使用熔融硅或玻璃襯里的，用于細管柱。色譜柱兩端的柱接頭內(nèi)裝有篩板，是燒結(jié)不銹鋼或鈦合金，孔徑0.2-20 µm(5-10 µm)，取決于填料粒度，目的是防止填料漏出。色譜柱按用途可分為分析型和制備型兩類，尺寸規(guī)格也不同：常規(guī)分析柱（常量柱），內(nèi)徑2-5 mm（常用4.6 mm，國內(nèi)有4 mm和5 mm），柱長10-30 cm；窄徑柱（narrow bore，又稱細管徑柱、半微柱semi-microcolumn），內(nèi)徑1-2 mm，柱長10-20 cm；毛細管柱（又稱微柱microcolumn），內(nèi)徑0.2-0.5 mm；半制備柱，內(nèi)徑

38、5 mm；實驗室制備柱，內(nèi)徑20-40 mm，柱長10-30 cm；生產(chǎn)制備柱內(nèi)徑可達幾十厘米。柱內(nèi)徑一般是根據(jù)柱長、填料粒徑和折合流速來確定，目的是為了避免管壁效應(yīng)。2柱的發(fā)展方向因強調(diào)分析速度而發(fā)展出短柱，柱長3-10 cm，填料粒徑2-3 µm。為提高分析靈敏度，與質(zhì)譜(MS)聯(lián)接，而發(fā)展出窄徑柱、毛細管柱和內(nèi)徑小于0.2 mm的微徑柱（microbore）。細管徑柱的優(yōu)點是：節(jié)省流動相；靈敏度增加；樣品量少；能使用長柱達到高分離度；容易控制柱溫；易于實現(xiàn)LC-MS聯(lián)用。但由于柱體積越來越小，柱外效應(yīng)的影響就更加顯著，需要更小池體積的檢測器（甚至采用柱上檢測），更小死體積的柱接

39、頭和連接部件。配套使用的設(shè)備應(yīng)具備如下性能：輸液泵能精密輸出1-100 µL/min的低流量，進樣閥能準確、重復(fù)地進樣微小體積的樣品。且因上樣量小，要求高靈敏度的檢測器，電化學(xué)檢測器和質(zhì)譜儀在這方面具有突出優(yōu)點。3柱的填充和性能評價色譜柱的性能除了與固定相性能有關(guān)外，還與填充技術(shù)有關(guān)。在正常條件下，填料粒度20 µm時，干法填充制備柱較為合適；顆粒20 µm時，濕法填充較為理想。填充方法一般有4種：高壓勻漿法，多用于分析柱和小規(guī)模制備柱的填充；徑向加壓法，Waters專利；軸向加壓法，主要用于裝填大直徑柱；干法。柱填充的技術(shù)性很強，大多數(shù)實驗室使用已填充好的商品柱

40、。必須指出，高效液相色譜柱的獲得，裝填技術(shù)是重要環(huán)節(jié)，但根本問題還在于填料本身性能的優(yōu)劣，以及配套的色譜儀系統(tǒng)的的結(jié)構(gòu)是否合理。無論是自己裝填的還是購買的色譜柱，使用前都要對其性能進行考察，使用期間或放置一段時間后也要重新檢查。柱性能指標包括在一定實驗條件下（樣品、流動相、流速、溫度）下的柱壓、理論塔板高度和塔板數(shù)、對稱因子、容量因子和選擇性因子的重復(fù)性，或分離度。一般說來容量因子和選擇性因子的重復(fù)性在±5%或±10%以內(nèi)。進行柱效比較時，還要注意柱外效應(yīng)是否有變化。一份合格的色譜柱評價報告應(yīng)給出柱的基本參數(shù)，如柱長、內(nèi)徑、填料的種類、粒度、色譜柱的柱效、不對稱度和柱壓降等

41、。4柱的使用和維護注意事項色譜柱的正確使用和維護十分重要，稍有不慎就會降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。在色譜操作過程中，需要注意下列問題，以維護色譜柱。避免壓力和溫度的急劇變化及任何機械震動。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會影響柱內(nèi)的填充狀況；柱壓的突然升高或降低也會沖動柱內(nèi)填料，因此在調(diào)節(jié)流速時應(yīng)該緩慢進行，在閥進樣時閥的轉(zhuǎn)動不能過緩（如前所述）。應(yīng)逐漸改變?nèi)軇┑慕M成，特別是反相色譜中，不應(yīng)直接從有機溶劑改變?yōu)槿渴撬?，反之亦然。一般說來色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時，才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會迅速降低柱效。選擇使用適宜的流動相（尤其是pH），以避免固定相

42、被破壞。有時可以在進樣器前面連接一預(yù)柱，分析柱是鍵合硅膠時，預(yù)柱為硅膠，可使流動相在進入分析柱之前預(yù)先被硅膠“飽和”，避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解。避免將基質(zhì)復(fù)雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內(nèi)，需要對樣品進行預(yù)處理或者在進樣器和色譜柱之間連接一保護柱。保護柱一般是填有相似固定相的短柱。保護柱可以而且應(yīng)該經(jīng)常更換。經(jīng)常用強溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì)。在進行清洗時，對流路系統(tǒng)中流動相的置換應(yīng)以相混溶的溶劑逐漸過渡，每種流動相的體積應(yīng)是柱體積的20倍左右，即常規(guī)分析需要50-75 mL。陽離子交換柱可用稀酸緩沖液沖洗，陰離子交換柱可用稀堿緩沖液沖洗，除去交換性能強的鹽，然后用水、甲醇、二

43、氯甲烷（除去吸附在固定相表面的有機物）、甲醇、水依次沖洗。保存色譜柱時應(yīng)將柱內(nèi)充滿乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發(fā)干燥。絕對禁止將緩沖溶液留在柱內(nèi)靜置過夜或更長時間。色譜柱使用過程中，如果壓力升高，一種可能是燒結(jié)濾片被堵塞，這時應(yīng)更換濾片或?qū)⑵淙〕鲞M行清洗；另一種可能是大分子進入柱內(nèi)，使柱頭被污染；如果柱效降低或色譜峰變形，則可能柱頭出現(xiàn)塌陷，死體積增大。在后兩種情況發(fā)生時，小心擰開柱接頭，用潔凈小鋼將柱頭填料取出1-2 mm高度（注意把被污染填料取凈）再把柱內(nèi)填料整平。然后用適當溶劑濕潤的固定相（與柱內(nèi)相同）填滿色譜柱，壓平，再擰緊柱接頭。這樣處理后柱效能得到改善，但是很難恢復(fù)到新柱的

44、水平。柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前裝一根與分析柱相同固定相的短柱（5-30 mm），可以起到保護、延長柱壽命的作用。采用保護柱會損失一定的柱效，這是值得的。通常色譜柱壽命在正確使用時可達2年以上。以硅膠為基質(zhì)的填料，只能在pH 2-9范圍內(nèi)使用。柱子使用一段時間后，可能有一些吸附作用強的物質(zhì)保留于柱頂，特別是一些有色物質(zhì)更易看清被吸著在柱頂?shù)奶盍仙?。新的色譜柱在使用一段時間后柱頂填料可能塌陷，使柱效下降，這時也可補加填料使柱效恢復(fù)。每次工作完后，最好用洗脫能力強的洗脫液沖洗，例如ODS柱宜用甲醇沖洗至基線平衡。當采用鹽緩沖溶液作流動相時，使用完后應(yīng)用無鹽流動相沖洗。含鹵族元素（氟、氯、溴

45、）化合物可能會腐蝕不銹鋼管道，不宜長期與之接觸。四、檢測器檢測器是HPLC儀的三大關(guān)鍵部件之一。其作用是把洗脫液中組分的量轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?。HPLC的檢測器要求靈敏度高、噪音低（即對溫度、流量等外界變化不敏感）、線性范圍寬、重復(fù)性好和適用范圍廣。1分類1）按原理可分為光學(xué)檢測器（如紫外、熒光、示差折光、蒸發(fā)光散射）、熱學(xué)檢測器（如吸附熱）、電化學(xué)檢測器（如極譜、庫侖、安培）、電學(xué)檢測器（電導(dǎo)、介電常數(shù)、壓電石英頻率）、放射性檢測器（閃爍計數(shù)、電子捕獲、氦離子化）以及氫火焰離子化檢測器。2）按測量性質(zhì)可分為通用型和專屬型（又稱選擇性）。通用型檢測器測量的是一般物質(zhì)均具有的性質(zhì)，它對溶劑和溶質(zhì)組分均有

46、反應(yīng)，如示差折光、蒸發(fā)光散射檢測器。通用型的靈敏度一般比專屬型的低。專屬型檢測器只能檢測某些組分的某一性質(zhì)，如紫外、熒光檢測器，它們只對有紫外吸收或熒光發(fā)射的組分有響應(yīng)。3）按檢測方式分為濃度型和質(zhì)量型。濃度型檢測器的響應(yīng)與流動相中組分的濃度有關(guān)，質(zhì)量型檢測器的響應(yīng)與單位時間內(nèi)通過檢測器的組分的量有關(guān)。4）檢測器還可分為破壞樣品和不破壞樣品的兩種。2性能指標1）噪音和漂移：在儀器穩(wěn)定之后，記錄基線1小時，基線帶寬為噪音，基線在1小時內(nèi)的變化為漂移。它們反映檢測器電子元件的穩(wěn)定性，及其受溫度和電源變化的影響，如果有流動相從色譜柱流入檢測器，那么它們還反映流速（泵的脈動）和溶劑（純度、含有氣泡、固

47、定相流失）的影響。噪音和漂移都會影響測定的準確度，應(yīng)盡量減小。2）靈敏度(sensitivity)：表示一定量的樣品物質(zhì)通過檢測器時所給出的信號大小。對濃度型檢測器，它表示單位濃度的樣品所產(chǎn)生的電信號的大小，單位為mV·mL/g。對質(zhì)量型檢測器，它表示在單位時間內(nèi)通過檢測器的單位質(zhì)量的樣品所產(chǎn)生的電信號的大小，單位為mV·s/g。3）檢測限(detection limit)檢測器靈敏度的高低，并不等于它檢測最小樣品量或最低樣品濃度能力的高低，因為在定義靈敏度時，沒有考慮噪聲的大小，而檢測限與噪聲的大小是直接有關(guān)的。檢測限指恰好產(chǎn)生可辨別的信號（通常用2倍或3倍噪音表示）時進

48、入檢測器的某組分的量（對濃度型檢測器指在流動相中的濃度注意與分析方法檢測限的區(qū)別，單位g/ml或mg/ml；對質(zhì)量型檢測器指的是單位時間內(nèi)進入檢測器的量，單位g/s或mg/s）。又稱為敏感度(detectability)。D3N/S，式中N為噪聲，S為靈敏度。通常是把一個已知量的標準溶液注入到檢測器中來測定其檢測限的大小。檢測限是檢測器的一個主要性能指標，其數(shù)值越小，檢測器性能越好。值得注意的是，分析方法的檢測限除了與檢測器的噪聲和靈敏度有關(guān)外，還與色譜條件、色譜柱和泵的穩(wěn)定性及各種柱外因素引起的峰展寬有關(guān)。4）線性范圍(linear range)：指檢測器的響應(yīng)信號與組分量成直線關(guān)系的范圍，

49、即在固定靈敏度下，最大與最小進樣量（濃度型檢測器為組分在流動相中的濃度）之比。也可用響應(yīng)信號的最大與最小的范圍表示，例如Waters 996 PDA檢測器的線性范圍是-0.1-2.0 A。定量分析的準確與否，關(guān)鍵在于檢測器所產(chǎn)生的信號是否與被測樣品的量始終呈一定的函數(shù)關(guān)系。輸出信號與樣品量最好呈線性關(guān)系，這樣進行定量測定時既準確又方便。但實際上沒有一臺檢測器能在任何范圍內(nèi)呈線性響應(yīng)。通常ABCx，B為響應(yīng)因子，當x=1時，為線性響應(yīng)。對大多數(shù)檢測器來說，x只在一定范圍內(nèi)才接近于1，實際上通常只要x=0.98-1.02就認為它是呈線性的。線性范圍一般可通過實驗確定。我們希望檢測器的線性范圍盡可能

50、大些，能同時測定主成分和痕量成分。此外還要求池體積小，受溫度和流速的影響小，能適合梯度洗脫檢測等。幾種檢測器的主要性能：UV熒光安培質(zhì)譜蒸發(fā)光散射信號吸光度熒光強度電流離子流強度散射光強噪音10-510-310-9線性范圍105104105寬選擇性是是是否否流速影響無無有無溫度影響小小大小檢測限(g/ml)10-1010-1310-1310-9g/s10-9池體積(µl)2-10-71梯度洗脫適宜適宜不宜適宜適宜細管徑柱難難適宜適宜適宜樣品破壞無無無有無5）池體積：除制備色譜外，大多數(shù)HPLC檢測器的池體積都小于10µl。在使用細管徑柱時，池體積應(yīng)減少到1-2 µ

51、L甚至更低，不然檢測系統(tǒng)帶來的峰擴張問題就會很嚴重。而且這時池體、檢測器與色譜柱的連接、接頭等都要精心設(shè)計，否則會嚴重影響柱效和靈敏度。3紫外檢測器(ultraviolet detector)UV檢測器是HPLC中應(yīng)用最廣泛的檢測器，當檢測波長范圍包括可見光時，又稱為紫外-可見檢測器。它靈敏度高，噪音低，線性范圍寬，對流速和溫度均不敏感，可于制備色譜。由于靈敏高，因此既使是那些光吸收小、消光系數(shù)低的物質(zhì)也可用UV檢測器進行微量分析。但要注意流動相中各種溶劑的紫外吸收截止波長。如果溶劑中含有吸光雜質(zhì)，則會提高背景噪音，降低靈敏度（實際是提高檢測限）。此外，梯度洗脫時，還會產(chǎn)生漂移。4與檢測器有關(guān)

52、的故障及其排除1）流動池內(nèi)有氣泡如果有氣泡連續(xù)不斷地通過流動池，將使噪音增大，如果氣泡較大，則會在基線上出現(xiàn)許多線狀“峰”，這是由于系統(tǒng)內(nèi)有氣泡，需要對流動相進行充分的除氣，檢查整個色譜系統(tǒng)是否漏氣，再加大流量驅(qū)除系統(tǒng)內(nèi)的氣泡。如果氣泡停留在流動池內(nèi)，也可能使噪音增大，可采用突然增大流量的辦法除去氣泡（最好不連接色譜柱）；或者啟動輸液泵的同時，用手指緊壓流動池出口，使池內(nèi)增壓，然后放開。可反復(fù)操作數(shù)次，但要注意不使壓力增加太多，以免流動池破裂。2）流動池被污染無論參比池或樣品池被污染，都可能產(chǎn)生噪音或基線漂移?？梢允褂眠m當溶劑清洗檢測池，要注意溶劑的互溶性；如果污染嚴重，就需要依次采用1mol

53、/L硝酸、水和新鮮溶劑沖洗，或者取出池體進行清洗、更換窗口。3）光源燈出現(xiàn)故障紫外或熒光檢測器的光源燈使用到極限或者不能正常工作時，可能產(chǎn)生嚴重噪音，基線漂移，出現(xiàn)平頭峰等異常峰，甚至使基線不有回零。這時需要更換光源燈。4）倒峰倒峰的出現(xiàn)可能是檢測器的極性接反了，改正后即可變成正峰。用示差折光檢測器時，如果組分的折光指數(shù)低于流動相的折光指數(shù)，也會出現(xiàn)倒峰，這就需要選擇合適的流動相。如果流動相中含有紫外吸收的雜質(zhì)，使用紫外檢測器時，無吸收的組分就會產(chǎn)生倒峰，因此必須用高純度的溶劑作流動相。在死時間附近的尖銳峰往往是由于進樣時的壓力變化，或者由于樣品溶劑與流動相不同所引起的。五、數(shù)據(jù)處理和計算機控

54、制系統(tǒng)早期的HPLC儀器是用記錄儀記錄檢測信號，再手工測量計算。其后，使用積分儀計算并打印出峰高、峰面積和保留時間等參數(shù)。80年代后，計算機技術(shù)的廣泛應(yīng)用使HPLC操作更加快速、簡便、準確、精密和自動化，現(xiàn)在已可在互聯(lián)網(wǎng)上遠程處理數(shù)據(jù)。計算機的用途包括三個方面：采集、處理和分析數(shù)據(jù)；控制儀器；色譜系統(tǒng)優(yōu)化和專家系統(tǒng)。六、恒溫裝置在HPLC儀中色譜柱及某些檢測器都要求能準確地控制工作環(huán)境溫度，柱子的恒溫精度要求在±0.1-0.5之間，檢測器的恒溫要求則更高。溫度對溶劑的溶解能力、色譜柱的性能、流動相的粘度都有影響。一般來說，溫度升高，可提高溶質(zhì)在流動相中的溶解度，從而降低其分配系數(shù)K，

55、但對分離選擇性影響不大；還可使流動相的粘度降低，從而改善傳質(zhì)過程并降低柱壓。但溫度太高易使流動相產(chǎn)生氣泡。色譜柱的不同工作溫度對保留時間、相對保留時間都有影響。在凝膠色譜中使用軟填料時溫度會引起填料結(jié)構(gòu)的變化，對分離有影響；但如使用硬質(zhì)填料則影響不大?？偟恼f來，在液固吸附色譜法和化學(xué)鍵合相色譜法中，溫度對分離的影響并不顯著，通常實驗在室溫下進行操作。在液固色譜中有時將極性物質(zhì)（如緩沖劑）加入流動相中以調(diào)節(jié)其分配系數(shù)，這時溫度對保留值的影響很大。不同的檢測器對溫度的敏感度不一樣。紫外檢測器一般在溫度波動超過±0.5時，就會造成基線漂移起伏。示差折光檢測器的靈敏度和最小檢出量常取決于溫度

56、控制精度，因此需控制在±0.001左右，微吸附熱檢測器也要求在±0.001以內(nèi)。IV固定相和流動相在色譜分析中，如何選擇最佳的色譜條件以實現(xiàn)最理想分離，是色譜工作者的重要工作，也是用計算機實現(xiàn)HPLC分析方法建立和優(yōu)化的任務(wù)之一。本章著重討論填料基質(zhì)、化學(xué)鍵合固定相和流動相的性質(zhì)及其選擇。一、基質(zhì)（擔(dān)體）HPLC填料可以是陶瓷性質(zhì)的無機物基質(zhì)，也可以是有機聚合物基質(zhì)。無機物基質(zhì)主要是硅膠和氧化鋁。無機物基質(zhì)剛性大，在溶劑中不容易膨脹。有機聚合物基質(zhì)主要有交聯(lián)苯乙烯-二乙烯苯、聚甲基丙烯酸酯。有機聚合物基質(zhì)剛性小、易壓縮，溶劑或溶質(zhì)容易滲入有機基質(zhì)中，導(dǎo)致填料顆粒膨脹，結(jié)果減

57、少傳質(zhì)，最終使柱效降低。1基質(zhì)的種類1）硅膠硅膠是HPLC填料中最普遍的基質(zhì)。除具有高強度外，還提供一個表面，可以通過成熟的硅烷化技術(shù)鍵合上各種配基，制成反相、離子交換、疏水作用、親水作用或分子排阻色譜用填料。硅膠基質(zhì)填料適用于廣泛的極性和非極性溶劑。缺點是在堿性水溶性流動相中不穩(wěn)定。通常，硅膠基質(zhì)的填料推薦的常規(guī)分析pH范圍為2-8。硅膠的主要性能參數(shù)有：平均粒度及其分布。平均孔徑及其分布。與比表面積成反比。比表面積。在液固吸附色譜法中，硅膠的比表面積越大，溶質(zhì)的k值越大。含碳量及表面覆蓋度（率）。在反相色譜法中，含碳量越大，溶質(zhì)的k值越大。含水量及表面活性。在液固吸附色譜法中，硅膠的含水量越小，其表面硅醇基的活性越強