引物設(shè)計丁香園

1、引物設(shè)計有3條基本原則：首先引物與模板的序列要緊密互補，其次引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，再次引物不能在模板的非目的位點引發(fā) DNA聚合反應(yīng) (即錯配)。？具體實現(xiàn)這3條基本原則需要考慮到諸多因素，如引物長度(primer length)，產(chǎn)物長度？(product length ),序列Tm值(melting temperature)，引物與模板形成雙鏈的內(nèi)部穩(wěn)定 性(internal stability,用G值反映)，形成引物二聚體(primer dimer)及發(fā)夾結(jié)構(gòu)(duplex formation and hairpin )的能值，在錯配位點(false primin

2、g site，的引發(fā)效率，引物及 產(chǎn)物的GC含量(composition )，等等。必要時還需對引物進行修飾，如增加限制性內(nèi) 切酶位點，引進突變等。根據(jù)有關(guān)參考資料和筆者在實踐中的總結(jié)，引物設(shè)計應(yīng)注意如 下要點：？1. 引物的長度一般為15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不應(yīng)大于38，因為過長會導(dǎo)致其延伸溫度大于7 4 C,不適于 Ta q DNA 聚合酶進行反應(yīng)。?2. 引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當沒有相似性較高，尤其是3?端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯配。引物3?端出現(xiàn)3個以上的連續(xù)堿基，如 GGG或CCC，也會使錯誤引發(fā)機 率增加。?3. 引物3?端的末位堿基對Taq酶的DNA合成

3、效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯配位置導(dǎo)致不同的擴增效率，末位堿基為 A的錯配效率明顯高于其他3個堿基，因此應(yīng) 當避免在引物的3?端使用堿基A。另外，引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致 PCR反應(yīng) 失敗。5?晞序列對 PCR影響不太大，因此常用來引進修飾位點或標記物。?4. 引物序列的GC含量一般為40-60%，過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的G C 含 量 不 能 相 差 太 大。 ?5. 引物所對應(yīng)模板位置序列的Tm值在72 C左右可使復(fù)性條件最佳。Tm值的計算有多種方法，如按公式Tm = 4(G+C) + 2(A+T)，在Oligo軟件中使用的是最鄰近法(the nearest

4、n e i g h b o rmethod)。?6. G值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對的相對穩(wěn)定性。應(yīng)當選用3?端G值較低(絕對值不超過9),而5?晞和中間G值相對較高的引物。 引物的3?嚅的G值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng)。？7. 引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值過高(超過 4.5kcal/mol )易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并 且降低引物有效濃度而使 P C R 反應(yīng)不能正常進行。？8. 對引物的修飾一般是在5?端增加酶切位點，應(yīng)根據(jù)下一步實驗中要插入PCR產(chǎn)物的載 體 的 相 應(yīng) 序 列 而 確 定。 ? 值得一提的是，各種模板的引物設(shè)計難

5、度不一。有的模板本身條件比較困難，例如GC含量偏高或偏低，導(dǎo)致找不到各種指標都十分合適的引物； 在用作克隆目的的PCR因為 產(chǎn)物序列相對固定，弓I物設(shè)計的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件。(轉(zhuǎn)載)現(xiàn)在針對PCR引物設(shè)計的引物有好幾種:Oligo 6.22 Primer 5.0等，如果你對引物沒有 特殊要求也可以利用generunner進行設(shè)計引物，近來我一直都在用其設(shè)計引物效果也是 不錯的.具體方法可以參照各自使用說明書 一般是通過設(shè)計軟件，例如oligo6，primer5等，你可以在網(wǎng)上搜一下引物設(shè)計軟件下載 和使用說明，是比較容易的。至于設(shè)計引物的一般原則如下：*序

6、列選取應(yīng)在基因的保守區(qū)段*避免引物自身或與引物之間形成4個或4個以上連續(xù)配對，避免引物自身形成環(huán)狀發(fā)卡結(jié)構(gòu)*典型的引物18到24個核苷長。引物需要足夠長，保證序列獨特性，并降低序列存在 于非目的序列位點的可能性。但是長度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性。較 長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低* Tm值在55 65 C (因為60 C核酸外切酶活性最高)， GC含量在40% 60%*引物之間的TM相差避免超過2C*引物的3'端避免使用堿基A，引物的3'端避免出現(xiàn)3個或3個以上連續(xù)相同的堿基 *為避免的擴增，引物設(shè)計最好能跨兩個外顯

7、子。* Taqman探針PCR要求片段長度在 80bp 150bp*引物末端(最后5個核苷酸)不能有超過2個的G和Co 怎么設(shè)計引物來源：？張小偉的日志1. 引物最好在模板cDNA的保守區(qū)內(nèi)設(shè)計。DNA序列的保守區(qū)是通過物種間相似序列的比較確定的。在 NCBI上搜索不同物種 的同一基因，通過序列分析軟件(比如 DNAman)比對(Alignment )，各基因相同的序 列就是該基因的保守區(qū)。2. 引物長度一般在1530堿基之間。引物長度(primerlength )常用的是18-27bp，但不應(yīng)大于38，因為過長會導(dǎo)致其 延伸溫度大于74 C，不適于TaqDNA聚合酶進行反應(yīng)。3. 引物GC含

8、量在40%60%之間，Tm值最好接近72 CGC含量(composition )過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的 Tm值(meltingtemperature )是寡核苷酸的解鏈溫度， 即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。有效啟動溫度，一般高于Tm值510 C。若按公式Tm=4 (G+C) +2 (A+T)估計引物的Tm值，則有效引物的Tm 為5580 C,其Tm值最好接近72 C以使復(fù)性條件最佳。4. 引物3'端要避開密碼子的第3位如擴增編碼區(qū)域，引物3'端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生 簡并，

9、會影響擴增的特異性與效率。5. 引物3'端不能選擇A,最好選擇T引物3'端錯配時，不同堿基引發(fā)效率存在著很大的差異，當末位的堿基為A時，即使在錯配的情況下，也能有引發(fā)鏈的合成，而當末位鏈為T時，錯配的引發(fā)效率大大降低，G、C錯配的引發(fā)效率介于A、T之間，所以3'端最好選擇To6. 堿基要隨機分布引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當沒有相似性較高，尤其是3'端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯誤引發(fā)（Falsepriming ）。降低引物與模板相似性的一種方法是，引物中四種堿基 的分布最好是隨機的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3'端不應(yīng)超過3個連續(xù)的G或C,因這樣會使引

10、物在GC富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。7. 引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補序列引物自身不應(yīng)存在互補序列，否則引物自身會折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)（Hairpin ）使引物本身復(fù)性。這種二級結(jié)構(gòu)會因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。引物自身不能有連 續(xù)4個堿基的互補。兩引物之間也不應(yīng)具有互補性，尤其應(yīng)避免3'端的互補重疊以防止引物二聚體（Dimer與Crossdimer）的形成。引物之間不能有連續(xù) 4個堿基的互補。引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)如果不可避免的話，應(yīng)盡量使其 G值不要過高（應(yīng)小于4. 5kcal/mol ）。否則易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使 PCR反應(yīng)不能 正常進行。8. 引物5&#

11、39;端和中間厶G值應(yīng)該相對較高，而3'端厶G值較低。 G值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，它反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對的相對穩(wěn)定 性， G值越大，則雙鏈越穩(wěn)定。應(yīng)當選用 5'端和中間厶G值相對較高，而3'端厶G值 較低（絕對值不超過9）的引物。引物3'端的 G值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結(jié) 構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng)。（不同位置的厶G值可以用Oligo6軟件進行分析）9. 引物的5'端可以修飾，而3'端不可修飾引物的5'端決定著PCR產(chǎn)物的長度，它對擴增特異性影響不大。因此，可以被修飾 而不影響擴增的特異性。引物 5'端修飾包括：加

12、酶切位點；標記生物素、熒光、地高辛、 Eu3+等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列；引入點突變、插入突變、缺失突變序列；引入啟 動子序列等。引物的延伸是從3'端開始的，不能進行任何修飾。3'端也不能有形成任何二級結(jié)構(gòu) 可能。10. 擴增產(chǎn)物的單鏈不能形成二級結(jié)構(gòu)某些引物無效的主要原因是擴增產(chǎn)物單鏈二級結(jié)構(gòu)的影響，選擇擴增片段時最好避開二級結(jié)構(gòu)區(qū)域。用有關(guān)軟件（比如 RNAstructure ）可以預(yù)測估計 mRNA的穩(wěn)定二級結(jié) 構(gòu)，有助于選擇模板。實驗表明，待擴區(qū)域自由能（ G ）小于58.6lkJ/mol時，擴增往 往不能成功。若不能避開這一區(qū)域時，用 7-deaza-2'-

13、脫氧GTP取代dGTP對擴增的成功 是有幫助的。11. 引物應(yīng)具有特異性。引物設(shè)計完成以后，應(yīng)對其進行 BLAST檢測。如果與其它基因不具有互補性，就可 以進行下一步的實驗了。值得一提的是，各種模板的引物設(shè)計難度不一。有的模板本身條件比較困難，例如 GC含量偏高或偏低，導(dǎo)致找不到各種指標都十分合適的引物；用作克隆目的的PCR,因為產(chǎn)物序列相對固定，弓|物設(shè)計的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次，盡量 去滿足條件。做RealTime時,用于SYBRGreenl法時的一對引物與一般 PCR的引物,在引物設(shè)計上 所要求的參數(shù)是不同的。引物設(shè)計的要求：1）避免重復(fù)堿基，尤其是 G.2) Tm=5

14、8-60 度。3）GC=30-80%.4）3'端最后5個堿基內(nèi)不能有多于2個的G或C.5）正向引物與探針離得越近越好，但不能重疊。6）PCR擴增產(chǎn)物長度：引物的產(chǎn)物大小不要太大，一般在80-250bp之間都可；80 150bp最為合適（可以延長至300bp） o7）引物的退火溫度要高，一般要在 60度以上；要特別注意避免引物二聚體和非特異性擴增的存在。而且引物設(shè)計時應(yīng)該考慮到引物要有不受基因組 DNA污染影響的能力，即引物應(yīng)該 跨外顯子，最好是引物能跨外顯子的接頭區(qū)，這樣可以更有效的不受基因組 DNA污染的 影響。至于設(shè)計軟件，PRIMER3,PRIMER5,PRIMEREXPRESS都應(yīng)該可以的做染