枯草芽孢桿菌實際應(yīng)用與發(fā)展前景的研究Microsoft Office Word 97-2003 文檔

1、枯草芽孢桿菌實際應(yīng)用與發(fā)展前景的研究摘要 隨著國家對農(nóng)業(yè)的支持，微生物化肥有農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用也越來越受到重視。而枯草芽孢桿菌在農(nóng)業(yè)方面和其它方面都有廣泛的應(yīng)用，因此，研究枯草芽孢桿菌的實際應(yīng)用是非常必要的。本文從工業(yè)酶生產(chǎn)、生物防治領(lǐng)域、微生物添加劑領(lǐng)域和醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域等方面對枯草芽孢桿菌的實際應(yīng)用進行研究。關(guān)鍵詞 枯草芽孢桿菌 實際應(yīng)用 發(fā)展前景Bacillus subtilis application and development prospect of Abstract along with the country the support to agriculture, microbial

2、fertilizer has application in agriculture has been paid more and more attention. And Bacillus subtilis in agriculture and other aspects of a wide range of applications, therefore, research of Bacillus subtilis and practical application is very necessary.This article from the industrial enzyme produc

3、tion, biological control field, microbial additives and medical and health fields on Bacillus subtilis applied research. Key words Bacillus subtilis; application; development prospects1.1 枯草芽孢桿菌簡介枯草芽孢桿菌，是芽孢桿菌屬的一種。單個細胞 0.70.823微米，著色均勻。無莢膜，周生鞭毛，能運動。革蘭氏陽性菌，芽孢0.60.91.01.5微米，橢圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏，芽孢形成后菌體不膨大。菌落

4、表面粗糙不透明，污白色或微黃色。枯草芽孢桿菌菌體生長過程中產(chǎn)生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短桿菌肽等活性物質(zhì)，這些物質(zhì)對致病菌或內(nèi)源性感染的條件致病菌有明顯的抑制作用。枯草芽孢桿菌迅速消耗環(huán)境中的游離氧，造成腸道低氧，促進有益厭氧菌生長，并產(chǎn)生乳酸等有機酸類，降低腸道pH值，間接抑制其它致病菌生長?？莶菅挎邨U菌菌體自身合成-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶等酶類，在消化道中與動物體內(nèi)的消化酶類一同發(fā)揮作用，能合成維生素B1、B2、B6、煙酸等多種B族維生素，提高動物體內(nèi)干擾素和巨噬細胞的活性，在飼料中應(yīng)用廣泛。它還可以用來改善水質(zhì)，應(yīng)用在污水處理和環(huán)境保護中。和其它微生物混合使用，還可以用

5、于生物肥料和土地改良等。枯草芽孢桿菌的應(yīng)用枯草芽孢桿菌在工業(yè)酶生產(chǎn)中的應(yīng)用5工業(yè)酶的生產(chǎn)是工業(yè)微生物發(fā)酵的重要組成部分。據(jù)來自BBC的統(tǒng)計數(shù)字，2004年全球酶的交易額達到20.0億美元(15.3億歐元)，其中食品酶占29，飼料酶占15，一般的工業(yè)酶占56?？莶菅挎邨U菌是當(dāng)今工業(yè)酶生產(chǎn)應(yīng)用最廣泛的菌種之一，據(jù)不完全統(tǒng)計，枯草芽孢桿菌所產(chǎn)的酶占整個酶市場的50。由于其產(chǎn)酶量高、種類多、安全性好和環(huán)保等優(yōu)點，在現(xiàn)代工業(yè)生產(chǎn)中被廣泛用作生產(chǎn)菌種，其發(fā)酵生產(chǎn)的酶已在食品、飼料、洗滌、紡織、皮革、造紙和醫(yī)藥等領(lǐng)域均發(fā)揮著十分重要的作用。枯草芽孢桿菌生境多樣，可利用的營養(yǎng)物質(zhì)種類十分豐富，這決定了其自身含

6、有豐富的產(chǎn)酶系統(tǒng)，具備生產(chǎn)多種酶的應(yīng)用潛力。研究資料表明，枯草芽孢桿菌能夠產(chǎn)生蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、葡聚糖酶、植酸酶、果膠酶和木聚糖酶等十幾種酶。在過去的10年，利用基因工程技術(shù)，枯草芽孢桿菌幾乎可以在短期內(nèi)大量生產(chǎn)任何種源的新酶，從而省略了大量的原始菌種改造、馴化、毒理學(xué)實驗等工作；利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)，能夠在生產(chǎn)新酶之前對該酶的性質(zhì)進行改良和調(diào)整，從而改善酶的活性或者賦予酶新的所需性質(zhì)。這些新技術(shù)的應(yīng)用使新酶種的開發(fā)周期大大縮短，難度和成本降低，產(chǎn)品更加穩(wěn)定有效?？莶菅挎邨U菌生產(chǎn)的蛋白酶、淀粉酶是工業(yè)酶中應(yīng)用最為廣泛的酶，僅二者就占到了整個工業(yè)酶市場的50。其中，淀粉酶的生產(chǎn)和應(yīng)用處于整

7、個酶制劑的首位，其最早是在20世紀(jì)初，由德國的Boiden和Effront先后從枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液中分離出的；蛋白酶主要用于制革、絲綢工業(yè)及制造加酶洗滌劑等方面。目前，枯草芽孢桿菌酶市場營業(yè)額的90以上掌握在加多家工業(yè)酶企業(yè)手中，僅Nonozymes和Danisco兩家公司就占到了60以上。我國酶制劑工業(yè)近年來取得了長足的發(fā)展，但仍無法跟上世界同行業(yè)發(fā)展的步伐，科研乏力已成為制約中國酶工業(yè)發(fā)展的瓶頸因素。枯草芽孢桿菌酶的主要應(yīng)用領(lǐng)域是食品工業(yè)，全世界食品工業(yè)用酶約占總量的60，而我國則高達85以上。這些酶在動物蛋白水解行業(yè)中的骨素加工、植物蛋白水解中的大豆蛋白和大豆肽生產(chǎn)、乳制品和嬰兒食品生產(chǎn)

8、等工業(yè)過程中都已得到廣泛的應(yīng)用，如在面包生產(chǎn)中-淀粉酶、蛋白酶能有效提高面團工藝性能和面包質(zhì)量(體積、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、風(fēng)味等)，并延長面包保鮮期；在啤酒生產(chǎn)中，采用淀粉酶的新型輔料液化工藝以及復(fù)合酶制劑的應(yīng)用對提高我國啤酒的產(chǎn)量和質(zhì)量有重要意義；在玉米深加工領(lǐng)域，采用耐高溫淀粉酶和糖化酶的“淀粉噴射液化”技術(shù)以及“雙酶法”糖化技術(shù)全面帶動了我國淀粉糖、味精和檸檬酸等生產(chǎn)工藝的改革；蛋白酶還可用于魚蝦等海產(chǎn)品下腳料的加工，用于生產(chǎn)調(diào)味劑添加于食品中，不但提高了食品營養(yǎng)價值，增進經(jīng)濟效益，而且還變廢為寶，降低了環(huán)境污染。近年來，蛋白酶、果膠酶和纖維素酶等在果酒、果汁、調(diào)味品、烘焙、肉制品和中藥有效成分提

9、取以及多肽保健品生產(chǎn)中的應(yīng)用也都取得了較大的進展。1.2.2 枯草芽孢桿菌在生物防治領(lǐng)域中的應(yīng)用枯草芽孢桿菌作為植物病害生防細菌之一，具有較強的防病作用。美國迄今已有4株枯草芽孢桿菌生防菌株獲得環(huán)保局商品化或有限商品化生產(chǎn)應(yīng)用許可，如美國AgraQuest公司用枯草芽孢桿菌QST713菌株開發(fā)出活菌制劑殺菌劑SerenadeTM。并于2000年通過美國環(huán)保局(EPA)的登記，用于防治多種作物的白粉病、霜露病、疫病、灰霉病等病害?？莶菅挎邨U菌MBI600在英國的MicroBio Group Ltd.、日本的Idemistu Kosan Co.，Ltd.等均已獲得注冊登記，并進行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，用于防

10、治葉部病害(灰霉病、白粉病)和根部病害(枯萎病、根腐病、黑斑病等)。枯草芽孢桿菌FZB24在德國、美國等國家進行了注冊，并在德國Bayer公司投入生產(chǎn)，用于防治番茄晚疫病、灰霉病和小麥白粉病，還可作為增產(chǎn)促進劑。澳大利亞開發(fā)的B.subtilis A-B對麥類和胡蘿卜立枯病等具有很好的防治和增產(chǎn)作用。此外，LRCavaglieri等從玉米根圍分離獲得的生防菌株B.subtilis RC8、RC9和RC11對玉米輪狀鐮刀菌(Fusarium verticillioides)具有強烈的抑制作用。我國利用枯草芽孢桿菌防治植物病害的應(yīng)用研究也達到了世界先進水平，現(xiàn)已成功開發(fā)并投入生產(chǎn)的商品制劑有亞寶、

11、百抗、麥豐寧、紋曲寧等產(chǎn)品。其中，江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保所選育的枯草芽孢桿菌B-916對水稻白葉枯病菌有良好防效。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)開發(fā)的生防菌B3(麥豐寧)對小麥紋枯病田間防效達5080。云南農(nóng)業(yè)大學(xué)和中國農(nóng)業(yè)大學(xué)共同研制的微生物農(nóng)藥“百抗”已在農(nóng)業(yè)部登記注冊，并在多個省推廣使用，其有效成分是枯草芽孢桿菌B-908，大田應(yīng)用中對水稻紋枯病防效達70以上。另外，由陳延熙等研制的增產(chǎn)菌已在全國10多個省、市的50余種作廣使用，主要用于防治水稻稻瘟病、小麥紋枯病和油菜菌核病等，田間增產(chǎn)率達1050，“增產(chǎn)菌”成為我國第一個生物制劑方面的專利，達到國際領(lǐng)先水平。1.2.3 枯草芽孢桿菌在微生物添加劑領(lǐng)域中的

12、應(yīng)用枯草芽孢桿菌是我國允許使用的飼料微生物菌種，因其無毒、無害，經(jīng)常被制成微生物添加劑，用于改善動物腸道功能、促進動物生長和預(yù)防疾病?？莶菅挎邨U菌在制劑中以內(nèi)生孢子形式存在，孢子進入動物腸道后，在腸道上部能迅速復(fù)活并分泌高活性的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶，有助于降解植物性飼料中復(fù)雜的碳水化合物，產(chǎn)生具有拮抗腸道致病菌的多肽類物質(zhì)等，起到抑菌和預(yù)防作用。另外，枯草芽孢桿菌是好氧菌，可通過消耗腸道內(nèi)的氧氣造成厭氧環(huán)境，促進腸道內(nèi)優(yōu)勢菌厭氧菌的繁殖，維持腸道生態(tài)平衡。如，研究發(fā)現(xiàn)豬采食含107CFUg枯草芽孢桿菌制劑的飼糧3周后，糞中雙歧桿菌數(shù)量顯著上升，而鏈球菌和梭菌的數(shù)量則顯著下降，且這種趨勢仔豬較

13、母豬更明顯；豬飼料中添加枯草芽孢桿菌不僅可以提高飼料轉(zhuǎn)化率和氮利用率，而且可以減少氨的產(chǎn)生。此外，枯草芽孢桿菌具有耐高溫、耐酸堿和耐擠壓等特性，在飼料加工中保存良好，有利于推廣應(yīng)用。1996年，枯草芽孢桿菌作為我國農(nóng)業(yè)部正式批準(zhǔn)的6種生物獸藥之一已投入工廠化生產(chǎn)。1.2.4 枯草芽孢桿菌在醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域的應(yīng)用5研究證明，枯草芽孢桿菌的活菌制劑可以作為口服液用于治療腸炎、支氣管炎和腹瀉等多種疾病，也用來預(yù)防和治療燒傷面的感染。最近，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)從枯草芽孢桿菌提取到的淀粉酶、纖維素酶能夠補充體內(nèi)消化酶的不足，恢復(fù)正常消化機能；蛋白酶能夠分解發(fā)炎部位纖維蛋白的凝結(jié)物，消除傷口周圍的壞疽、腐肉和碎屑。日本

14、人日常生活中食用的納豆就是利用枯草芽孢桿菌生產(chǎn)的，研究表明，納豆中含有的溶栓酶(納豆激酶)對心血管疾病有很好的預(yù)防和治療作用；而同樣由枯草芽孢桿菌合成的聚谷氨酸可用作藥物緩釋材料和醫(yī)用高分子纖維材料等。1.2.5 枯草芽孢桿菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域中的應(yīng)用5枯草芽孢桿菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用起步較晚，由于它能分泌蛋白酶等多種酶類和抗生素，使池底積累的大量殘余餌料、排泄廢物、動植物殘體以及有害氣體(氨、硫化氫等)，使之先分解為小分子(多肽、高級脂肪酸等)，后分解為更小分子的有機物(氨基酸、低級脂肪酸、單糖、環(huán)烴等)，最終分解為二氧化碳、硝酸鹽和硫酸鹽等，有效降低了水中的COD、BOD，使水體中的氨基氮(NH

15、3-N)、亞硝基氮(NO2-N)和硫化物濃度降低，從而有效地改善水質(zhì)，同時還能為以單細胞藻類為主的浮游植物提供營養(yǎng)物質(zhì)，促進繁殖。這些浮游植物的光合作用，又為池內(nèi)底棲水產(chǎn)動物的呼吸、有機物的分解提供氧氣，從而使養(yǎng)殖水體形成一個良性的生態(tài)循環(huán)；另外，它們分泌的多種酶類和抗生素可以抑制其他細菌的生長，進而減少甚至消滅水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的病原體。越來越多的學(xué)者已通過研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌可在水產(chǎn)養(yǎng)殖中發(fā)揮重要的作用。1.2.6 枯草芽孢桿菌是微生物學(xué)與分子生物學(xué)研究的良好試驗材料枯草芽孢桿菌作為基因工程受體菌，可表達出近200種原核和真核生物來源的蛋白基因，并且無論是在生產(chǎn)上還是對基因組及物理圖譜的研究上

16、都處于中心位置，對它的研究涉及各個方面。目前國際上在遺傳工程中使用的芽孢宿主菌幾乎全部來自Spizien及其學(xué)生建立的枯草芽孢桿菌169菌株轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，它同另一種常用大腸桿菌表達系統(tǒng)相比有著獨特的優(yōu)勢，即可以將轉(zhuǎn)入目的基因表達出的產(chǎn)物分泌到細胞體外，這就降低了進一步收集、分離和純化基因表達產(chǎn)物的成本和工作量。枯草芽孢桿菌能夠在生長過程中產(chǎn)生有用代謝產(chǎn)物，且大部分直接分泌到培養(yǎng)基中，這在簡化生產(chǎn)工藝的同時，也存在菌株自身分泌的降解性蛋白酶會影響表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性甚至?xí)茐谋磉_產(chǎn)物的缺點。近年來有人構(gòu)建的雙蛋白酶和三蛋白酶缺陷的枯草芽孢桿菌DB104和DB403菌株將有助于提高目的基因表達蛋白的穩(wěn)定性

17、。這些都為枯草芽孢桿菌的廣泛應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。1.2.7 枯草芽孢桿菌在環(huán)境保護方面的應(yīng)用78尹文林等不同養(yǎng)殖水體用20億g枯草芽孢桿菌B115株0.5 mgL后，對養(yǎng)殖水體的溶氧和pH無明顯的影響；氨氮最大降解值出現(xiàn)在使用后的第34天，平均降低(45.405.06)；亞硝酸鹽氮的最大降解值出現(xiàn)在使用后第3天，平均降低率為(16.033.82)；硫化物的最大降解值出現(xiàn)在使用后第3.4天，平均降低率為(23.017.27)。與對照組相比有明顯差異(P 0.1)，對總大腸茵群也有明顯的抑制作用。胡詠梅等以5種模擬的污染水樣對枯草芽孢桿菌FY99-01菌株的凈水作用進行了研究。結(jié)果表明，該菌株能迅速降

18、解有機物，在不同處理條件下水樣的COD值都有明顯的下降，48 h COD的去除率達67%以上，96 h厭氧條件下反硝化強度為50.2%，好氧條件下為28.6%，144h總殘渣、過濾性殘渣的降解率分別為61.3%和24.1%，96h降解硫化物達100%。此外，枯草芽孢桿菌在降解多環(huán)芳烴和樂果方面也有較好的應(yīng)用前景。李麗等從長期受多環(huán)芳烴污染的土壤中分離出1株菲降解菌菌，經(jīng)生理生化及16SrDNA析鑒定，該菌株為枯草芽孢桿菌。在單基質(zhì)菲、芘反應(yīng)體系中，該菌株具有較強的降解能力。菌不但可以在高濃度的多環(huán)芳烴存在下生長良好而且對高濃度多環(huán)芳烴有較高的降解能力。馬麗娜等篩選出的一株枯草芽孢桿菌在樂果濃度

19、為1000mgL時，48h的降解率l8.1。國內(nèi)外的研究現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢國外對枯草芽孢桿菌的研究起步比較早，1945年Johnson等報道，枯草芽孢桿菌具有防治植物病害的作用。此后，用枯草芽孢桿菌制備生防制劑防治植物病害的研究成為國內(nèi)外研究的熱點。1980年P(guān)apavizas G C報道，枯草芽孢桿菌可以防治水稻等作物的多種土傳真菌病害。1992年Hwang等報道，用枯草芽孢桿菌可以防治豌豆的Rhizoctoni根腐病。20世紀(jì)90年代后，國外已有多種枯草芽孢桿菌制劑投放市場。美國Agraquest公司用枯草芽孢桿菌(B.subtilis)QST 713菌株和QST 2808菌株分別開發(fā)出活菌殺

20、菌劑SerenadeTM和Souata AS，已在美國登記使用，葉面施用可防治蔬菜、櫻桃、葡萄、葫蘆和胡桃的白粉病、霜霉病、疫病、灰霉病910等細菌和真菌病害。GBO3(商品名為Kodiak)和MBI 600(商品名為Subtilex)分別由美國Gustafson公司和Microbio Ltd公司開發(fā)，根部施用或拌種可防治鐮刀菌(Fusarium spp.)、曲霉屬(Aspergillus spp.)、鏈格孢屬(Alternaria spp.)和絲核菌屬(Rhizoctonia spp.)引起的豆類、麥類、棉花和花生根部病害。2001年Gustafson將解淀粉枯草芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌混合制

21、成混合生防藥劑，稱為BioYield。解淀粉枯草芽孢桿菌變種(B.subtilis var.amyloliquefaciens FZB24)作為植物促長劑被Taensa公司商品化生產(chǎn)，商品名TaegroTM。施用于溫室或室內(nèi)栽培樹苗、灌木和裝飾植物根部，可防治由鐮刀菌和絲核菌引起的根腐病和枯萎病。俄羅斯全俄植保所開發(fā)了枯草芽孢桿菌可濕性粉劑Alifine-B，可用于防治多種作物真菌(Fusarium，Rhizoctonia，Ascohyta，Colletotrichum，Sclerotinia，Botrytis，etc)病害，田間防效高達6095，增產(chǎn)達2535；另一枯草芽孢桿菌產(chǎn)品Gamai

22、r由活菌和代謝物組成，主要防治由Clavibacter michiganense subsp.Michiganense，Erwinia caratovota subsp.Caratovola和Pseudomonas corrugata引起的番茄細菌病害。韓國Bio公司將枯草芽孢桿菌與鏈霉菌抗生素、植物抗真菌多糖混合制成生物殺菌劑Mildewcide，葉面噴施可防治蔬菜和葡萄霜霉病、白粉病，也可防治花卉、水果和水稻真菌病害7。國內(nèi)一些單位也對具有生防作用的枯草芽孢桿菌進行了研究，涉及的防治對象有大田作物的葉部病害、土傳病害和果實病害等。不同菌株的抑菌譜、抑菌作用乃至抑菌機理等亦有較大差異?，F(xiàn)已從

23、作物的根際土壤、根表、植株及葉片上分離篩選出多株對不同作物的真菌和細菌病害具有拮抗作用的枯草芽他桿菌菌株，并采用人工誘變方法提高了菌株的防病效率，對這些菌株進行了發(fā)酵條件的研究，分離出一些抗菌物質(zhì)并對其特性進行了研究，同時開展了生防菌劑的溫室和大田試驗。國內(nèi)已開發(fā)成功并投入生產(chǎn)的枯草芽孢桿菌商品制劑有百抗、麥豐寧、紋曲寧、依天得、根腐消等。云南農(nóng)業(yè)大學(xué)和中國農(nóng)業(yè)大學(xué)共同研制的微生物農(nóng)藥“百抗”(10億g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑)獲得農(nóng)業(yè)部登記注冊，已在多個省推廣使用，推廣面積約4 667hm2，主要防治水稻紋枯病、三七根腐病、煙草黑脛病。百抗的主要有效成分是枯草芽孢桿菌B908。大田應(yīng)用中，百抗對水稻紋枯病防效70以上。其抑菌機制為營養(yǎng)競爭、位點占領(lǐng)等。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)研發(fā)的麥豐寧是由枯草芽孢桿菌菌株B3制成的活體生物殺菌劑，對小麥紋枯病田間防效達5080，其防病機制主要表現(xiàn)在產(chǎn)生抑制小麥紋枯病病菌菌絲生長、菌核形成和菌核萌發(fā)的抗菌物質(zhì)。江蘇蘇科農(nóng)化有限公司的紋曲寧是100億活芽孢ml枯草芽孢桿菌水劑和2.5井岡霉素的復(fù)混制劑，主要防治水稻紋枯病、三七根腐病、煙草黑脛病。百抗的主要有效成分是枯