免疫比濁法檢測(cè)免疫球蛋白

1、免疫比濁法檢測(cè)免疫球蛋白免疫學(xué)系免疫學(xué)系 實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理免疫濁度法是可溶性抗原、抗體在液相中免疫濁度法是可溶性抗原、抗體在液相中特異結(jié)合，產(chǎn)生一定大小的復(fù)合物，形成特異結(jié)合，產(chǎn)生一定大小的復(fù)合物，形成光的折射或吸收，光的折射或吸收，測(cè)定這種折射或吸收后測(cè)定這種折射或吸收后的透射光或散射光的透射光或散射光作為計(jì)算單位。作為計(jì)算單位。免免疫疫比比濁濁法法分分類(lèi)類(lèi)當(dāng)一束光當(dāng)一束光線通過(guò)溶線通過(guò)溶液受到光液受到光散射和光散射和光吸收兩個(gè)吸收兩個(gè)因素的影因素的影響而使光響而使光的強(qiáng)度減的強(qiáng)度減弱弱 透射比濁法和散射比濁法光路透射比濁法和散射比濁法光路檢測(cè)器檢測(cè)器A檢測(cè)器檢測(cè)器B IC I0 I I 透

2、射比濁法透射比濁法 散射比濁法散射比濁法（一）（一）基本原理基本原理v 是個(gè)極其簡(jiǎn)單的方法。在抗原過(guò)量情況下，與待測(cè)是個(gè)極其簡(jiǎn)單的方法。在抗原過(guò)量情況下，與待測(cè)樣品中相應(yīng)的樣品中相應(yīng)的IgIg發(fā)生抗原發(fā)生抗原- -抗體反應(yīng)，形成可溶性復(fù)合抗體反應(yīng)，形成可溶性復(fù)合物，使反應(yīng)介質(zhì)的濁度發(fā)生改變。物，使反應(yīng)介質(zhì)的濁度發(fā)生改變。v 測(cè)量方法利用分光光度計(jì)測(cè)量被吸收的量。讀數(shù)以測(cè)量方法利用分光光度計(jì)測(cè)量被吸收的量。讀數(shù)以吸收單位（吸收單位（A A）或）或ODOD值表示，值表示，A A值反映了入射光和透射光值反映了入射光和透射光的比率。待測(cè)物中的比率。待測(cè)物中IgIg含量可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出。含量可通過(guò)

3、標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出。v 待測(cè)樣品中的抗原含量與吸光度呈正比，而與透射待測(cè)樣品中的抗原含量與吸光度呈正比，而與透射光呈反比。光呈反比。v 反應(yīng)在反應(yīng)在PEGPEG的作用下，加速?gòu)?fù)合物的形成。的作用下，加速?gòu)?fù)合物的形成。 透射比濁法測(cè)定原理光光 源源誘誘導(dǎo)導(dǎo)劑劑樣品光電計(jì)濾光片光源透射比濁法測(cè)定原理透射比濁法的缺陷：(1)溶液中存在的抗原抗體復(fù)合物分子應(yīng)足夠大，分子太小則阻擋不了光線的通過(guò)。(2)溶液中的抗原抗體復(fù)合物的數(shù)量要足夠多。如果數(shù)量太小，溶液濁度變化太小，對(duì)光通量影響不大。(3) 透射比濁是依據(jù)透射光減弱的原理來(lái)定量的，因此只能測(cè)定抗原抗體反應(yīng)的第二階段，檢測(cè)仍需抗原抗體溫育反應(yīng)時(shí)間，檢測(cè)

4、時(shí)間較長(zhǎng)。光通量是每單位時(shí)間到達(dá)、離開(kāi)或通過(guò)曲面光通量是每單位時(shí)間到達(dá)、離開(kāi)或通過(guò)曲面的的光能數(shù)量光能數(shù)量 散射比濁法散射比濁法在入射光的在入射光的一定角度一定角度檢測(cè)粒子發(fā)出的散檢測(cè)粒子發(fā)出的散射光，射光，散射光的強(qiáng)度與散射光的強(qiáng)度與ICIC的含量呈正比的含量呈正比。散射比濁法測(cè)定原理增增 加加 散散 透透 率率 : 660nm 測(cè)測(cè) 定定 散散 射射 光光聚集聚集形成形成誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)劑檢測(cè)器 (LED)光電計(jì)樣品100 %0 %時(shí)間散射光強(qiáng)度（一）（一）基本原理基本原理 是測(cè)定抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的動(dòng)態(tài)過(guò)程。是測(cè)定抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的動(dòng)態(tài)過(guò)程。 所謂速率，是在所謂速率，是在單位時(shí)間內(nèi)單位時(shí)間內(nèi)抗原

5、抗體結(jié)合形成抗原抗體結(jié)合形成 復(fù)合物的速度。將各單位時(shí)間內(nèi)形成復(fù)合物的復(fù)合物的速度。將各單位時(shí)間內(nèi)形成復(fù)合物的 速率及測(cè)定的散射信號(hào)連接在一起，即是動(dòng)態(tài)速率及測(cè)定的散射信號(hào)連接在一起，即是動(dòng)態(tài) 的速率比濁分析。的速率比濁分析。 當(dāng)儀器測(cè)定到某一時(shí)當(dāng)儀器測(cè)定到某一時(shí) 間內(nèi)形成速率下降時(shí)，間內(nèi)形成速率下降時(shí)， 即出現(xiàn)即出現(xiàn)速率峰速率峰，該峰，該峰 值的高低，即代表所值的高低，即代表所 測(cè)抗原的量。測(cè)抗原的量。CONCENTRATIONRATE在速率峰基礎(chǔ)上完成的標(biāo)準(zhǔn)曲線在速率峰基礎(chǔ)上完成的標(biāo)準(zhǔn)曲線方法評(píng)價(jià)：方法評(píng)價(jià)： 敏感度高敏感度高 快速快速( (不必達(dá)平衡）不必達(dá)平衡） 抗原抗體結(jié)合的動(dòng)態(tài)測(cè)定

6、，理論上測(cè)定不抗原抗體結(jié)合的動(dòng)態(tài)測(cè)定，理論上測(cè)定不受本底散射信號(hào)的影響受本底散射信號(hào)的影響 可檢測(cè)微量樣品可檢測(cè)微量樣品2.2.終點(diǎn)散射比濁法終點(diǎn)散射比濁法讓抗原抗體作用一定時(shí)間，使其反應(yīng)讓抗原抗體作用一定時(shí)間，使其反應(yīng)達(dá)到平衡達(dá)到平衡后，后，測(cè)定其測(cè)定其ICIC形成的量。形成的量。ICIC的濁度不再受時(shí)間的影響的濁度不再受時(shí)間的影響，但，但反應(yīng)反應(yīng)ICIC聚合產(chǎn)生絮狀沉淀之前，進(jìn)行濁度測(cè)定。聚合產(chǎn)生絮狀沉淀之前，進(jìn)行濁度測(cè)定。散射比濁法散射比濁法的缺陷的缺陷(1)(1)因?yàn)槭且淮涡詼y(cè)定光吸收值，沒(méi)有考慮每一個(gè)因?yàn)槭且淮涡詼y(cè)定光吸收值，沒(méi)有考慮每一個(gè)待測(cè)樣本的吸收和散射效果，可測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)待測(cè)

7、樣本的吸收和散射效果，可測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確確(2)(2)測(cè)定的仍是抗原抗體反應(yīng)的第二階段，不適測(cè)定的仍是抗原抗體反應(yīng)的第二階段，不適合快速檢測(cè)。合快速檢測(cè)。(3) (3) 終點(diǎn)法存在反應(yīng)本底終點(diǎn)法存在反應(yīng)本底，測(cè)定樣本的含量越低，測(cè)定樣本的含量越低本底比例越大，故在微量測(cè)定時(shí)，本底的干擾本底比例越大，故在微量測(cè)定時(shí)，本底的干擾是影響準(zhǔn)確測(cè)定的重要因素。是影響準(zhǔn)確測(cè)定的重要因素。 影響免疫比濁測(cè)定的因素1 1、抗原抗體比例、抗原抗體比例2 2、抗體的質(zhì)量、抗體的質(zhì)量 抗體的特異性、效價(jià)、親和力抗體的特異性、效價(jià)、親和力3 3、反應(yīng)的溶液、反應(yīng)的溶液4 4、增濁劑的使用、增濁劑的使用1 1、透射比濁操

8、作簡(jiǎn)便，適用于普通的自動(dòng)生化分析儀、透射比濁操作簡(jiǎn)便，適用于普通的自動(dòng)生化分析儀和普通的分光光度計(jì)，幾乎所有的實(shí)驗(yàn)室均能開(kāi)展。不和普通的分光光度計(jì)，幾乎所有的實(shí)驗(yàn)室均能開(kāi)展。不足的是靈敏度和精密度均不夠理想，所需的抗血清量大足的是靈敏度和精密度均不夠理想，所需的抗血清量大，檢測(cè)的周期較長(zhǎng)。，檢測(cè)的周期較長(zhǎng)。2 2、散射比濁的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度、精密度均較高，檢測(cè)快、散射比濁的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度、精密度均較高，檢測(cè)快速。其缺點(diǎn)是需特定的分析儀器，試劑價(jià)格高。速。其缺點(diǎn)是需特定的分析儀器，試劑價(jià)格高。透射比濁法和散射比濁法優(yōu)缺點(diǎn)比較透射比濁法和散射比濁法優(yōu)缺點(diǎn)比較免疫濁度法測(cè)定中應(yīng)注意的問(wèn)題免疫濁度法測(cè)定中應(yīng)

9、注意的問(wèn)題1 1、偽濁度的影響、偽濁度的影響 偽濁度形成原因很復(fù)雜，主要是抗血清含有非特偽濁度形成原因很復(fù)雜，主要是抗血清含有非特異性的交叉反應(yīng)性雜抗體成分；增濁劑濃度和反應(yīng)時(shí)間異性的交叉反應(yīng)性雜抗體成分；增濁劑濃度和反應(yīng)時(shí)間掌握不當(dāng)；樣品本身的濁度處理不當(dāng)；試劑的污染和變掌握不當(dāng)；樣品本身的濁度處理不當(dāng)；試劑的污染和變質(zhì)；器材尤其是比色杯等不夠清潔等因素。質(zhì)；器材尤其是比色杯等不夠清潔等因素。2 2、非特異性散射光的影響、非特異性散射光的影響 免疫濁度法經(jīng)常受內(nèi)源性光散射的干擾，為避免這免疫濁度法經(jīng)常受內(nèi)源性光散射的干擾，為避免這些非特異性光散射的影響，應(yīng)用透射比濁法時(shí)需保證抗些非特異性光散

10、射的影響，應(yīng)用透射比濁法時(shí)需保證抗體組分在體組分在3 3以下，散射比濁法需保證在以下，散射比濁法需保證在 0.50.5以下。以下。 本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用聚乙二醇的生理特性本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用聚乙二醇的生理特性 聚乙二醇是聚乙二醇是中性、無(wú)毒中性、無(wú)毒且具有獨(dú)特理化性質(zhì)和良好的且具有獨(dú)特理化性質(zhì)和良好的生物相溶性的高分子聚合物，生物相溶性的高分子聚合物，聚乙二醇即聚乙二醇即PEGPEG具有高具有高度的親水性度的親水性，在水溶液中有較大的水動(dòng)力學(xué)體積，并，在水溶液中有較大的水動(dòng)力學(xué)體積，并且且沒(méi)有免疫原性沒(méi)有免疫原性。當(dāng)藕聯(lián)到藥物分子或藥物表面時(shí)，。當(dāng)藕聯(lián)到藥物分子或藥物表面時(shí)，可以將其優(yōu)良性質(zhì)賦予修飾后的藥物分子，可以將其優(yōu)良性質(zhì)賦予修飾后的藥物分子，改變它們改變它們?cè)谒芤褐械纳锓峙湫袨楹腿芙庑栽谒芤褐械纳锓峙湫袨楹腿芙庑?，在其修飾的藥，在其修飾的藥物周?chē)a(chǎn)生空間屏障，減少藥物的酶解，避免在腎臟物周?chē)a(chǎn)生空間屏障，減少藥物的酶解，避免在腎臟的代謝中很快消除，并使藥物能被免疫系統(tǒng)的細(xì)胞識(shí)的代謝中很快消除，并