選修3專(zhuān)題一基因工程——PCR技術(shù)考點(diǎn)精析

1、 “PCR技術(shù)”考點(diǎn)精析在2018年考綱中將“PCR技術(shù)”列入考試范圍，應(yīng)引起重視。PCR是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)，能以極少量的DNA為模板，在幾小時(shí)內(nèi)復(fù)制出上百萬(wàn)份的DNA拷貝。一、PCR（多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)原理雙鏈DNA單鏈DNA加熱，雙螺旋結(jié)構(gòu)解體緩慢冷卻，分離的DNA鏈重新結(jié)合PCR（多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)原理是DNA雙鏈復(fù)制，利用了DNA的熱變性原理，通過(guò)控制溫度來(lái)控制雙鏈的解聚與結(jié)合。即：二、PCR反應(yīng)的條件1.模板：DNA兩條鏈提供復(fù)制的模板。2.酶：解旋酶打開(kāi)DNA雙鏈，熱穩(wěn)定DNA聚合酶催化合成DNA子鏈。3.原料：4種脫氧核苷酸（A、T、C、G）用于合成子鏈的原料

2、。4.能量：ATP為復(fù)制過(guò)程提供能量。5.引物：使DNA聚合酶從引物的3端開(kāi)始連接脫氧核苷酸。6.溫度和PH:溫度為909555607075，緩沖溶液維持反應(yīng)的pH值不變。三、PCR反應(yīng)的過(guò)程PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)都包括變性、復(fù)性、延伸三步。在循環(huán)之前，常要進(jìn)行一次預(yù)變性，以增加大分子模板DNA徹底變性的概率。PCR的反應(yīng)過(guò)程都是在PCR擴(kuò)增儀中完成的。1.變性：當(dāng)溫度上升到90以上時(shí)，雙鏈DNA解聚為單鏈，(如下圖)。2.復(fù)性：系統(tǒng)溫度下降至50左右時(shí)，兩種引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合，(如下圖)。3延伸：系統(tǒng)溫度上升至72左右時(shí)，溶液中的四種脫氧核苷酸(A、T、

3、G、C)在熱穩(wěn)定DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈，(如下圖)。 第一輪的產(chǎn)物作為第二輪的模板，第二輪的產(chǎn)物作為第三輪的模板，第二輪循環(huán)開(kāi)始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應(yīng)，并且由引物延伸而成的DNA單鏈會(huì)與引物結(jié)合，進(jìn)行DNA的延伸。DNA聚合酶只能特異地復(fù)制處于兩個(gè)引物之間的DNA序列，是這段特點(diǎn)長(zhǎng)度的序列呈指數(shù)擴(kuò)增。PCR實(shí)驗(yàn)中使用的設(shè)備、緩沖液等在使用前都要高壓滅菌。四、PCR擴(kuò)增的結(jié)果及含量計(jì)算1結(jié)果：變性、復(fù)性、延伸三步反應(yīng)完成后，一個(gè)DNA分子就變成了2個(gè)DNA分子隨著重復(fù)次數(shù)的增加，DNA分子就以2n的形式增加。 2DNA含量計(jì)算公式：DNA含量（g

4、mL）50*×(260nm的讀數(shù)) ×稀釋倍數(shù)。五、PCR擴(kuò)增與DNA復(fù)制項(xiàng)目DNA復(fù)制PCR擴(kuò)增不同點(diǎn)場(chǎng)所細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞外能量ATP提供能量不需ATP提供能量酶解旋酶、DNA聚合酶耐高溫的TaqDNA聚合酶是否有轉(zhuǎn)錄伴有轉(zhuǎn)錄,產(chǎn)生引物無(wú)轉(zhuǎn)錄,需加入兩種引物特點(diǎn)邊解旋邊復(fù)制，半保留復(fù)制體外迅速擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)受生物體自身控制30多次緩沖液不需要需要人為控制設(shè)備無(wú)嚴(yán)格控制溫度變化的溫控設(shè)備相同點(diǎn)原料四種脫氧核苷酸復(fù)制原理嚴(yán)格遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則模板DNA為模板引物都需要與模板相結(jié)合的引物1、利用PCR技術(shù)可獲得目的基因，下列相關(guān)敘述正確的是（）A在用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA時(shí)，DNA的復(fù)

5、制過(guò)程與細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制類(lèi)似BPCR反應(yīng)體系中需添加磷酸、脫氧核糖和含氮的堿基作為原料CPCR 體系中需要添加從受體細(xì)胞中提取的解旋酶和DNA聚合酶DPCR反應(yīng)中溫度的周期性改變是為了DNA聚合酶催化不同的反應(yīng)2、PCR是一種體外快速擴(kuò)增DNA的方法，用于放大特定的DNA片段，數(shù)小時(shí)內(nèi)可使目的基因片段擴(kuò)增到數(shù)百萬(wàn)個(gè)。PCR需要模板DNA、引物、脫氧核苷酸和DNA聚合酶等條件。下圖為模板DNA分子及2種引物，請(qǐng)據(jù)圖回答相關(guān)問(wèn)題：（1）PCR的全稱是 。PCR與體內(nèi)DNA復(fù)制的不同之外主要表現(xiàn)在溫度環(huán)境的不同，在PCR技術(shù)中先用95 高溫處理的目的是 ，而這一過(guò)程在細(xì)胞內(nèi)是通過(guò) 實(shí)現(xiàn)的。（2）在

6、PCR技術(shù)中所需要的引物實(shí)質(zhì)上是一種 。請(qǐng)?jiān)趫D中繪出引物結(jié)合的位置。（3）若將1個(gè)DNA分子拷貝10次，則需要在緩沖液中至少加入 個(gè)引物。（4）DNA子鏈復(fù)制的方向是 ，這是由于 。3、PCR是一種DNA體外擴(kuò)增技術(shù)。 1988年，PCR儀問(wèn)世，并被廣泛應(yīng)用于基因擴(kuò)增和DNA序列測(cè)定。如圖是PCR技術(shù)示意圖，請(qǐng)回答下列問(wèn)題：（11分/6min）標(biāo)準(zhǔn)的PCR過(guò)程一般分為 、 、 三大步驟。引物是此過(guò)程中必須加入的物質(zhì)，從化學(xué)本質(zhì)上說(shuō)，引物是一小段 。微量DNA樣品DNA互補(bǔ)鏈分離開(kāi)為單鏈以單鏈為模板合成子代DNA循環(huán)重復(fù)將雙鏈DNA _ ，使之變性，從而導(dǎo)致 。引物延伸需提供 作為原料。4、聚合

7、酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR技術(shù))是在實(shí)驗(yàn)室中以少量樣品DNA制備大量DNA的生化技術(shù)，反應(yīng)系統(tǒng)中包括微量樣品DNA、DNA聚合酶、引物、足量的4種脫氧核苷酸及ATP等。反應(yīng)中新合成的DNA又可以作為下一輪反應(yīng)的模板，故DNA數(shù)以指數(shù)方式擴(kuò)增，其簡(jiǎn)要過(guò)程如右圖所示。（1）某個(gè)DNA樣品有1000個(gè)脫氧核苷酸，已知它的一條單鏈上堿基A:G:T:C=1:2:3:4，則經(jīng)過(guò)PCR儀五次循環(huán)后，將產(chǎn)生 個(gè)DNA分子，其中需要提供胸腺嘧啶脫氧核苷酸的數(shù)量至少是 個(gè)。（2）分別以不同生物的DNA樣品為模板合成的各個(gè)新DNA之間存在差異，這些差異是 。（3）請(qǐng)指出PCR技術(shù)與轉(zhuǎn)錄過(guò)程的三個(gè)不同之處： 5、資料顯示，近

8、十年來(lái)，PCR技術(shù)（DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)）成為分子生物實(shí)驗(yàn)的一種常規(guī)手段，其原理是利用DNA半保留復(fù)制的特性，在試管中進(jìn)行DNA的人工復(fù)制（如下圖），在很短的時(shí)間內(nèi)，將DNA擴(kuò)增幾百萬(wàn)倍甚至幾十億倍，使分子生物實(shí)驗(yàn)所需的遺傳物質(zhì)不再受限于活的生物體。請(qǐng)據(jù)圖回答：（1）加熱至94的目的是使DNA樣品的 鍵斷裂，這一過(guò)程在生物體細(xì)胞內(nèi)是通過(guò) 酶的作用來(lái)完成的。通過(guò)分析得出新合成的DNA分子中，A=T，C=G，這個(gè)事實(shí)說(shuō)明DNA分子的合成遵循 。（2）新合成的DNA分子與模板DNA分子完全相同的原因是 和 。（3）通過(guò)PCR技術(shù)使DNA分子大量復(fù)制時(shí)，若將一個(gè)用15N標(biāo)記的模板DNA分子（第一代

9、）放入試管中，以14N標(biāo)記的脫氧核苷酸為原料，連續(xù)復(fù)制到第五代時(shí)，含15N標(biāo)記的DNA分子單鏈數(shù)占全部DNA總單鏈數(shù)的比例為 。（4）PCR技術(shù)不僅為遺傳病的診斷帶來(lái)了便利，而且改進(jìn)了檢測(cè)細(xì)菌和病毒的方法。若要檢測(cè)一個(gè)人是否感染了艾滋病病毒，你認(rèn)為可以用PCR擴(kuò)增血液中的（ ）A白細(xì)胞DNA B病毒蛋白質(zhì) C血漿抗體 D病毒核酸PCR技術(shù)”考點(diǎn)精析參考答案1、【解析】選A。PCR方法擴(kuò)增目的基因的原理就是DNA雙鏈復(fù)制，A項(xiàng)正確；PCR反應(yīng)體系中需添加脫氧核糖核苷酸作為原料，B錯(cuò)誤；PCR過(guò)程中是通過(guò)高溫使氫鍵斷裂的，因此不需要加入解旋酶，C項(xiàng)錯(cuò)誤；PCR反應(yīng)中溫度的周期性改變是為了變性、復(fù)性

10、、延伸，而不是為了DNA聚合酶催化不同的反應(yīng)，D項(xiàng)錯(cuò)誤。2、【解析】PCR技術(shù)又稱多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。在PCR技術(shù)中，用95 高溫處理的目的是使DNA分子中的氫鍵斷裂，兩條鏈解開(kāi)，即使DNA分子變性。引物是一種單鏈DNA或RNA分子，它能與解開(kāi)的DNA母鏈的3端結(jié)合，為DNA聚合酶提供吸附位點(diǎn)，使DNA聚合酶從引物的3端開(kāi)始連接脫氧核苷酸，從而決定了DNA子鏈復(fù)制的方向是從5端到3端。在DNA分子擴(kuò)增時(shí)，需要2種引物，由于新合成的子鏈都需要引物作為復(fù)制的起點(diǎn)，故所需的引物數(shù)目等于新合成的DNA子鏈數(shù)目，即2×21022112(個(gè))?！敬鸢浮?1)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 使DNA變性(使DNA的兩條鏈解開(kāi))解旋酶的催化(2)單鏈DNA或RNA分子如圖所示：(3)2112(4)從5端到3端 DNA聚合酶只能從引物的3端開(kāi)始連接單個(gè)脫氧核苷酸分子3、【解析】標(biāo)準(zhǔn)的PCR過(guò)程一般分為高溫變性、低溫復(fù)性、中溫延伸三大步驟引物是一小段單鏈DNA或RNA。高溫變性時(shí)，需要將雙鏈DNA加熱到95，使之變性，從而導(dǎo)致雙鏈DNA分離成兩條單鏈。中溫延伸是