胚胎不同器官的細(xì)胞連接蛋白基因表達(dá)研究

1、    胚胎不同器官的細(xì)胞連接蛋白基因表達(dá)研究        【摘要】目的探索胚胎不同分化階段、不同器官中細(xì)胞連接蛋白基因的表達(dá)規(guī)律及其與細(xì)胞分化的關(guān)系。方法采用Connexin系列基因探針，通過(guò)Northern印跡法，對(duì)不同胎齡的不同胚胎器官中Cx基因表達(dá)狀態(tài)進(jìn)行了研究。結(jié)果(1)胚胎期肝、胃、肺、腎等器官中Cx31、Cx46、Cx31.1不表達(dá)。(2)胚胎不同發(fā)育階段連接蛋白基因呈不同表達(dá)狀態(tài)。如Cx26、Cx43在3個(gè)月胎齡的肝臟中高度表達(dá)、Cx32從第5周至第5月都呈

2、高度表達(dá)；(3)連接蛋白基因表達(dá)有器官差異性，肝Cx32、胃Cx37、肺Cx40和腎Cx43基因高度表達(dá)。(4)連接蛋白基因在各器官中表達(dá)又有交叉性，Cx26在上述肝、胃、腎等器官中呈不同表達(dá)狀態(tài)。(5)細(xì)胞連接蛋白基因的表達(dá)狀態(tài)與組織細(xì)胞的分化基本一致。結(jié)論它們可能是調(diào)節(jié)胚胎組織分化、細(xì)胞增殖及形態(tài)發(fā)生過(guò)程中某些分化事件的關(guān)鍵性候選基因。【關(guān)鍵詞】連接蛋白基因表達(dá)胚胎EXPRESSION OF CONNEXIN GENES IN VARIOUS ORGANS OF EMBRYOZhang Jianxiang， Li Guiyuan， Zhang Xiaohui(Department of H

3、istology and Embryology Hunan Medical University,Changsha)【Abstract】 Objective In order to investigate the relationship between the expression regulation of Cx genes and cellular differentiation in various organs during embryonic development.Methods Using connexin genes Cx26,Cx31,Cx31.1,Cx32,Cx37,Cx

4、40,Cx43 and Cx46 as the molecular probes,the Northern blot hybrydization was done,we studied the expression level of Cx genes in different stages of embryonic organs.Results Conclusion Cx gene might be a key condidate gene to regulate some differentiational events associated with cellular differenti

5、ation,proliferation,morphogenesis in early embryo.【Key Words】 Connexin； Gene; Expression; Embryo通過(guò)縫隙連接蛋白(connexin,Cx)分離及其基因克隆，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)連接蛋白基因(connexin genes)是一個(gè)有10多個(gè)成員的超基因家族1?？p隙連接在胚胎發(fā)育早期就存在，它們對(duì)胚胎細(xì)胞分化、形態(tài)發(fā)生及生長(zhǎng)調(diào)控起重要作用2；在成體組織和體外培養(yǎng)的細(xì)胞，它們與細(xì)胞分化密切相關(guān)3。Cx基因的表達(dá)狀態(tài)決定了細(xì)胞縫隙連接通道的形式、連接通訊通道的形態(tài)結(jié)構(gòu)和數(shù)量、也決定了通訊通道消亡。Cx基因的表達(dá)對(duì)細(xì)胞誘導(dǎo)

6、、分化、增殖、細(xì)胞程序性死亡及衰老等生物過(guò)程有著十分密切的關(guān)系。胚胎早期，神經(jīng)系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng)尚未建立或未發(fā)育完善，長(zhǎng)距離信息傳遞難以進(jìn)行。要使胚胎細(xì)胞向各種組織器官分化，離不開(kāi)細(xì)胞間化學(xué)信息的交換。在個(gè)體發(fā)育1216h的桑葚胚期即可見(jiàn)縫隙連接形成，但它隨胚胎發(fā)育而經(jīng)常發(fā)生動(dòng)態(tài)變化。雞胚發(fā)育2036h，外胚層細(xì)胞間有密集的細(xì)胞縫隙連接，至48h，縫隙連接逐漸減少，而橋粒變得明顯4。Warner等5將細(xì)胞連接蛋白抗體注入非洲爪蟾8細(xì)胞期早期胚胎，以阻斷通訊通道；結(jié)果注射過(guò)抗體的卵裂球的發(fā)育出現(xiàn)明顯的區(qū)域性形態(tài)缺陷現(xiàn)象：腦和眼發(fā)育不良或完全缺失，這些缺陷可能是直接阻斷了控制局部分化的信息傳遞而造成的

7、。從而提供了第一個(gè)關(guān)于縫隙連接在早期胚胎發(fā)育中起重要作用的直接證據(jù)，表明連接蛋白基因表達(dá)可能是細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控和器官發(fā)育過(guò)程中某些分化事件的關(guān)鍵性候選基因。為了探索胚胎發(fā)育過(guò)程中不同器官不同分化階段的細(xì)胞連接蛋白基因的表達(dá)規(guī)律及其與細(xì)胞分化的關(guān)系，本研究采用Cx基因系列作為分子探針，通過(guò)Northern印跡法，對(duì)不同時(shí)期胚胎肝、腎、肺和胃的Cx基因表達(dá)狀態(tài)進(jìn)行了研究。材料和方法1. 材料收集胚胎標(biāo)本28例；其中5周、6周各5例，35個(gè)月各6例，母體健康；取胚胎肝、胃、肺、腎等組織塊置于液氮中貯存。胎齡按月經(jīng)齡減2周計(jì)算。2. DNA探針的制備2.1質(zhì)粒DNA的抽提：分別將8種攜帶pCx質(zhì)粒及內(nèi)對(duì)照

8、pGAPDH質(zhì)粒的細(xì)菌小量復(fù)蘇后，劃瓊脂平皿，37過(guò)夜培養(yǎng)。次日挑取單個(gè)克隆進(jìn)行小量擴(kuò)增，采用堿裂解法快速提取質(zhì)粒，用相應(yīng)的內(nèi)切酶消化鑒定。鑒定確認(rèn)后的克隆進(jìn)行大量擴(kuò)增和抽提質(zhì)粒DNA6，質(zhì)粒資料見(jiàn)表1。(所用質(zhì)粒均由本校腫瘤研究所李桂源教授從美國(guó)帶回，惠贈(zèng))。表1所用質(zhì)粒資料一覽表Table 1 A list of plasmids containing Cx cDNA質(zhì)粒plasmids載體vectors限制性內(nèi)切酶restriction enzymes插入片斷(kb)inserts(kb)種屬species質(zhì)粒Cx26(pCx26)pSG5BamH0.68人(human)質(zhì)粒Cx31.1

9、(pCx31.1)SP63TBg1 0.85小鼠(mouse)質(zhì)粒Cx32(pCx32)pGEM3EcoR 1.5大鼠(rat)質(zhì)粒Cx33(pCx33)SP64TBg1 0.9大鼠(rat)質(zhì)粒Cx37(pCx37)SP64THind /Xba1.25小鼠(mouse)質(zhì)粒Cx40(pCx40)pGEM4zEcoR /Xba1.1小鼠(mouse)質(zhì)粒Cx43(pCx43)pSG5BamH1.11人(human)質(zhì)粒Cx46(pCx46)BSK+EcoR 1.6人(human)內(nèi)對(duì)照質(zhì)粒(pGAPDH)/EcoR /Hind 0.6人(human)   

10、0; 2.2質(zhì)粒DNA內(nèi)切酶消化和片斷回收：以1g DNA與23IU內(nèi)切酶的比例，37，6090min消化質(zhì)粒，然后在1%的瓊脂糖凝膠上電泳分離。于紫外燈下觀察，并切下插入目的片斷的DNA，用低熔點(diǎn)瓊脂糖法和Glass MAX(GIBOL-BRL公司)試劑盒回收、純化。測(cè)OD值確定濃度，4貯存?zhèn)溆谩?3. 胚胎組織細(xì)胞總RNA抽提胚胎組織細(xì)胞總RNA抽提程序：分別將貯存于液氮中的不同發(fā)育時(shí)期肝、胃、肺、腎組織塊經(jīng)單細(xì)胞制備儀制成單細(xì)胞，細(xì)胞總RNA的提取按異硫氰酸胍-酚-氯仿一步抽提法制備。具體步驟如下：在冰上按每107細(xì)胞加1ml裂解液(包括4mmol/L)異硫氰酸胍，0.5%十二烷基機(jī)氨酸

11、鈉，0.1mmol/L -巰基乙醇)裂解細(xì)胞；收集裂解液于50ml離心管中，分步加入并混勻1/10體積2mmol NaAc(pH4.0)，等體積水飽和酚、1/5體積氯仿-異戊醇(491)；冰浴15min后，于4，10 000g離心20min，取上清加等量異丙醇，-20靜置1h，4，10 000g離心10min棄上清，將沉淀重溶于0.5ml裂解液，再用等體積異丙醇沉淀1次，經(jīng)75%酒精洗滌，空氣干燥，溶于適量的DEPC處理水中。RNA濃度經(jīng)分光光度計(jì)測(cè)定。4. Northern雜交4.1RNA電泳和轉(zhuǎn)膜：每道20g RNA，在1%瓊脂糖甲醛變性凝膠上50V電泳4h，用DEPC處理水淋洗凝膠數(shù)次，

12、20×SSC浸泡45min，采用紙巾轉(zhuǎn)移法將凝膠中的RNA轉(zhuǎn)移至尼龍膜上，1.6 J/cm2紫外線交聯(lián)固定。4.2探針標(biāo)記：取回收的質(zhì)粒DNA片斷，以-32PdCTP(北京亞輝生物醫(yī)學(xué)工程公司)為標(biāo)記物，用隨機(jī)引物標(biāo)記盒(Promege公司)標(biāo)記探針。50l反應(yīng)體積中包括：模板DNA50ng，1×標(biāo)記緩沖液，3種非標(biāo)記核苷酸(dATP、dGTP、dTTP)各20mol,BSA 0.4g/L,Klenow酶5 IU，-32PdCTP 50Ci，于室溫標(biāo)記過(guò)夜。Sephardex G-50柱層析法純化標(biāo)記探針，測(cè)定探針比放射活性大于1×108cpm/g DNA。4.3

13、RNA-DNA雜交：用一張膜先后與Cx探針和GAPDH探針雜交，即與Cx探針雜交、曝光、顯影后，用煮沸的0.1% SDS搖洗尼龍膜至室溫，重復(fù)2次，使Cx探針洗脫，再與GAPDH探針雜交。具體雜交過(guò)程如下：尼龍膜在雙蒸水中浸濕后，6×SSC浸泡10min，然后在預(yù)雜交液(50%甲酰胺，5×SSPE，5×Denhardt,0.1%SDS，100mg/L ssDNA)中42預(yù)雜交4h，棄預(yù)雜交液，換同樣液體加探針，42，雜交過(guò)夜(1624h)。用2×SSC,0.1%SDS于37洗膜2次，每次20min，然后用0.1×SSC,0.1%SDS于65洗膜

14、3次，每次20min。再將膜與X線片一同放入暗匣內(nèi)，-70曝光315d，取出X線片，顯影、定影。結(jié)果采用細(xì)胞連接蛋白基因Cx26、Cx31、Cx31.1、Cx32、Cx37、Cx40、Cx43和Cx46作為分子探針，通過(guò)Northern印跡法，發(fā)現(xiàn)不同發(fā)育階段的胚胎不同器官的Cx基因表達(dá)呈不同狀態(tài)(見(jiàn)Cx基因表達(dá)片)。不同胚胎器官Cx基因家族中Cx31、Cx31.1、Cx46不表達(dá)；而其他Cx基因則呈不同表達(dá)狀態(tài)。1、3所示胎肝Cx26、Cx43在3個(gè)月胎齡時(shí)高度表達(dá)、2可見(jiàn)Cx32從第5周至5個(gè)月都呈高度表達(dá)。4為胃中Cx37的表達(dá)狀態(tài)。肺中Cx40在35月呈高度表達(dá)；胎腎中Cx43的表達(dá)狀

15、態(tài)從35月逐漸增強(qiáng)。Cx26、Cx32、Cx43，在肝、胃、腎等器官中不同程度表達(dá)；呈現(xiàn)出表達(dá)差異，結(jié)果見(jiàn)表2。表2不同胎齡不同器官的Cx基因表達(dá)Table 2 Expression of Cx genes in different organs at different fetal ages連接蛋白基因3個(gè)月3 month4個(gè)月4 month5個(gè)月5 monthCxgenes肝liver胃stomach肺lung腎kidney肝liver胃stomach肺lung腎kidney肝liver胃stomach肺lung腎kidneyCx26+-+-+Cx31-Cx31.1-Cx32+Cx37-+

16、-+-+-Cx40-+-+-+Cx43+-+-+Cx46-     +：高度表達(dá)，+：中度表達(dá)，+：低度表達(dá)，-：不表達(dá)或微弱表達(dá)+：high expression,+:middle expression,+:lower expression,-:no or weak expression 從以上Cx基因的表達(dá)狀態(tài)可以看出：(1)在胚胎不同發(fā)育階段及不同器官中連接蛋白基因呈不同的表達(dá)狀態(tài)。(2)連接蛋白基因表達(dá)有器官多樣性，如肝Cx32、胃Cx37、肺Cx40和腎Cx43基因表達(dá)。(3)連接蛋白基因在各種組織中的表達(dá)又有交叉性，如Cx26上述不同器官中呈

17、現(xiàn)出不同表達(dá)狀態(tài)。(4)胚胎期肝、胃、肺、腎等器官中Cx31、Cx46、Cx31.1不表達(dá)。討論連接蛋白基因表達(dá)呈器官多樣性，表明不同器官的組織細(xì)胞間縫隙連接方式不同。形態(tài)學(xué)研究證實(shí)，不同細(xì)胞間縫隙連接通道類型、大小及通訊方式各不相同4。我們認(rèn)為Cx基因表達(dá)的多樣性可能與轉(zhuǎn)錄和翻譯出不同的細(xì)胞連接蛋白，裝配成不同的縫隙連接通道有關(guān)。連接蛋白基因在各器官中的表達(dá)呈交叉性，如Cx26、Cx32不僅在肝臟表達(dá)，也存在于腎、肺、胃中，此現(xiàn)象與Willecke7的研究結(jié)果完全一致。說(shuō)明不同器官的同類組織細(xì)胞間裝配有相同的通訊通道。故Cx基因表達(dá)呈現(xiàn)交叉性。王繩琦8認(rèn)為在胚胎發(fā)育早期縫隙連接出現(xiàn)，使在生長(zhǎng)

18、控制、形態(tài)建立和細(xì)胞分化中起調(diào)節(jié)作用的物質(zhì)通過(guò)細(xì)胞間轉(zhuǎn)運(yùn)成為可能。神經(jīng)胚期脊索與外胚層之間的縫隙連接使脊索誘導(dǎo)外胚層發(fā)育形成神經(jīng)管成為可能。Cx32在第5周至5個(gè)月胚胎肝中呈高度表達(dá)，與曾彌白9觀察的結(jié)果一致，他認(rèn)為，各器官原基范圍內(nèi)的細(xì)胞各自獲得進(jìn)一步分化的能力是和縫隙連接在同種細(xì)胞間的大量出現(xiàn)分不開(kāi)的。本實(shí)驗(yàn)支持此觀點(diǎn)。肝臟由內(nèi)胚層形成肝憩室，其內(nèi)胚層細(xì)胞向肝細(xì)胞分化離不開(kāi)細(xì)胞間化學(xué)信息的交換。Cx32基因高度表達(dá)與肝細(xì)胞分化、增殖基本一致。Eghbali10將Cx32全長(zhǎng)的cDNA轉(zhuǎn)染到通訊缺陷的肝癌細(xì)胞內(nèi)，Cx32 mRNA表達(dá)水平明顯升高，膜上縫隙連接數(shù)目明顯增加。同時(shí)發(fā)現(xiàn)Cx32轉(zhuǎn)

19、染后的癌細(xì)胞生長(zhǎng)迅速下降，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)恢復(fù)正常。證實(shí)Cx32基因表達(dá)能直接促進(jìn)細(xì)胞分化。Cx40在胚胎肺高度表達(dá)，可能與呼吸系統(tǒng)原基的內(nèi)胚層細(xì)胞分化為呼吸上皮有關(guān)。Cx43在胚胎腎3個(gè)月時(shí)表達(dá)，可能與腎單位的發(fā)生有關(guān)；因人腎經(jīng)歷了前腎、中腎及后腎發(fā)生過(guò)程；直到胚胎第3個(gè)月后腎內(nèi)才開(kāi)始有真正的腎單位形成，隨該基因表達(dá)不斷增強(qiáng)腎單位不斷發(fā)育。Cx43在胚胎肝第520周呈不同表達(dá)狀態(tài)，可能與胚胎肝臟的造血功能有關(guān)。因Cx43在健康肝臟中不表達(dá)，僅存于肝細(xì)胞癌中11。胚胎早期造血細(xì)胞從卵黃囊遷入肝臟，此時(shí)Cx43表達(dá)微弱，隨后即迅速增強(qiáng)。至胚胎第3個(gè)月時(shí)造血組織占肝臟重量的30%35%此時(shí)Cx43表達(dá)達(dá)

20、到高峰。隨著脾、胸腺、骨髓腔的形成，肝內(nèi)造血細(xì)胞大多遷入上述器官，5個(gè)月胚胎肝內(nèi)Cx43基因表達(dá)明顯降低，動(dòng)態(tài)地反映了肝臟造血功能減弱狀態(tài)。Cx基因轉(zhuǎn)染再表達(dá)研究表明Cx基因表達(dá)與細(xì)胞分化密切相關(guān)2。我們的研究表明：該基因的表達(dá)狀態(tài)與胚胎細(xì)胞分化基本一致，故認(rèn)為胚胎發(fā)育過(guò)程中，Cx基因表達(dá)對(duì)胚胎細(xì)胞分化具有重要作用。         1胚胎肝Cx26第5周呈微弱表達(dá)，第7周與第5個(gè)月低度表達(dá)，第3個(gè)月時(shí)高度表達(dá)、第4個(gè)月時(shí)呈中度表達(dá)2胚胎肝Cx32從第5周20周(5個(gè)月)都呈高度表達(dá)3胚胎肝Cx43第5和7周表達(dá)微

21、弱，第3個(gè)月胎齡時(shí)高度表達(dá)，第4月和第5月時(shí)表達(dá)明顯降低4胚胎胃Cx37從第35個(gè)月都呈高度表達(dá)狀態(tài)Fig.1 Cx26 gene in the liver of fetal is weak expression at the 5th week,lower expression at the 7th week and 5th month,high expression at the 3rd month (11th and 12th week),middle expression at the 4th month (14th and 16th week).Fig.2 Cx32 gene in t

22、he liver of fetal shows high expression from the 5th week to 5th month.Fig.3 Cx43 gene expression in the liver of fetal is weak from the 5th to 7th week,high expression at the 3rd month,and middle expression during the 4th to 5th month.Fig.4 Cx37 gene in the liver of fetal shows high expression from

23、 the 3rd month to 5th month. Cancer Research Institute,Hunan Medical University,Changsha 410078,China作者單位:張建湘?張小慧(湖南醫(yī)科大學(xué)組織學(xué)胚胎學(xué)教研室，長(zhǎng)沙410078)李桂源(湖南醫(yī)科大學(xué)腫瘤所) 參考文獻(xiàn)1Beyer EC,Paul DL,Goodenough DA.Connexin family of gap junction proteins.J Membr Biol,1990,116:(2),1872張志謙，林仲翔.連接蛋白家族、細(xì)胞間隙連接通訊與腫瘤抑制.生理科學(xué)進(jìn)展，1994，25(2)：1213林仲翔.間歇連接通訊-生長(zhǎng)調(diào)控-癌變?nèi)咧g的關(guān)系.細(xì)胞生物學(xué)雜志，1988，10(3)：1114成令忠主編.組織學(xué).第2版，北京：人民衛(wèi)生出版社，1994：1881925Warner AW,Guthrie,