種子發(fā)育相關性狀影響含油量的遺傳學機制

1、國家重點基礎研究發(fā)展計劃973計劃課題任務書項目名稱：油菜籽油脂形成的分子生物學機制及其代謝調控課題名稱：種子發(fā)育相關性狀影響含油量的遺傳學機制課題編號：2006CB101604中華人民共和國科學技術部制2006年09月01日一、研究內容油菜種子既是維持世代延續(xù)的繁殖器官，也是油菜的產品油脂和蛋白質的儲藏器官。油菜種子中油脂、蛋白質和粗纖維大約各占35-45，28-32和7-15，其比例有著明顯的消長關系；油菜種子大?。Ｖ兀┦怯筒水a量的直接構成因素；油菜種子發(fā)育和最終形成受到一系列復雜的遺傳和環(huán)境因素的影響，種子成熟過程中，特別是后期的溫度逆境對種子產量和質量會產生嚴重的負面效應。本課題將從

2、上述三個方面對影響油菜種子含油量和產量的種子發(fā)育相關性狀開展研究，試圖深入了解控制這些性狀的遺傳及分子機理，為有效調控油菜種子發(fā)育以提高種子含油量和產量提供理論依據。本研究的特色主要體現在：1. 選用多種來源的材料，將遺傳基礎復雜的性狀， 如甘藍型黃籽形成的遺傳和生化控制，分解成單個組成因素進行深入剖析；2.既研究性狀的單基因和多基因控制，也研究基因網絡上重要基因的互作。本研究的創(chuàng)新點主要有：1. 將為解決一些長期困擾育種家的難題提供答案，如甘藍型油菜中黃籽性狀、種子大小的基因控制，油菜中有關種皮色素合成的分子機制等；2.將克隆一批對種子含油量和產量相關性狀有重要影響的基因，并分析這些基因間的

3、相互作用；3.將對種子發(fā)育過程中基因表達特征、不同基因對環(huán)境因素的應達反應，以及這些反應對調控種子發(fā)育性狀的意義有新的認識，進而提出通過調控種子發(fā)育相關性狀提高含油量和籽粒產量的分子操作途徑。1種皮厚薄及黃籽性狀的分子遺傳學機制精細定位與粒色和種皮性狀有關的主效基因和QTL；克隆種皮發(fā)育，木質素和種皮纖維素生物合成的關鍵調控基因和結構基因，明確其影響種皮纖維素積累的分子機理；分析黃色種皮形成的遺傳機理，克隆與種皮色素生物合成與沉積有關的重要調控基因，研究它們與重要結構基因啟動子的關鍵順式元件的作用機理。2控制油菜種子大小的基因網絡及重要基因的功能分析利用油菜籽大小突變體和近等基因系研究籽粒大小

4、對油分積累和籽粒產量的影響；定位與種子大小相關的主效基因和QTL；利用定位結果和擬南芥的分子生物信息學,分離克隆與油菜籽粒大小有關的重要基因3-5個,利用酵母雙雜交系統(tǒng)建立與種籽大小有關的蛋白質及相應基因的互作網絡;通過基因失活或超量表達等技術，分析基因網絡上關鍵基因的功能。3影響油菜結實重要基因的鑒定和功能分析利用作圖群體分析不同生態(tài)條件下油菜結實性狀表現,定位影響種子后期成熟的相關基因；利用擬南芥和油菜花器官形成及種子發(fā)育突變體分離相關基因，用擬南芥cDNA 和油菜種子特異EST芯片, 建立不同發(fā)育階段油菜種子的基因表達譜，分析在長江中下游地區(qū)熱害條件下油菜種子中相關基因的差異表達,克隆3

5、-5個結實相關基因并分析其功能。1. 二、預期目標深入了解控制種皮厚薄，籽粒顏色以及油菜種子大小控制的分子遺傳學機理。2. 克隆10個以上與種皮厚薄，種皮顏色，種子大小，種子結實效率等種子發(fā)育有關的基因，并對其中3-5個基因的功能進行詳細分析。3. 發(fā)表SCI論文57篇，申請專利1-2項。提出通過調控種子發(fā)育相關性狀提高含油量及籽粒產量的分子操作途徑。三、研究方案及技術路線1、種皮厚薄及黃籽性狀的分子遺傳學機制1） 以華中農大構建的DH系作圖群體（HZ）和西南大學構建的重組自交系群體（SW）為材料， 采集多年多點性狀數據，利用SSR、AFLP、SRAP等標記精細定位與粒色和種皮性狀有關的主效基

6、因和QTL，建立600個以上標記的遺傳連鎖圖譜，提出2篇有關油菜粒色和種皮性狀主效基因和QTL分析的SCI論文（2007、2009）。2） 以油菜黃、黑籽近等基因系為材料，利用擬南芥的分子生物學信息，克隆種皮發(fā)育，木質素和種皮纖維素生物合成的關鍵調控基因和結構基因，明確其影響種皮纖維素積累的分子機理。提出2篇有關種皮發(fā)育，木質素和種皮纖維素生物合成的關鍵調控基因和結構基因的SCI論文（2007、2008），申請專利1項。3） 針對甘藍型油菜中與種皮發(fā)育和色素合成相關基因的序列特征，利用RNAi技術研究植物種皮色素合成基因的表達，分析黃色種皮形成的遺傳機理，克隆種子發(fā)育過程尤其是種皮發(fā)育過程中調

7、控種皮色素生物合成與沉積的重要調控基因，研究它們與重要結構基因啟動子的關鍵順式元件的作用機理，提出12篇有關基因功能與作用機理的SCI論文（2008、2009），申請專利1項。2控制油菜種子大小的基因網絡及重要基因的功能分析4） 利用油菜種子大小突變體分析油菜種子大?。Ｖ兀┑倪z傳控制，分析粒重與含油量、籽粒產量的關系及其與環(huán)境的互作。5） 用華中農業(yè)大學TN（DH系群體）和LW（F2群體）群體定位與種子大小相關的主效基因和QTL，分析千粒重與含油量和蛋白含量的關系。構建千粒重主效QTL的近等基因系，創(chuàng)建單個粒重基因的精細定位群體及目標基因區(qū)段的物理圖譜，利用BAC文庫、cDNA文庫分離和克隆

8、LW群體的大粒等位基因。提出1篇油菜種子大小QTL分析的SCI論文（2008）6） 利用擬南芥種子大小研究的分子生物信息學，用候選基因法克隆油菜的同源片段，將這些候選基因整合到已有的遺傳連鎖圖，確定它們與已定位的種子大小相關的分子標記的關系；通過基因失活或超量表達分析，明確克隆的油菜候選基因對種子大小形成的影響，結合上述種子大小相關的主效基因和QTL定位結果，選擇3-4個效應明顯的基因作為酵母雙雜交（Y2H）分析的誘餌基因；構建供Y2H篩選的cDNA文庫，通過酵母雙雜交分析鑒定與誘餌基因蛋白互作的其他蛋白，建立與種籽大小有關的蛋白質及相應基因的互作網絡。7） 根據種子大小基因網絡分析結果和LW

9、大粒等位基因的鑒定，重點對2-3個在油菜種子大小起重要作用的基因進行功能分析。提出2篇控制油菜種子大小基因調控的SCI論文（2009）。3、影響油菜結實重要基因的鑒定和功能分析1) 利用多年多點種植的作圖群體分析不同生態(tài)條件下油菜結實性狀表現，定位影響種子后期成熟的有關的主效基因和QTL；提出1篇油菜結實性狀控制的SCI論文（2008）。2) 用擬南芥cDNA 和油菜種子特異EST芯片, 建立不同發(fā)育階段油菜種子的基因表達譜，綜合運用擬南芥有關種子發(fā)育研究的生物信息學結果，鑒定與油菜種子發(fā)育相關的基因，用RNAi和過量表達分析，對其中3-5個重要基因的功能進行深入分析。提出1篇與油菜種子發(fā)育基

10、因調控有關的SCI論文。3) 在控制條件下，模擬長江流域油菜種子發(fā)育后期熱害環(huán)境，分析正常溫度和熱害條件下油菜種子發(fā)育和油分積累相關基因的差異表達,克隆3-5個結實相關基因并分析其功能。提出12篇與結實相關基因功能與作用機理的SCI論文（2010）四、年度計劃年度研究內容預期目標第一年1 利用西南大學的黃籽×黑籽兩個組合的重組自交系群體（SW1,SW2）兩年3點的數據， 對粒色、種皮色素、皮殼率、木質素、含油量、籽粒大小等性狀有關的主效基因和QTL定位研究；2 利用華中農大的DH系群體（HZ1）和F2群體（HZ2）進行粒色定位，構建兩個粒色主效QTL的近等基因系；3 克隆種皮發(fā)育，木

11、質素和種皮纖維素生物合成的關鍵調控基因和結構基因；4 田間種植種子大小定位F2群體（LW）和DH群體（TN），利用SSR、AFLP等分子標記構建分子標記連鎖圖，對千粒重及其他相關性狀進行QTL定位；5 利用擬南芥生物信息學，克隆與種籽大小控制的相關基因；6 多點種植供種子結實性狀分析的群體。1.利用SW1、SW2建立含600個以上標記的遺傳連鎖圖譜；利用HZ1構建 含400個以上的遺傳連鎖圖譜；2.定位與粒色形成有關的QTL；3克隆與粒色、種皮色素、皮殼率、木質素、含油量、籽粒大小等種子發(fā)育相關的候選基因10個以上；4.在LW群體構建至少包含250個DNA分子標記的遺傳連鎖圖；5定位控制千粒重

12、、含油量和蛋白質含量的QTL，分析這些QTL之間的相互關系。第二年1 繼續(xù)對粒色、種皮色素、皮殼率、木質素、含油量、籽粒大小等性狀有關的主效基因和QTL的精細定位分析；2 繼續(xù)粒色主效QTL近等基因系的構建工作； 3 通過正義和反義載體構建和遺傳轉化，分析已克隆種皮發(fā)育，木質素和種皮纖維素生物合成基因的功能和影響種皮纖維素積累的分子機理；4 利用全基因組分子標記信息，從LW F2群體中選擇遺傳組成最相似、但在目標基因區(qū)段分別帶有大粒和小粒等位基因的單株構建粒重近等基因系；5 將已克隆的與控制種子大小有關的基因定位在分子標記連鎖圖上，分析與所定位QTL之間的關系；6 用已克隆的與粒重相關的油菜基

13、因構建抑制和超量表達載體，用以轉化擬南芥和油菜以分析其功能；7 構建酵母雙雜交（Y2H）文庫；8 繼續(xù)種子結實性狀分析作圖群體的多年多點種植及分析；9 高含油量材料在控制條件下進行高溫處理，獲得溫度對含油量和結實率影響的初步數據。1獲得對粒色、種皮色素等有關性狀遺傳控制的初步了解；2提出種皮發(fā)育，木質素和種皮纖維素生物合成相關基因功能分析的SCI論文1篇；3. 申請專利1項；4. 獲得23個主效粒重的近等基因系單株；5. 獲得與千粒重QTL相吻合的擬南芥候選基因及油菜中的同源基因；6. 獲得一批轉種子發(fā)育相關基因的轉基因油菜單株；7. 結實有關性狀的QTL初步定位。第三年1、 通過3年的分析，

14、明確已克隆的種皮發(fā)育、木質素和種皮纖維素生物合成基因的功能和影響種皮纖維素積累的分子機理；2、 利用RNAi技術研究植物種皮色素合成基因的表達，分析黃色種皮形成的遺傳機理；3、 利用來自HZ2的粒色近等基因系進行黃籽的精細定位；4、 利用來自LW的主效粒重基因近等基因系配制雜交組合，以構建粒重近等基因系作圖大群體；5、 分別對大粒和小粒親本的擬南芥候選基因進行比較測序，尋找突變位點；對不同來源的大粒和小粒品種進行比較測序；6、 克隆粒重候選片段的全長基因，分析其在各組織器官中的表達，構建轉化載體，并開始遺傳轉化；7、 通過對與粒重相關的油菜候選基因的功能分析，確定3-4個用作Y2H互作篩選的誘

15、餌基因；8、 利用擬南芥cDNA 和油菜種子特異EST芯片，對油菜種子主要發(fā)育階段進行基因表達譜分析；9、 利用多年多點種植的群體進行結實性狀的QTL定位；10. 對不同溫度處理下油菜材料進行基因差異表達分析。1提出對種皮纖維素積累、皮色素合成等有關基因功能分析的SCI論文1篇；2申請專利1項；3. 提出1篇油菜種子大小QTL分析的SCI論文；4. 獲得粒重候選基因全序列，得到不同來源的大粒和小粒品種之間差異，確定導致粒重改變的突變；5. 獲得油菜種子主要發(fā)育階段基因表達譜數據；6.鑒定出與結實有關性狀的QTL。第四年1. 用與來之HZ2粒色基因緊密連鎖的特異片段篩選BAC文庫，對侯選的陽性克

16、隆進行PCR分析、測序，構建粒色基因區(qū)段的物理圖譜；2. 利用LW粒重近等基因系作圖大群體，用BSA法篩選與粒重基因緊密連鎖的分子標記；構建目標基因區(qū)段的物理圖譜，開展目標基因區(qū)段的基因組測序；3.構建大粒等位基因載體，并轉化驗證功能；4. Y2H篩選，建立于種子大小有關的基因互作網路；5.定位影響油菜結實率的主效基因和QTL；6.通過基因表達差異分析，克隆影響油菜種子后期發(fā)育及結實率的相關基因；利用RNAi和超表達分析，闡明其功能。7. 用轉基因方法，將鑒定出與粒重、種子發(fā)育有關的重要基因聚合到同一品系，研究這些基因的協(xié)同作用對種子發(fā)育、含油量及種子產量的影響。1.完成粒色基因的精細定位，將

17、目的基因縮小至約100kb的DNA片段上；2. 提出有關粒色基因精細定位的SCI論文1篇3.完成粒重基因的精細定位，將目的基因縮小至100kb的DNA片段上。4. 完成粒重基因100kb的基因組測序，確定候選基因。5. 完成種子發(fā)育基因表達譜的數據分析，提出有關SCI論文1篇6. 克隆影響油菜種子后期發(fā)育及結實率的相關基因3-5個，提出有關結實率和籽粒大小基因功能及調控機理的SCI論文1篇。第五年1. 對HZ2群體粒色候選片段進行克隆和功能分析；2. 完成LW群體粒重等位基因克隆和功能分析，包括對不同的大粒和小粒品種進行比較測序，對大粒和小粒親本發(fā)育種子進行切片觀察，確定大粒和小粒親本細胞數目

18、和細胞大小的區(qū)別，對上述切片進行RNA原位雜交，確定粒重基因在發(fā)育種子中的表達部位；3.對Y2H鑒定出的控制粒重有關的關鍵基因進行功能分析；4.對通過熱處理基因差異表達分析鑒定出的結實相關基因作進一步的功能分析；5. 繼續(xù)對控制粒重、種子發(fā)育等重要基因的聚合品系進行分析。1.明確油菜黃籽形成的分子機理；2.確定不同的大粒和小粒品種之間控制粒重的機制是否相同，闡明大粒形成的分子機理；3.建立控制種子大小及種子發(fā)育的基因網絡，闡明其中3-5個重要基因的功能；4. 提出SCI論文1-2篇；5. 提出通過調控種子發(fā)育相關性狀提高含油量及籽粒產量的分子操作途徑。 五、科學數據匯交計劃課題組內各參加單位每月的30日將有關數據通過網絡送交華中農大。這些數據包括：含油量及與含油量相關農藝性狀值數據、分子標記、遺傳圖譜和QTL數據、cDNA和基因組序列相關數據、近等基因系數據等，Brassica中各個物種比較基因組和蛋白質組數據。華中農大在每月的15日前將數據整理后提交到項目組建立的油菜基因組油脂數據庫網站（Genome of Brassica oil crop on fat acid: ）。該網站是項目組開展協(xié)作、數據搜集、數據分類、生物信息學分析