高級生物化學_蛋白質的研究方法

1、整理課件1 蛋白質的研究方法蛋白質的研究方法 整理課件2主要內容v蛋白質對象的選擇和樣品的獲取蛋白質對象的選擇和樣品的獲取v蛋白質的檢測和鑒定蛋白質的檢測和鑒定v蛋白質的結構分析蛋白質的結構分析v蛋白質生物功能檢測蛋白質生物功能檢測 整理課件3 蛋白質對象的選擇和樣品的蛋白質對象的選擇和樣品的獲取獲取整理課件4 一、研究對象的選擇一、研究對象的選擇無論何種來源的生物材料一般都含有成千上萬種不同無論何種來源的生物材料一般都含有成千上萬種不同的蛋白質分子；的蛋白質分子；在一種生物組織中，同時存在著多種蛋白質組分。雖在一種生物組織中，同時存在著多種蛋白質組分。雖然它們都具有肽鏈結構，但在然它們都具有

2、肽鏈結構，但在分子大小分子大小、極性極性以以及及電荷電荷上會有所差異。上會有所差異。 整理課件5 選擇研究蛋白的原則選擇研究蛋白的原則： 在組織中含量比較高在組織中含量比較高 相對比較穩(wěn)定的蛋白質（如血液中的相對比較穩(wěn)定的蛋白質（如血液中的HbHb；肌肉中的；肌肉中的 肌球蛋白和肌動蛋白等）肌球蛋白和肌動蛋白等）從模式生物基因組測序結果來看，每一種生物有機體從模式生物基因組測序結果來看，每一種生物有機體內都還有大量的蛋白質（內都還有大量的蛋白質（5050左右）從來沒有被研究左右）從來沒有被研究過。過。整理課件6獲取蛋白樣品的方法獲取蛋白樣品的方法： u直接從生物組織中提純蛋白直接從生物組織中提

3、純蛋白為主為主u根據(jù)基因組測序獲得的信息根據(jù)基因組測序獲得的信息 整理課件7應用各種分辨效果好的應用各種分辨效果好的化學化學及及物理化學物理化學方法方法整理課件8直接從生物組織中提純蛋白直接從生物組織中提純蛋白蛋白質的分離純化包括以下過程：蛋白質的分離純化包括以下過程：1.破碎生物組織，并用適當?shù)木彌_液將蛋白質抽提出來；破碎生物組織，并用適當?shù)木彌_液將蛋白質抽提出來； 2.將有關的蛋白質分級沉淀下來將有關的蛋白質分級沉淀下來; （鹽析法或有機溶劑法）（鹽析法或有機溶劑法）3.應用應用層析法層析法或或電泳法電泳法使它們各自分開使它們各自分開； 4.蛋白質結晶；蛋白質結晶；5.蛋白質純度鑒定和含量

4、測定。蛋白質純度鑒定和含量測定。整理課件9u根據(jù)基因組測序獲得的信息根據(jù)基因組測序獲得的信息 （1 1）可以獲得所要研究的特定蛋白質的）可以獲得所要研究的特定蛋白質的AAAA序列。序列。 先根據(jù)推出的先根據(jù)推出的AA序列合成對象蛋白序列合成對象蛋白中的一段肽，用它中的一段肽，用它去獲去獲 得有關的得有關的抗體抗體，然后用抗體去探測蛋白質的存在，然后用抗體去探測蛋白質的存在，甚至可以用抗體通過親和層析純化對象蛋白甚至可以用抗體通過親和層析純化對象蛋白整理課件10（2 2）去獲得有關）去獲得有關基因的基因的cDNAcDNA全序列全序列，然后，然后通過重組通過重組DNADNA技術去表達重組蛋白。技術

5、去表達重組蛋白。 有偏差，甚至完全是假象。有偏差，甚至完全是假象。 即使推測得到的蛋白質編碼信息是對的，在細胞即使推測得到的蛋白質編碼信息是對的，在細胞內還存在轉錄后的內還存在轉錄后的RNA加工，翻譯后的蛋白質的加工，翻譯后的蛋白質的修飾和加工等基因序列上目前還無法反映的信息。修飾和加工等基因序列上目前還無法反映的信息。整理課件11制備過程中注意事項：制備過程中注意事項： 要求自始至終保持在要求自始至終保持在天然狀態(tài)天然狀態(tài) 避免一切過激因素避免一切過激因素-如過酸或過堿，高溫，如過酸或過堿，高溫， 重金屬等的影響。重金屬等的影響。2. 2. 通常都在低溫條件下操作。通常都在低溫條件下操作。3

6、. 3. 盡可能使樣品中蛋白質的濃度維持在較高盡可能使樣品中蛋白質的濃度維持在較高 水平。水平。整理課件12二、細胞的破碎二、細胞的破碎 少數(shù)蛋白質少數(shù)蛋白質-存在于細胞外面（如血液和體液中）存在于細胞外面（如血液和體液中） 大多數(shù)蛋白質大多數(shù)蛋白質-都存在于細胞的里面。都存在于細胞的里面。 一般固形生物材料首先都必須加以破碎，以釋放出細一般固形生物材料首先都必須加以破碎，以釋放出細胞內的蛋白質組分。胞內的蛋白質組分。 生物材料生物材料 必須新鮮必須新鮮要求：要求： 1. 1. 材料材料 -80-80 2. 2. 或者制成干粉或者制成干粉 3. 3. 低溫存放低溫存放 破碎的方法：破碎的方法：

7、 機械破碎法機械破碎法： 利用機械力的攪切作用，使細胞研碎利用機械力的攪切作用，使細胞研碎高速攪切器、玻璃勻漿器、家用攪肉器、研缽、高速攪切器、玻璃勻漿器、家用攪肉器、研缽、玻璃珠高速勻漿器以及靜壓器（高壓破碎）玻璃珠高速勻漿器以及靜壓器（高壓破碎）。2.2.滲透破碎法滲透破碎法： 利用低滲條件，使細胞溶脹破碎。利用低滲條件，使細胞溶脹破碎。 紅血球放于水中，便發(fā)生自溶紅血球放于水中，便發(fā)生自溶。整理課件143.3.交替凍融法交替凍融法： 生物組織經凍結后，細胞內液結冰膨脹生物組織經凍結后，細胞內液結冰膨脹而使細胞脹破。而使細胞脹破。 4.4.超聲波法超聲波法： 利用超聲波震蕩，使細胞膜上所受

8、張力不均而利用超聲波震蕩，使細胞膜上所受張力不均而解體。解體。 5.5.酶消化法酶消化法： 利用蛋白酶、溶菌酶、蝸牛復合酶等對利用蛋白酶、溶菌酶、蝸牛復合酶等對細胞膜或細胞壁的分解作用，使它們解體細胞膜或細胞壁的分解作用，使它們解體整理課件15按其所在按其所在位置位置大體可分為：大體可分為：兩種類型外周蛋白兩種類型外周蛋白（通過次級鍵和外膜脂質的通過次級鍵和外膜脂質的極性頭螯合在一起）極性頭螯合在一起） 固有蛋白固有蛋白外周蛋白外周蛋白-選擇適當離子強度及選擇適當離子強度及pHpH的含有的含有EDTAEDTA的的 緩沖液抽提（高鹽溶液）緩沖液抽提（高鹽溶液）固有蛋白固有蛋白-嵌合在膜雙層中，它

9、通過嵌合在膜雙層中，它通過疏水作用疏水作用與與 膜內部脂質層膜內部脂質層的疏水性尾部相結合，的疏水性尾部相結合， 具有具有螺旋結構螺旋結構。三、去污劑處理溶解膜蛋白三、去污劑處理溶解膜蛋白膜蛋白的處理：復雜膜蛋白的處理：復雜 細胞膜的結構細胞膜的結構整理課件17 膜固有蛋白的提取與細胞質蛋白，核蛋白提膜固有蛋白的提取與細胞質蛋白，核蛋白提取不同之處在于它是嵌在膜中的，水溶性不取不同之處在于它是嵌在膜中的，水溶性不好，好，基本方法就是用不同的離心速度去掉胞基本方法就是用不同的離心速度去掉胞質蛋白等，最后用去污劑把蛋白從膜中釋放質蛋白等，最后用去污劑把蛋白從膜中釋放出來。出來。 去污劑去污劑：一類

10、具有一類具有 親水性頭部親水性頭部 疏性尾巴疏性尾巴 的雙親性（的雙親性（amphipathicamphipathic）脂類分子）脂類分子作用：作用： 既可以破壞細胞的既可以破壞細胞的磷脂雙層結構磷脂雙層結構，又可以與具有，又可以與具有疏水性表面的疏水性表面的膜蛋白結合膜蛋白結合，從而阻止釋放出來的膜蛋，從而阻止釋放出來的膜蛋白通過疏水相互作用形成大的、可沉淀的聚集體。白通過疏水相互作用形成大的、可沉淀的聚集體。 整理課件19有的有的去污劑的親水性頭部可離子化去污劑的親水性頭部可離子化（即含有一帶電（即含有一帶電基團）基團） 如如： 脫氧膽酸鈉（脫氧膽酸鈉（sodium deoxycholat

11、esodium deoxycholate） 十二烷基硫酸鈉十二烷基硫酸鈉（sodium dodecylsulfatesodium dodecylsulfate，SDSSDS）有的有的去去污劑不能解離，所以分子中缺少帶電基團污劑不能解離，所以分子中缺少帶電基團， 如：如： Triton X-100Triton X-100， 辛基葡萄糖苷辛基葡萄糖苷( octylglucoside( octylglucoside）整理課件20臨界微團濃度臨界微團濃度（critical micelle concentration，CMC)： 每一種去污劑都具有一特征性的每一種去污劑都具有一特征性的CMC。 CMCC

12、MC值與其分子中值與其分子中疏水部分疏水部分與與親水部分親水部分的的結構結構有有 關。關。 當當 去污劑去污劑 低于此值的時候，去污劑分子在水溶液低于此值的時候，去污劑分子在水溶液中將不形成微團，達到此值的時候，微團開始形成。中將不形成微團，達到此值的時候，微團開始形成。 整理課件21 離子化去污劑（離子化去污劑（SDSSDS）：其其“疏水尾巴疏水尾巴”破壞蛋白質分子的疏水性部分的破壞蛋白質分子的疏水性部分的結構，其帶電的結構，其帶電的“頭部頭部”破壞蛋白質分子中的氫破壞蛋白質分子中的氫鍵和離子鍵。鍵和離子鍵。作用的結果是作用的結果是： 使任何蛋白（不管是膜蛋白還是水溶性蛋白）使任何蛋白（不管

13、是膜蛋白還是水溶性蛋白）都都，并，并溶液中，同時溶液中，同時。在部分情況下，當去污劑被透析掉后，蛋白質可在部分情況下，當去污劑被透析掉后，蛋白質可以復性并恢復生物活性。以復性并恢復生物活性。 整理課件22SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide SDS-polyacrylamide gel electrophoresisgel electrophoresis，SDS-PAGESDS-PAGE）：）：就是利用就是利用SDSSDS的這種結合在整個蛋白分子上，并的這種結合在整個蛋白分子上，并使蛋白完全變性的特性。使蛋白完全變性的特性。這樣經過這樣經

14、過SDSSDS變性的蛋白質在電場中完全變性的蛋白質在電場中完全按大小按大小分離開。分離開。 整理課件23非離子去污劑非離子去污劑：相對溫和，一般相對溫和，一般不會使蛋白質變性不會使蛋白質變性。只是將蛋白質。只是將蛋白質分子從膜上溶解下來而已。分子從膜上溶解下來而已。當當 去污劑去污劑 其其CMCCMC值的時候，去污劑分子與膜蛋值的時候，去污劑分子與膜蛋白表面的疏水區(qū)域結合，使蛋白質在水溶液中溶解白表面的疏水區(qū)域結合，使蛋白質在水溶液中溶解而不聚集。而不聚集。當當 去污劑去污劑 其其CMCCMC值的時候，去污劑分子將與膜值的時候，去污劑分子將與膜磷脂一起形成混合微團，膜蛋白以整合在微團中的磷脂一

15、起形成混合微團，膜蛋白以整合在微團中的形式存在。形式存在。一般選擇非離子去污劑一般選擇非離子去污劑來來保持膜蛋白生物活性保持膜蛋白生物活性 整理課件25 四、蛋白分子的穩(wěn)定四、蛋白分子的穩(wěn)定防止蛋白質分子可能被同時釋放的蛋白質水解酶降防止蛋白質分子可能被同時釋放的蛋白質水解酶降解、解、Pr空間結構可能被溫度或化學試劑等環(huán)境因素空間結構可能被溫度或化學試劑等環(huán)境因素破壞而喪失生物學活性等。破壞而喪失生物學活性等。處理處理：需要在緩沖液中加入蛋白酶抑制劑；：需要在緩沖液中加入蛋白酶抑制劑； 在低溫下操作；在低溫下操作； 加入穩(wěn)定劑加入穩(wěn)定劑(如甘油等）如甘油等）整理課件26五、細胞碎片的去除五、細

16、胞碎片的去除離心離心( centrifugation)( centrifugation) 原理：懸浮在溶液中的兩個或多個不同質量或密度原理：懸浮在溶液中的兩個或多個不同質量或密度的顆粒（如細胞、細胞器、大分子復合體、或分子的顆粒（如細胞、細胞器、大分子復合體、或分子等）沉降到試管的底部的速度是不一樣的，質等）沉降到試管的底部的速度是不一樣的，質量越大、或密度越高沉降的速度越快。量越大、或密度越高沉降的速度越快。沉淀：固體性的細胞碎片和細胞器沉降到離心管的沉淀：固體性的細胞碎片和細胞器沉降到離心管的底部形成；底部形成；上清：絕大多數(shù)蛋白分子或蛋白復合體保留在細胞上清：絕大多數(shù)蛋白分子或蛋白復合體

17、保留在細胞抽提液中即上清中抽提液中即上清中 整理課件27 六、目標蛋白質的分離、純化六、目標蛋白質的分離、純化 -蛋白質的分級沉淀和層析分離蛋白質的分級沉淀和層析分離將不同蛋白質分開的性質主要包括：將不同蛋白質分開的性質主要包括： 分子量的大小分子量的大小 帶電情況帶電情況 水溶性水溶性 與某種物質的特異高親和力等與某種物質的特異高親和力等 整理課件28蛋白質的膠體性質： 蛋白質顆粒表面多為親水基團，可吸引水分子，使蛋白質顆粒表面多為親水基團，可吸引水分子，使顆粒表面成有一層水膜顆粒表面成有一層水膜，蛋白質顆粒相互隔開，不，蛋白質顆粒相互隔開，不會聚集成大顆粒而沉淀。會聚集成大顆粒而沉淀。 此

18、外，蛋白質表面可帶有電荷，可起膠粒穩(wěn)定的此外，蛋白質表面可帶有電荷，可起膠粒穩(wěn)定的作用。作用。 若去除蛋白質膠體表面電荷和水化膜兩個穩(wěn)定若去除蛋白質膠體表面電荷和水化膜兩個穩(wěn)定因素因素 ，蛋白質極易從溶液中析出，蛋白質極易從溶液中析出 整理課件29#整理課件30 （一）蛋白質的分級沉淀（一）蛋白質的分級沉淀 常用的方法有：常用的方法有：u 鹽析法鹽析法u 有機溶劑法有機溶劑法整理課件31 鹽析法鹽析法 概念：將概念：將中性鹽加入蛋白質溶液，破壞水化膜和電中性鹽加入蛋白質溶液，破壞水化膜和電荷而使蛋白質沉淀，叫鹽析。各種蛋白質鹽析所需的荷而使蛋白質沉淀，叫鹽析。各種蛋白質鹽析所需的鹽濃度及鹽濃度

19、及pH不同，加入不同濃度的中性鹽可不同，加入不同濃度的中性鹽可使各種蛋使各種蛋白質依次分別沉淀出來。白質依次分別沉淀出來。 優(yōu)點：操作簡便優(yōu)點：操作簡便 對易變性的蛋白質有一定的保護作用，對易變性的蛋白質有一定的保護作用， 適用范圍十分廣泛。適用范圍十分廣泛。 缺點：分辨能力差缺點：分辨能力差整理課件32 1. 1.基本原理基本原理在蛋白質水溶液中添加無機鹽，可以產生兩種在蛋白質水溶液中添加無機鹽，可以產生兩種影響：影響： (1)(1)鹽離子鹽離子與與PrPr分子分子中的中的 極性基團極性基團 離子基團離子基團 作用作用 降低降低PrPr分子的活度系數(shù)，趨使其溶解度分子的活度系數(shù)，趨使其溶解度

20、 。(2)(2)鹽離子鹽離子也與也與水水這種偶極分子作用，使水分子的活這種偶極分子作用，使水分子的活 度降低，導致度降低，導致PrPr水合程度的減少，從而趨使水合程度的減少，從而趨使PrPr溶溶 解度解度 。整理課件33 * *鹽溶（鹽溶（salting in)salting in)-當溶液中的鹽離子強度比較當溶液中的鹽離子強度比較低的時候，蛋白質的溶解度會隨著鹽濃度的增加而低的時候，蛋白質的溶解度會隨著鹽濃度的增加而增加，這種現(xiàn)象叫做增加，這種現(xiàn)象叫做.* *鹽析（鹽析（salting out )-salting out )-但當溶液中的鹽離子強度但當溶液中的鹽離子強度比較高的時候，蛋白質的

21、溶解度會隨著鹽濃度的增比較高的時候，蛋白質的溶解度會隨著鹽濃度的增加而降低，這種現(xiàn)象叫做加而降低，這種現(xiàn)象叫做 . .一定的鹽濃度下，每一種蛋白都有一不同的特異溶一定的鹽濃度下，每一種蛋白都有一不同的特異溶解度。解度。 整理課件34 影響鹽析作用的因素影響鹽析作用的因素（1 1）鹽的種類）鹽的種類（2 2）pHpH和溫度和溫度# #（3 3）蛋白質濃度）蛋白質濃度% %整理課件35（1 1）鹽的種類）鹽的種類對同一種對同一種PrPr而言，而言，價數(shù)愈高價數(shù)愈高的鹽離子，鹽析能力的鹽離子，鹽析能力也愈強也愈強: : PO3-4SO42-C2O42-（CHOHCOO-）2 ACCLNO3-Br -

22、I- K+Rb+Na+Cs+Li+NH4+ 負離子價數(shù)較高的中性鹽負離子價數(shù)較高的中性鹽（如硫酸鹽、磷酸鹽等）（如硫酸鹽、磷酸鹽等）的的KsKs值常較一價中性鹽的值常較一價中性鹽的KsKs值高。值高。 Ks:鹽析常數(shù)（價數(shù)較高時，鹽析常數(shù)（價數(shù)較高時，Ks 值也較大）。代表鹽析的效值也較大）。代表鹽析的效率，率， 是與是與Pr及鹽種類有關的特性常數(shù)。及鹽種類有關的特性常數(shù)。整理課件36硫酸銨硫酸銨（常用鹽析劑）（常用鹽析劑） 優(yōu)點：鹽析能力較強優(yōu)點：鹽析能力較強 具有較高的溶解度具有較高的溶解度 價格低廉價格低廉 不產生副作用。不產生副作用。 缺點：緩沖能力較差缺點：緩沖能力較差 pHpH難控

23、制難控制整理課件37（2 2）pHpH和溫度和溫度S S。代表蛋白質在無機鹽溶液中的溶解度。代表蛋白質在無機鹽溶液中的溶解度 除取決于除取決于PrPr的種類，還受的種類，還受pHpH及溫度影響及溫度影響: : pH=pI pH=pI時，時，S S。的數(shù)值極小。的數(shù)值極小 S S。隨溫度增加而減低。隨溫度增加而減低。鹽析過程中，若增高溫度，有助于鹽析過程中，若增高溫度，有助于PrPr的析出。的析出。# #整理課件38（3 3）蛋白質濃度）蛋白質濃度 PrPr較高較高，在較低無機鹽濃度時，在較低無機鹽濃度時, ,蛋白質便開蛋白質便開 始析出，鹽析界限比較寬。始析出，鹽析界限比較寬。 PrPr較低較

24、低，需要無機鹽的濃度也高，即鹽析，需要無機鹽的濃度也高，即鹽析 界限變窄。界限變窄。 整理課件39 蛋白質濃度愈高，所需鹽的飽和度極限愈低。蛋白質濃度愈高，所需鹽的飽和度極限愈低。 但蛋白質濃度愈高時，其他蛋白質的共沉淀作用但蛋白質濃度愈高時，其他蛋白質的共沉淀作用 也愈強也愈強 所以當?shù)鞍踪|溶液太濃時，應適當稀釋，所以當?shù)鞍踪|溶液太濃時，應適當稀釋， 通常在通常在之間比較合適。之間比較合適。整理課件401.1.基本原理基本原理（1）在）在pI附近，附近，Pr主要以中性離子形式存在。此時若添加主要以中性離子形式存在。此時若添加 有機溶劑，由于有機溶劑，由于有機溶劑有機溶劑可使溶液可使溶液電離電

25、離常數(shù)常數(shù)減小，增強了減小，增強了 中性離子間靜電引力，從而使分集合而沉淀出來。中性離子間靜電引力，從而使分集合而沉淀出來。（2）有機溶劑有機溶劑本身的水合作用會破壞本身的水合作用會破壞Pr表面的水合層，也表面的水合層，也 促使促使Pr變得不穩(wěn)定而聚集析出變得不穩(wěn)定而聚集析出.常用的有機溶劑：乙醇和丙酮常用的有機溶劑：乙醇和丙酮 有機溶劑法有機溶劑法 分辨力比鹽析方法高，提純效果好分辨力比鹽析方法高，提純效果好 整理課件41 2. 2. 影響有機溶劑沉淀影響有機溶劑沉淀PrPr的因素的因素 （1 1） pHpH值值 pH=pIpH=pI時時 蛋白質的溶解度最低。按蛋白質的溶解度最低。按pIpI

26、來調節(jié)來調節(jié)pHpH值，值， 有利于分離。有利于分離。 （2 2）蛋白質濃度）蛋白質濃度 PrPr越高，加入一定量有機溶劑后，越高，加入一定量有機溶劑后，PrPr析出越多。析出越多。 此時溶液的此時溶液的介電常數(shù)介電常數(shù)也相應提高，可以減少也相應提高，可以減少PrPr的變性。的變性。 PrPr越高越高,Pr,Pr分子間作用引起的共沉淀現(xiàn)象也顯著分子間作用引起的共沉淀現(xiàn)象也顯著 增強，這樣分離效果差，不利于分級沉淀。增強，這樣分離效果差，不利于分級沉淀。 只有選擇恰當?shù)闹挥羞x擇恰當?shù)腜rPr才有可能獲得良好的分離效果才有可能獲得良好的分離效果。整理課件42（3 3）離子強度）離子強度 中性鹽的加

27、入能促使中性鹽的加入能促使PrPr在有機溶劑中溶解，在有機溶劑中溶解， 并且能防止并且能防止PrPr的變性。但含鹽過多，卻會使的變性。但含鹽過多，卻會使PrPr 過度析出，不利于分級沉淀。過度析出，不利于分級沉淀。 一般一般的稀鹽溶液。的稀鹽溶液。（4 4）多價陽離子）多價陽離子 PrPr與多價的陽離子如（與多價的陽離子如（ ZnZn2+2+、 CuCu2+2+等）能結等）能結 合成復合物。這種復合物在有機溶劑中往往使合成復合物。這種復合物在有機溶劑中往往使PrPr 溶解度變小。溶解度變小。 整理課件43v常溫下有機溶劑可使蛋白質變性，常溫下有機溶劑可使蛋白質變性，低溫條件低溫條件下可減慢變性

28、速下可減慢變性速度。因此用有機溶劑沉淀蛋白質時應在低溫條件下進行。度。因此用有機溶劑沉淀蛋白質時應在低溫條件下進行。v如利用丙酮沉淀蛋白質時，必須在如利用丙酮沉淀蛋白質時，必須在0 044低溫下進行，丙酮低溫下進行，丙酮用量用量- -般般1010倍于蛋白質溶液體積。蛋白質被丙酮沉淀后，應倍于蛋白質溶液體積。蛋白質被丙酮沉淀后，應立即分離，否則蛋白質會變性。立即分離，否則蛋白質會變性。v缺點：缺點： 易使酶和具有活性的蛋白質變性。故操作時要求條件比鹽析易使酶和具有活性的蛋白質變性。故操作時要求條件比鹽析嚴格。對于某些敏感的酶和蛋白質，使用有機溶劑沉淀尤其嚴格。對于某些敏感的酶和蛋白質，使用有機溶

29、劑沉淀尤其要小心。要小心。 整理課件44 ( (二）二）蛋白質的層析分離法蛋白質的層析分離法 （色譜法）（色譜法） 原理原理層析法是利用不同物質理化性質的差異而建立起層析法是利用不同物質理化性質的差異而建立起來的技術。所有的層析系統(tǒng)都由兩個相組成：一是固定相，另來的技術。所有的層析系統(tǒng)都由兩個相組成：一是固定相，另一是流動相。當待分離的混合物隨流動相通過固定相時，由于一是流動相。當待分離的混合物隨流動相通過固定相時，由于各組分的理化性質存在差異，與兩相發(fā)生相互作用（吸附、溶各組分的理化性質存在差異，與兩相發(fā)生相互作用（吸附、溶解、結合等）的能力不同，在兩相中的分配（含量比）不同，解、結合等）的

30、能力不同，在兩相中的分配（含量比）不同，且隨流動相向前移動，各組分不斷地在兩相中進行再分配。分且隨流動相向前移動，各組分不斷地在兩相中進行再分配。分部收集流出液，可得到樣品中所含的各單一組分，從而達到將部收集流出液，可得到樣品中所含的各單一組分，從而達到將各組分分離的目的。各組分分離的目的。整理課件45 層析分離能力的實質層析分離能力的實質物質的分配問題物質的分配問題 *分配系數(shù)：分配系數(shù)： 當一種溶質分布在兩個互不相溶的溶劑中時，它在當一種溶質分布在兩個互不相溶的溶劑中時，它在固定相和移動相兩相內的固定相和移動相兩相內的濃度之比濃度之比是一個常數(shù)，這稱是一個常數(shù)，這稱為分配系數(shù)。為分配系數(shù)。

31、 Cs Cm *質量分配系數(shù)：質量分配系數(shù)：若不用濃度而用若不用濃度而用物質的絕對量的比值物質的絕對量的比值來表示，則稱為來表示，則稱為質量分配系數(shù)即：質量分配系數(shù)即： Vs Vm Vs : 固定相的體積固定相的體積 Vm : 流動相的體積流動相的體積K =D= K*整理課件46 種類：種類： 氣相層析氣相層析 按按兩相狀態(tài)兩相狀態(tài)來分來分 液相層析液相層析 吸附層析吸附層析 分配層析分配層析 按按層析機理層析機理來分來分 離子交換層析離子交換層析 凝膠排阻層析凝膠排阻層析 親和層析親和層析 柱層析柱層析 按按操作方式操作方式來分來分 薄層層析薄層層析 紙層析紙層析層析法分離、純化：層析法分離

32、、純化：Pr、多肽和多肽和AA整理課件47 離子交換層析法離子交換層析法*原理：原理：陰陰（陽）離子交換樹脂顆粒（作為固定相）（陽）離子交換樹脂顆粒（作為固定相） 填充在層析柱內，由于填充在層析柱內，由于陰陰（陽）離子交換樹（陽）離子交換樹 脂顆粒上帶脂顆粒上帶正正（負）電荷，能吸引溶液中的（負）電荷，能吸引溶液中的 陰陰（陽）離子。然后再用含陰（陽）離子的（陽）離子。然后再用含陰（陽）離子的 溶液洗柱。含負電量小的蛋白質首先被洗脫溶液洗柱。含負電量小的蛋白質首先被洗脫 下來，增加陰離子濃度，含負電量多的蛋白下來，增加陰離子濃度，含負電量多的蛋白 質也被洗脫下來，于是兩種蛋白質被分開。質也被洗

33、脫下來，于是兩種蛋白質被分開。整理課件48整理課件49固定相固定相：1.1.纖維素纖維素- - 二乙基氨基乙基纖維素（二乙基氨基乙基纖維素（DEAEDEAE纖維素）、纖維素）、 羧甲基纖維素（羧甲基纖維素（CMCM纖維素）纖維素）2.2.葡聚糖葡聚糖整理課件50u纖維素纖維素 : : 骨架為柔性長鏈骨架為柔性長鏈1.1. 加入量加入量 ： 加入層析柱的蛋白質量通常為纖維素量的加入層析柱的蛋白質量通常為纖維素量的 十分之一。十分之一。2.2. 提高分辨率，樣品體積應盡可能地少。提高分辨率，樣品體積應盡可能地少。3.3. 在洗脫時，可以通過在洗脫時，可以通過改變洗脫緩沖液的改變洗脫緩沖液的pHpH

34、， 而使蛋白質分子電荷減少而被解吸下來，也而使蛋白質分子電荷減少而被解吸下來，也 可以通過可以通過提高洗脫緩沖液中離子強度提高洗脫緩沖液中離子強度，減弱，減弱 蛋白質分子與載體親和力的辦法，將蛋白質蛋白質分子與載體親和力的辦法，將蛋白質 組分逐一洗脫下來。組分逐一洗脫下來。整理課件51u葡聚糖的離子交換樹脂葡聚糖的離子交換樹脂 : :骨架為三維網(wǎng)狀結構骨架為三維網(wǎng)狀結構 優(yōu)點優(yōu)點：1.1.同時具有分子篩的作用同時具有分子篩的作用2. 2. 因其高度的網(wǎng)狀結構，所帶有的交換基團也比纖維因其高度的網(wǎng)狀結構，所帶有的交換基團也比纖維 素多得多。交換容量為離子交換纖維素的素多得多。交換容量為離子交換纖

35、維素的3 35 5倍。倍。 缺點：缺點： 它的床體積常受它的床體積常受pHpH或鹽濃度影響而變化，對分離或鹽濃度影響而變化，對分離效果有一定程度的干擾。效果有一定程度的干擾。 整理課件52凝膠（排阻）層析凝膠（排阻）層析又稱又稱分子篩或凝膠過濾分子篩或凝膠過濾（gel filtrationgel filtration）原理：載體為有一定孔徑的多孔性親水性凝膠。原理：載體為有一定孔徑的多孔性親水性凝膠。 當分子大小不同的混合物通過這種凝膠柱時，當分子大小不同的混合物通過這種凝膠柱時， 直徑大于孔徑的分子將不能進入凝膠內部，直徑大于孔徑的分子將不能進入凝膠內部， 便直接沿膠粒間隙流出（全排出）。較

36、小的便直接沿膠粒間隙流出（全排出）。較小的 分子進入能容納它的孔穴，繞道而行，在柱分子進入能容納它的孔穴，繞道而行，在柱 內保留時間就比較長。這樣，較大的分子被先內保留時間就比較長。這樣，較大的分子被先 洗脫下來，而較小的分子后被洗脫下來，從而洗脫下來，而較小的分子后被洗脫下來，從而 達到相互分離的目的達到相互分離的目的. .整理課件53整理課件54用作凝膠的載體物質有三類用作凝膠的載體物質有三類： u 交聯(lián)葡聚糖凝膠交聯(lián)葡聚糖凝膠 商品名為商品名為 Sephadex GSephadex Gu 聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠 商品名為商品名為Bio-gel PBio-gel P ( (丙烯酰胺丙

37、烯酰胺 + N+ N，N N- -次甲基二丙烯酰胺聚合而成次甲基二丙烯酰胺聚合而成 P P值表示不同的交聯(lián)度值表示不同的交聯(lián)度) )u 瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠 商品名為商品名為 SepharoseSepharose或或 Bio-gel ABio-gel A （從海藻瓊脂中分離除去瓊脂膠后的中性級成分從海藻瓊脂中分離除去瓊脂膠后的中性級成分 是是D-D-半乳糖和半乳糖和3,6-3,6-脫水脫水-L-L-半乳糖相間重復結半乳糖相間重復結 合而成的鏈狀化合物）合而成的鏈狀化合物）整理課件55常用過濾層析凝膠的截留分子量范圍整理課件56瓊脂糖凝膠優(yōu)點：瓊脂糖凝膠優(yōu)點：1.1.其機械強度比葡聚糖凝膠和聚丙

38、烯酰胺凝其機械強度比葡聚糖凝膠和聚丙烯酰胺凝 膠好得多。膠好得多。2.2.對蛋白質等高分子的吸附作用也小得多對蛋白質等高分子的吸附作用也小得多3.3.適用分子量的范圍寬，最大可以到適用分子量的范圍寬，最大可以到10108 8。整理課件57吸附層析法吸附層析法原理：原理：柱層析中，含有柱層析中，含有Pr分子的混合物隨流動相通分子的混合物隨流動相通 過由過由吸附劑吸附劑組成的固定相時，組成的固定相時，Pr分子通過各分子通過各 種次級作用能夠吸附在吸附劑上種次級作用能夠吸附在吸附劑上,由于不同分由于不同分 子的吸附能力不同，可以通過洗脫使它們逐子的吸附能力不同，可以通過洗脫使它們逐 一解脫出來，而使

39、混合物得以分離。一解脫出來，而使混合物得以分離。優(yōu)點：優(yōu)點：1.1. 物理吸附，吸附能量比較低，洗脫也比較容易。物理吸附，吸附能量比較低，洗脫也比較容易。2.2.操作簡便，吸附劑容易獲得，價格較低廉操作簡便，吸附劑容易獲得，價格較低廉 整理課件58固定相固定相：吸附劑吸附劑磷酸鈣凝膠磷酸鈣凝膠磷酸鈣膠磷酸鈣膠CaCa3 3（POPO4 4）2 2磷酸氫鈣膠磷酸氫鈣膠CaHPOCaHPO4 42H2H2 2O O羥基磷酸鈣膠羥基磷酸鈣膠CaCa5 5（POPO4 4）3 3OH OH 羥基磷灰石羥基磷灰石 磷酸鈣膠對蛋白質的吸附作用原理磷酸鈣膠對蛋白質的吸附作用原理: :主要是由于主要是由于 .

40、 Ca. Ca2+2+與與PrPr負電荷性基團負電荷性基團 結合。結合。 . . 磷酸基團與磷酸基團與PrPr正電荷基團正電荷基團整理課件59 流動相流動相： 洗脫劑洗脫劑-檸檬酸鹽檸檬酸鹽作用：檸檬酸離子因與作用：檸檬酸離子因與CaCa2+2+有更強的相互作用，有更強的相互作用， 它能大大它能大大降低降低蛋白質和凝膠的吸附能力。蛋白質和凝膠的吸附能力。 NaClNaCl，KClKCl甚至濃度高達甚至濃度高達3M3M時，也不影響時，也不影響PrPr負電荷負電荷的吸附，相反這些鹽可以大大降低的吸附，相反這些鹽可以大大降低PrPr正電荷正電荷的吸附。因的吸附。因此在高濃度的這些鹽溶液中應用羥基磷灰

41、石進行層析時，此在高濃度的這些鹽溶液中應用羥基磷灰石進行層析時，可以專門吸附酸性蛋白質及中性蛋白質而排除堿性蛋白可以專門吸附酸性蛋白質及中性蛋白質而排除堿性蛋白質。質。整理課件60親和層析法親和層析法1.1.原理原理：利用生物高分子具有能和某些相對應的專一：利用生物高分子具有能和某些相對應的專一 分子可逆結合的特性。分子可逆結合的特性。 如，如，酶的活性部位能和底物酶的活性部位能和底物 抑制劑抑制劑 輔助因子專輔助因子專 一性地結合一性地結合, ,改變條件又能使這種結合解除改變條件又能使這種結合解除. . 酶的變構中心與變構因子（或稱效應物）之酶的變構中心與變構因子（或稱效應物）之 間、抗體與

42、抗原之間、激素與受體之間，結間、抗體與抗原之間、激素與受體之間，結 合蛋白與結合物之間合蛋白與結合物之間 。 這些被作用的對象物質稱之為這些被作用的對象物質稱之為配基（配基（ligand) ligand) 。 整理課件61固定相固定相-配基配基固定在固定在固相載體固相載體上上整理課件62整理課件632.2.優(yōu)點優(yōu)點：具有高度的吸附專一性：具有高度的吸附專一性 層析過程簡便、快速層析過程簡便、快速3.3.載體的選擇載體的選擇：(1)(1)必須具有高度親水性，使必須具有高度親水性，使PrPr分子容易與它接近分子容易與它接近. .(2)(2)非專一性吸附要十分小。非專一性吸附要十分小。(3)(3)必

43、須具有大量可供活化而能與配基結合的基團。必須具有大量可供活化而能與配基結合的基團。 常用載體常用載體：纖維素、纖維素、 葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠、 聚丙烯酸胺凝膠和多孔玻璃聚丙烯酸胺凝膠和多孔玻璃等等。 整理課件64高效液相層析法（高效液相層析法（High Performance Liquid Chromatography ，HPLCHPLC）又稱又稱“高壓液相色譜高壓液相色譜，是，是色譜法色譜法的一個重要分支，以的一個重要分支，以液體液體為為流動相流動相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性極性的單一的單一溶溶劑劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等

44、流動相泵入裝有固或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的定相的色譜柱色譜柱，在柱內各成分被分離后，進入檢測器進，在柱內各成分被分離后，進入檢測器進行檢測，從而實現(xiàn)對試樣的分析。行檢測，從而實現(xiàn)對試樣的分析。 整理課件65HPLC包括： 輸液系統(tǒng)：輸液系統(tǒng)：驅動流動相和樣品通過色譜分離驅動流動相和樣品通過色譜分離柱和檢測系統(tǒng)柱和檢測系統(tǒng) 層析柱：層析柱：分離樣品中的各個物質分離樣品中的各個物質 進樣器：進樣器：將待分析樣品引入色譜系統(tǒng)將待分析樣品引入色譜系統(tǒng) 檢測系統(tǒng)：檢測系統(tǒng)：將被分析組在柱流出液中濃度的將被分析組在柱流出液中濃度的變化轉化為光學或電學信號變化轉化為光學或電學信號

45、，并分析顯示出來整理課件66整理課件67 蛋白質的檢測和鑒定蛋白質的檢測和鑒定整理課件68 一般可通過以下幾個方面進行：一般可通過以下幾個方面進行： 光譜學特性光譜學特性 電泳行為電泳行為 特異抗體反應特異抗體反應 特異生物學活性特異生物學活性 N N一末端氨基酸序列測定一末端氨基酸序列測定 質譜檢測質譜檢測 排阻層析排阻層析 整理課件69 一、光譜學特性一、光譜學特性 光譜特性的總原則是光譜特性的總原則是： 當一定波長的光（即電磁波）與當一定波長的光（即電磁波）與PrPr分子接觸時，分子接觸時，所吸收的或反射的輻射能量與所吸收的或反射的輻射能量與PrPr分子結構特征和濃分子結構特征和濃度是密

46、切相關的。度是密切相關的。 整理課件70 不同波長范圍的電磁波與其作用后的剩余能量值反不同波長范圍的電磁波與其作用后的剩余能量值反映的是蛋白質分子的不同特征映的是蛋白質分子的不同特征: :190 -200nm190 -200nm波長范圍的光吸收反映的是波長范圍的光吸收反映的是蛋白質主鏈蛋白質主鏈上的酰胺鍵中電子的被激發(fā)；上的酰胺鍵中電子的被激發(fā)；230 - 300nm230 - 300nm波長范圍的光吸收譜（最大吸收值在波長范圍的光吸收譜（最大吸收值在280nm280nm波長處）反映的是波長處）反映的是蛋白質分子中芳香族氨基酸蛋白質分子中芳香族氨基酸側鏈上電子的被激發(fā)。側鏈上電子的被激發(fā)。所以

47、一般情況下，溶液在所以一般情況下，溶液在280nm280nm波長處（屬紫外波長處（屬紫外光范圍）的光吸收能力被當做是光范圍）的光吸收能力被當做是存在存在蛋白質的證據(jù)。蛋白質的證據(jù)。整理課件71二、電泳檢測二、電泳檢測 蛋白質分子為兩性電解質，在不同蛋白質分子為兩性電解質，在不同pHpH的溶液中的溶液中帶有不同的電荷，從而在直流電場中能夠泳動，這帶有不同的電荷，從而在直流電場中能夠泳動，這就是就是電泳現(xiàn)象電泳現(xiàn)象。按按介質狀態(tài)介質狀態(tài)來分來分: :自由電泳自由電泳 區(qū)帶電泳區(qū)帶電泳按按操作原理操作原理可分為可分為: : 一般電泳一般電泳 等電電泳等電電泳 等電聚焦電泳等電聚焦電泳 免疫電泳等免疫

48、電泳等 整理課件72自由電泳自由電泳-以以溶液溶液為介質，在溶液中將蛋白質分離為介質，在溶液中將蛋白質分離 缺點缺點: :自由電泳過程中擴散嚴重，分辨率有限自由電泳過程中擴散嚴重，分辨率有限區(qū)帶電泳區(qū)帶電泳-在固體支持物上所進行的電泳在固體支持物上所進行的電泳 固體支持物有固體支持物有: :濾紙、濾紙、 醋酸纖維薄膜、醋酸纖維薄膜、 瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠 聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠 優(yōu)點優(yōu)點: :分辨率很高。分辨率很高。整理課件73SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 SDSSDS ( (十二烷基硫酸鈉十二烷基硫酸鈉) )是陰離子型是陰離子型去污劑去污劑(Sodium dod

49、ecyl sulfate, SDS)(Sodium dodecyl sulfate, SDS)SDSSDS一凝膠電泳可以按一凝膠電泳可以按蛋白質分子大小的蛋白質分子大小的不同不同將其分開。將其分開。 這時，若以分子量的對數(shù)（這時，若以分子量的對數(shù)（logMlogM）對相對）對相對于染料前沿于染料前沿的遷移率（的遷移率（RfRf）作圖，呈現(xiàn)線性關系。）作圖，呈現(xiàn)線性關系。 ab整理課件74整理課件75 這種關系，對一種膠濃度時，只適用于一定的這種關系，對一種膠濃度時，只適用于一定的分子量范圍：分子量范圍： 5 5膠濃度時，適用于分子量膠濃度時，適用于分子量6 6200200萬的區(qū)間；萬的區(qū)間；

50、1010膠濃度時，適用于分子量膠濃度時，適用于分子量7 7萬的區(qū)間；萬的區(qū)間； 1515膠濃度時，適用于分子量萬的區(qū)間。膠濃度時，適用于分子量萬的區(qū)間。 等電聚焦電泳等電聚焦電泳（isoelectric focusing, IEF） 是一種根據(jù)樣品的等電點不同而使它們在是一種根據(jù)樣品的等電點不同而使它們在pH梯度梯度中相中相互分離的一種電泳技術。互分離的一種電泳技術。 利用特殊的一種緩沖液（兩性電解質）在凝膠（常用利用特殊的一種緩沖液（兩性電解質）在凝膠（常用聚丙烯酰胺凝膠）內制造一個聚丙烯酰胺凝膠）內制造一個pHpH梯度。梯度。 pH梯度制作利用的兩性電解質（ampholyte，商品名為am

51、pholine），是脂肪族多胺和多羧類的同系物，他們具有相近但不同的pKa和pI值。在外電場作用下，自然形成pH梯度。凝膠可用：聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠等整理課件77PrPr分子有一定的分子有一定的pIpI，它處在一個由，它處在一個由陽極到陰極陽極到陰極梯度逐漸增加的介質中，并通過以直流電時，梯度逐漸增加的介質中，并通過以直流電時，它便它便“聚焦聚焦”在與其在與其pIpI相同的相同的pHpH位置上。位置上。pIpI不同的蛋白質泳動后形成位置不同的區(qū)帶而不同的蛋白質泳動后形成位置不同的區(qū)帶而得到分離。得到分離。整理課件78優(yōu)點：優(yōu)點：1.1.有很高的分辨率；有很高的分辨率；2.2.

52、可以區(qū)分等電點只有可以區(qū)分等電點只有 0.01 pH0.01 pH單位差異的蛋白質；單位差異的蛋白質；3.3.根據(jù)其所在位置還能夠測定蛋白質的分子量；根據(jù)其所在位置還能夠測定蛋白質的分子量；4.4.對很稀的樣品，最后達到高度的濃縮。對很稀的樣品，最后達到高度的濃縮。整理課件79雙向電泳雙向電泳（two-dimensional gel electrophoresis） 第一向采用聚丙烯酸胺凝膠等電聚焦電泳第一向采用聚丙烯酸胺凝膠等電聚焦電泳-pIpI第二向采用第二向采用SDSSDS一一PAGEPAGE電泳電泳 -分子量分子量 由于結合了蛋白質的等電點和分子量兩種完全不由于結合了蛋白質的等電點和分

53、子量兩種完全不同的特一性來進行分離，因此具有非常高的分辨率同的特一性來進行分離，因此具有非常高的分辨率可同時分析成千上萬個蛋白，分辨率高，分離度好?？赏瑫r分析成千上萬個蛋白，分辨率高，分離度好。是蛋白質組學研究的核心技術。是蛋白質組學研究的核心技術。整理課件80雙向PAGE整理課件81 雙向電泳技術缺點，具有以下特征的蛋白質在二維雙向電泳技術缺點，具有以下特征的蛋白質在二維電泳中還很難被檢測到：電泳中還很難被檢測到：等電點（等電點（pI)pI)值很大或很小的，比如大于值很大或很小的，比如大于8 8和小于和小于4 4的那些蛋白質；的那些蛋白質；分子質量很大的蛋白質，比如大于分子質量很大的蛋白質，

54、比如大于l00kDal00kDa的蛋白的蛋白質就比實際的少了，而大于質就比實際的少了，而大于150kDa150kDa的蛋白質就幾的蛋白質就幾乎完全探測不到了（盡管在一維電泳凝膠上這些乎完全探測不到了（盡管在一維電泳凝膠上這些大蛋白質都能清楚地被觀察到；大蛋白質都能清楚地被觀察到；疏水性蛋白質。疏水性蛋白質。 免疫電泳免疫電泳 將將電泳分離電泳分離和和專一性免疫沉淀專一性免疫沉淀相結合的分析方法：相結合的分析方法： 免疫電泳法是指利用凝膠電泳與雙向免疫擴散兩種技術結免疫電泳法是指利用凝膠電泳與雙向免疫擴散兩種技術結合的實驗方法。在電場作用下標本中各組分因電泳遷移率不同而合的實驗方法。在電場作用下

55、標本中各組分因電泳遷移率不同而分成區(qū)帶，然后沿電泳平行方向將凝膠挖一溝槽，將抗體加入溝分成區(qū)帶，然后沿電泳平行方向將凝膠挖一溝槽，將抗體加入溝槽內，使抗原與抗體相互擴散而形成沉淀線。根據(jù)沉淀線的數(shù)量、槽內，使抗原與抗體相互擴散而形成沉淀線。根據(jù)沉淀線的數(shù)量、位置及形狀，以分析標本中所含組分的性質。位置及形狀，以分析標本中所含組分的性質。由于免疫反應有由于免疫反應有很高的專一性，很高的專一性，可用于可用于鑒定鑒定PrPr的的純度，分析樣品純度，分析樣品中蛋白質的組分中蛋白質的組分。本實驗常用于抗原分析及免疫性疾病的診斷。本實驗常用于抗原分析及免疫性疾病的診斷。整理課件83整理課件84三、測定純化

56、蛋白質的分子大小三、測定純化蛋白質的分子大小 測定蛋白處于非變性條件下的大小一般可通過：測定蛋白處于非變性條件下的大小一般可通過：u凝膠層析凝膠層析u沉降平衡超速離心沉降平衡超速離心（sedimentation equlibrium ultracentrifugation) u動態(tài)光散射（動態(tài)光散射（dynamic light scattering)dynamic light scattering)u孔徑梯度聚丙烯酰胺凝膠電泳孔徑梯度聚丙烯酰胺凝膠電泳（pore gradient polyacrylamide gel electrophoresis）u 整理課件85凝膠層析 1.凝膠是一類多孔

57、性高分子聚合物凝膠是一類多孔性高分子聚合物,每個顆粒猶如一個篩子每個顆粒猶如一個篩子.當樣品溶液通過凝膠柱時當樣品溶液通過凝膠柱時,相對分子質量較大的物質由于直相對分子質量較大的物質由于直徑大于凝膠網(wǎng)孔而只能沿著凝膠顆粒間的孔隙徑大于凝膠網(wǎng)孔而只能沿著凝膠顆粒間的孔隙,隨著溶劑流隨著溶劑流動動,因此流程較短因此流程較短,向前移動速度快而首先流出層析柱向前移動速度快而首先流出層析柱; 2. 反之反之,相對分子質量較小的物質由于直徑小于凝膠網(wǎng)孔相對分子質量較小的物質由于直徑小于凝膠網(wǎng)孔,可可自由地進出凝膠顆粒的網(wǎng)孔自由地進出凝膠顆粒的網(wǎng)孔,在向下移動過程中在向下移動過程中,它們從凝膠它們從凝膠內擴

58、散到膠?？紫逗笤龠M入另一凝膠顆粒內擴散到膠?？紫逗笤龠M入另一凝膠顆粒,如此不斷地進入如此不斷地進入與逸出與逸出,使流量增長使流量增長,移動速率慢而最后流出層析柱移動速率慢而最后流出層析柱.整理課件863. 而中等大小的分子而中等大小的分子,它們也能在凝膠顆粒內外分布它們也能在凝膠顆粒內外分布,部分進入顆粒部分進入顆粒,從而在大分子物質與小分子物質之間從而在大分子物質與小分子物質之間被洗脫被洗脫.這樣這樣,經過層析柱經過層析柱,使混合物中的各物質按其使混合物中的各物質按其分子大小不同而被分離分子大小不同而被分離 。 VeblogMw C其中其中b,C為常數(shù)。即為常數(shù)。即Ve為洗脫體積，與為洗脫體

59、積，與logMw也成線也成線性關系。我們可以通過在一凝膠柱上分離多種已知性關系。我們可以通過在一凝膠柱上分離多種已知分子量的蛋白質后，并根據(jù)上述的線性關系繪出標分子量的蛋白質后，并根據(jù)上述的線性關系繪出標準曲線，然后用同一凝膠柱測出其它未知蛋白的分準曲線，然后用同一凝膠柱測出其它未知蛋白的分子量。子量。整理課件87沉降平衡超速離心沉降平衡超速離心（sedimentation equlibrium ultracentrifugation) 用該技術測定蛋白質分子質量的時候，測定的用該技術測定蛋白質分子質量的時候，測定的是幾個絕對動力學參數(shù)。是幾個絕對動力學參數(shù)。原理：原理：當當PrPr樣品在相對

60、較低的離心速度（但還是處樣品在相對較低的離心速度（但還是處于超速范圍）下離心時，在一個從離心管頂部指向于超速范圍）下離心時，在一個從離心管頂部指向底部的、越往底部越大的沉降力作用下，底部的、越往底部越大的沉降力作用下，PrPr分子很分子很快形成一個從離心管頂部往下逐漸增加的連續(xù)快形成一個從離心管頂部往下逐漸增加的連續(xù)r r濃濃度梯度；與此同時，將有一個方向與離心力相反的度梯度；與此同時，將有一個方向與離心力相反的擴散力作用于擴散力作用于PrPr上；當沉降離心進行一定時間之后，上；當沉降離心進行一定時間之后，作用于作用于PrPr上的離心力和擴散力上的離心力和擴散力（前者與蛋白在離心（前者與蛋白在