肺炎球菌1型莢膜多糖多克隆抗體制備與夾心ELISA法建立及其在多糖濃度測(cè)定中的應(yīng)用.docx

1、論著*肺炎球菌1型莢膜多糖多克隆抗體制備與夾心ELISA法建立及其在多糖濃度測(cè)定中的應(yīng)用劉威，廖紅梅，謝謙，黃放，鄒莎莎，馬誠(chéng)，江山，崔長(zhǎng)法(成都生物制品研究所有限責(zé)任公詞細(xì)函性疫苗研究室，四川成都610023)摘要：目的利用肺炎球菌1型全菌體制備多克隆抗體，并旦利用該抗體建立肺炎1型英膜多糖夾心解聯(lián)免疫吸附分析法(Enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA),用于檢測(cè)發(fā)酵和純化過(guò)程中的多糖濃度。方法用滅活的1型肺炎鏈球菌免疫家兔6周，獲得高滴度的抗多糖血清，經(jīng)過(guò)親和層析純化，獲得高純度的兔抗肺炎1型多械抗體IgG。以純化IgC作為包被抗體，加入多犧樣品,再以生

2、物素化的抗體作為檢測(cè)抗體，建立夾心ELISA法檢測(cè)肺炎1型多糖濃度。確定標(biāo)準(zhǔn)曲線的最佳線性范圍，并對(duì)該方法進(jìn)行特異性、準(zhǔn)確性和精密度驗(yàn)證。結(jié)果兔免疫血清經(jīng)過(guò)雙向免疫擴(kuò)散檢測(cè)抗體滴度可達(dá)1：32；該方法的線性檢測(cè)范圍為1.5650n”mL；最低檢測(cè)限為3.13n"mL。在標(biāo)準(zhǔn)品中混入其他型別多糖或培養(yǎng)基，回收率分別為102%和108%;該方法批內(nèi)精密度和批間精密度分別為6.08%和7.01%。結(jié)論建立的夾心ELTSA方法，其特異性、準(zhǔn)確性和精密度均良好，可以特異地檢測(cè)肺炎球菌1型多糖濃度。關(guān)鍵詞:肺炎球菌1型多糖;免疫學(xué)檢測(cè)法;夾心EUSA；多糖濃度中圖分類(lèi)號(hào)：R378.P4文獻(xiàn)標(biāo)志碼

3、：A文章編號(hào)：1005-5673(2013)05-0001-05Preparationofpolyclonalantibodiesagainstpneumococcalserotype1capsularpolysaccharideanddevelopmentasandwichELISAindeterminationofconcentrationfbrtype1capsularpolysaccharideUUWei,LIAOHong-mei,XIEQian,HUANGFang,ZOUSha-sha,MACheng,JIANGShan,CUIChang-fa(DepartmentofBacteri

4、alVaccineResearchandDevelopment,ChengduInstituteofBiologicalProducts,Co.,Lid,Chengdu610023,China)Abstract:ObjectiveTopreparepolyclonalantibodiesagainstcapsularpolysaccharideofpneumococcalserotype1,andusetheantibodiestodevelopasandwichELISAindeterminationofconcenlralionforpneumococcalcapsularpolysacc

5、harideofserotypeIintheprocessoffermentationandpurification.MethodsHightiterserumofanti-capsularpolysaccharideserotype1wasobtainedafterimmunizingrabbitsbyusingofinactivatedstreptococcuspneumoniaecellsofserotype1fbr6weeks.IgGwaspurifiedthroughaffinitychromatographyandusedasacoatingantibody.Polysacchar

6、idesamples,alonewithinhousepolysaccharidestandard,werethenaddedfollowedbyusingbiotinylatedantibodyasasignalantibody.Theoptimalinearrangeofthestandardcurve,specificity,accuracyandprecisionofthedevelopedmethodwerevalidatedaccordingly.ResultsTheantibodytiterofrabbitimmuneserumreachedto1：32,thestandardP

7、SIlineardetectionrangewas1.56ng/mLto50ng/mL,detectionlimitwas3.13ng/mL.Standardpolysaccharidewasmixedwithpolysaccharidesfromdifferentsenrtypesorculturemediabeforeasssay,therecoveryratiowas102%and108%respectively.Intra-as-sayprecisionandinterprecisionofthemethodwere6.08%and7.01%.ConclusionHightiterra

8、bbitanti-serumagainsttype1capsularpolysaccharideofstreptococcalpneumoniaewasprepared.ThedevelopedsandwichELISAmethodshowedhighspecificity,goodaccuracyandprecision.Thismethodcanbeusedinspecificdetectionofconcentrationforpneumococcalpolysaccharideserotype1.Keywords:Pneumococcalpolysaccharideserotype1;

9、Immunoassay;Sandwichenzyme-linkedimmunosorbentassay(S-EL1SA);Polysaccharideconcentration收稿日期：20I3-06-25;修回日期：2013-07-14作者簡(jiǎn)介:劉威(1978-)，男，碩上,主要從事細(xì)菌性疫苗的研發(fā)工作。肺炎鏈球菌是引起肺炎、腦膜炎、中耳炎的主要病原體。美國(guó)有觀察資料顯示，估計(jì)每年有40-50萬(wàn)人罹患肺炎球菌性肺炎，病死率為5%10%o盡管使用有效的抗生素治療，肺炎球菌感染仍可引起很高的發(fā)病率和病死率。接種肺炎莢膜多糖疫苗能夠有效降低肺炎鏈球菌感染的發(fā)病率和病死率。制備肺炎莢膜多糖疫苗過(guò)程，

10、尤其是發(fā)酵和純化過(guò)程中，進(jìn)行多糖濃度監(jiān)測(cè)，對(duì)優(yōu)化發(fā)酵和純化工藝、提高多糖產(chǎn)率非常必要。通常，檢測(cè)肺炎莢膜多糖的方法為依賴硫酸降解的化學(xué)顯色法，但是該類(lèi)方法主要用于純化后的多糖產(chǎn)品，不適合于雜質(zhì)較多、濃度不高的多糖中間樣品。為了提高檢測(cè)的特異性和靈敏度,前人開(kāi)發(fā)出免疫學(xué)方法,如速率散射比濁法和火箭免疫電泳法，但這些方法存在特殊設(shè)備要求、重復(fù)性不佳或血清需求量過(guò)大等限制因素。本研究通過(guò)全菌體免疫家兔，對(duì)血清進(jìn)行純化和生物素標(biāo)記，獲得高純度抗肺炎球菌1型莢膜多糖（Pneumococcalcaspularpolysaccharideserotype1,PnPSl）多克隆抗體,建立夾心酶聯(lián)免疫吸附法（E

11、nzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA），經(jīng)過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證后，對(duì)發(fā)酵的肺炎球萌1型多糖濃度進(jìn)行檢測(cè)，證明該方法的實(shí)用性。1材料與方法1.1菌種肺炎鏈球菌1型菌種由成都生物制品研究所有限責(zé)任公司（以下簡(jiǎn)稱成都公司）提供，利用血清學(xué)方法鑒別血清型別是否正確。1.2試驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)新西蘭大耳白兔，雌性，體重2.5kg,由成都公司動(dòng)物室提供。1.3主要試劑PnPsl內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品由成都公司提供，批號(hào)CE20111031,見(jiàn)表1;A蛋白4FF親和層析填料購(gòu)自AppliedBiosystems公司；生物素化標(biāo)記試劑盒和HRP標(biāo)記親和素購(gòu)自Therm。公司；TMB購(gòu)官KPL公司；

12、氟氏完全佐劑購(gòu)自Sigma公司；標(biāo)準(zhǔn)肺炎球菌分型診斷血清購(gòu)自丹麥血清研究所，批號(hào)G113b。表1肺炎球菌1型多糖標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)控結(jié)果Tab.IQualitycontrolresultforstandardPSIinhouse批號(hào)蛋白（%）核酸（%）相對(duì)分子質(zhì)量（kD）糖醛酸（%）氧乙?；?）總磷（）總氮（）CE201110310.720.810.0352.005.200.273.201.4菌液制備肺炎1型鏈球菌接種于液體肉湯培養(yǎng)基（由成都公司提供），以10%C02于36丁經(jīng)二級(jí)發(fā)酵共培養(yǎng)46h,用丹麥血清做凝集試驗(yàn)確定細(xì)萌血清型別為肺炎球菌1型;取少量菌液染色鏡檢，確定細(xì)菌生長(zhǎng)狀態(tài)良好，莢膜完整

13、；用麥?zhǔn)媳葷岱ù_定細(xì)菌濃度。利用100T水浴滅活細(xì)菌30min,2000g離心5min,生理鹽水洗滌菌體后，立即免疫動(dòng)物。1.5動(dòng)物免疫及血清抗體滴度檢測(cè)初次免疫菌濃度為2x108個(gè)/mL,混合等體積福氏完全佐劑，多點(diǎn)注射于家兔皮下。此后，每周由耳緣靜脈注射滅活全菌體1次，每次2X109個(gè)萌,共免疫5次。用雙向免疫擴(kuò)散確定抗體滴度至1：32o立即頸動(dòng)脈采血，分離血清，保存于-20ro1.6多克隆抗體的純化與標(biāo)記PBS平衡兔血清至pH7.0,用A蛋白親和柱吸附抗肺炎球菌1型多糖抗體，用pH3.。檸檬酸洗脫抗體，經(jīng)12%還原SDS-PAGE和高效液相色譜（HPLC）分析鑒定純度。純化的抗體按照生物

14、素化試劑盒說(shuō)明，進(jìn)行生物素標(biāo)記。1.7夾心ELISA方法的優(yōu)化將肺炎球菌1型多糖抗體和標(biāo)記抗體系列稀釋，采用方陣滴定法確定二者的最佳工作濃度。建立步驟如下:在96孔酶標(biāo)板中用pH9.6碳酸緩沖液包被1如分別為0.05白g/mL、0.15瞄/mL、0.45jig/mLJOOpX/孔,28T過(guò)夜孵育。次日洗板,加入含3%BSA的封閉液,200jit/孔，室溫封閉1h；洗板3次，分別加入30ng/mL標(biāo)準(zhǔn)肺炎球菌1型多糖作為陽(yáng)性對(duì)照或PBS作為陰性對(duì)照，室溫孵育1h；洗板，加入1：3000至1:100000系列稀釋生物素標(biāo)記抗體JOOjiiy孔，孵育1h；加入HRP標(biāo)記親和素，反應(yīng)1h；洗板后,TM

15、B顯色,0.5mol/LH2SO4終止顯色反應(yīng)，酶標(biāo)儀讀取4切值。根據(jù)信/噪比最大原則，判斷最適合的包被濃度和檢測(cè)抗體濃度。注：PS：PnPSI；孔1：丹麥1型旬清”1/4；孔2、孔3、孔4、孔6：口制免血清，分別稀襟1/4.1/8.1/16,1/32；孔5：陰性對(duì)照?qǐng)D1雙向免疫擴(kuò)散測(cè)定肺炎球菌I型兔免疫血清抗體效價(jià)Fig.IDeterminationoftherabbitantilxxlylitersagainstpneumoniatypeIbydoubleimmunodifTusion140000100()005000()-44HMNI35(XM)25(MM)注：l8為系列稀擇的純化后肝樣

16、品；M蛋白分子ht標(biāo)準(zhǔn)(260000.1400(X).100000,70000,50000,40000.35000.25000)圖2還原SDS-PAGE檢測(cè)IgG分子量及純度Fig.2ReducedSDS-PAGEprofileofpurifiedrabbitanli-PnPSIsrnim注：PS：PnPSI；孔l：丹麥I羽旬清稀釋1/4；孔2,孔3、孔4、孔6：自制兔血清.分別稀釋1/4J/8J/16J/32；孔5：陰性對(duì)照?qǐng)D3純化的兔抗肺炎球菌1型多糖IgG抗體的HPLC圖譜Fig.3Th<*IIPIXIpnifilrMrabbitIgGantibodyagainstpnetim&l

17、t;K-(K-(-alpolysaccharidesertrtypeI1.8標(biāo)準(zhǔn)曲線的確立根據(jù)上述優(yōu)化條件，將肺炎球菌I型多糖(PnPsI)標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至1.56100.00ng/mL,選擇相關(guān)系數(shù)大于0.98,4詢?cè)?.10-2.00標(biāo)準(zhǔn)多糖稀釋區(qū)間為最佳線性范圍。1.9方法驗(yàn)證1.9.1特異性將PnPsl標(biāo)準(zhǔn)械溶于混有12種其他肺炎球菌血清型多糖(3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、I8C、19F、19A、23F,每塑終質(zhì)量濃度50.00ng/ml.)的溶液中,用建立的夾心ELISA法檢測(cè)其中I型多糖濃度，il算回收率。將標(biāo)準(zhǔn)多糖按照6.25ng/mLJ2.50ng/mL、25.00n

18、g/mL溶解于肉湯培養(yǎng)基中，計(jì)算其回收率。1.9.2準(zhǔn)確性和精密度用該方法檢測(cè)商(50.00ng/mL)、中(12.50ng/mL)、低(3.13ng/mL)3個(gè)濃度的PnPsl標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)濃度幣:復(fù)測(cè)定5次,連續(xù)檢測(cè)3d,計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)多糖回收率和批內(nèi)及批間變異系數(shù)。1.10方法應(yīng)用肺炎球菌I型萌種接種于20mL肺炎球苗培養(yǎng)基,10%CO?培養(yǎng)箱中36Y振蕩培養(yǎng)4ho每30min取樣1次，測(cè)定.4頌吸光度，并旦利用建立的夾心ELISA方法測(cè)定多糖濃度。2結(jié)果2.1兔免疫血清的抗體效價(jià)與IgG純度經(jīng)過(guò)6周連續(xù)免疫，采集全血，分離血清.通過(guò)雙向免疫擴(kuò)散法測(cè)定血清效價(jià)，丹麥血清所標(biāo)準(zhǔn)血清效價(jià)為1：4,&

19、gt;成都公司制備的兔免疫血清的抗體效價(jià)為1：32；兩者與內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)PnPsl形成一致的沉淀線，見(jiàn)圖I。利用蛋仃A親和層析純化血清，獲得高純度的抗肺炎多糖1型IgG,經(jīng)12%還原SDS-PAGE進(jìn)行分析.可見(jiàn)相對(duì)分子質(zhì)貴分別約為55000的重鏈和23000的輕鏈，見(jiàn)圖2O利用HPLC檢測(cè)純度大于90%,見(jiàn)圖3。2.2最佳工作條件及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立最佳工作條件及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立.見(jiàn)參考文獻(xiàn)8,經(jīng)方陣滴定法稀釋包被抗體與生物素化檢測(cè)抗體，結(jié)果顯示當(dāng)包被抗體為0.15jig/mL,生物索化抗體在1:30(XM)(約70.00ng/mL)時(shí)信號(hào)與背景:依比例最大，見(jiàn)表2c在此條件下，肺炎球留I型多慵在1.5

20、65().(X)ng/mL,線性相關(guān)系數(shù)尸為0.98以上，見(jiàn)圖4根據(jù)背景吸光度3倍換算并通過(guò)驗(yàn)證,該方法最低檢測(cè)限為3.13ng/mLo表2方陣滴定法確定ELISA最適反應(yīng)條件Tab.2DeterminationofoptimalconditionforELISAwithacheckboardmethd生物素化抗體稀釋倍數(shù)包被抗體質(zhì)量濃度(瞄/ml.)抗原(30n"mL)0.050.150.451：30002.3422.3252.362PS11:10(XX)1.8031.9242.013PS11：300001.2821.6431.732PS11：1000000.5820.6320.9

21、32PS11：30000.2550.2850.362PBS1：100000.1340.1420.145PBS1：300000.0640.0680.129PBS1：1000000.0610.0910.125PBS圖4夾心ELISA法測(cè)定PSI濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4ThestandardcurveofthesandwichELISAtodeterminePSIconcentration2.3方法驗(yàn)證2.3.1特異性驗(yàn)證在50.00ng/mL肺炎球菌1型標(biāo)準(zhǔn)多糖溶液中混入3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、I9A、I9F、23F共12種其他血清型肺炎球菌多糖(每型終質(zhì)最濃度50.00n

22、g/mL),測(cè)定肺炎球菌1型標(biāo)準(zhǔn)多糖質(zhì)量濃度為51.26ng/mL,回收率為102%。將50.00ng/mL標(biāo)準(zhǔn)多糖溶解于肺炎肉湯培養(yǎng)基中，計(jì)算其回收率為108%,見(jiàn)表3。2.3.2準(zhǔn)確性驗(yàn)證和精密度驗(yàn)證利用該夾心EUSA法檢測(cè)高(50.00ng/mL)、中(12.50ng/mL)、低(3.13ng/mL)3個(gè)濃度的PnPsl標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定5次，其回收率為96%108%,見(jiàn)表4,批內(nèi)變異系數(shù)小于6.08%；連續(xù)3d檢測(cè)上述標(biāo)準(zhǔn)品，批間變異系數(shù)小于7.01%,見(jiàn)表5。表3肉湯培養(yǎng)基中肺炎1型多糖濃度Tab.3TherecoveryratioofPSIconcentrationmixed

23、withbrothmedia加入多耕質(zhì)量濃度(ng/mL)檢測(cè)結(jié)果(ng/mL)均值(ng/mL)回收率(%)49.2047.2050.0056.5050.4010848.知50.90表4標(biāo)準(zhǔn)多糖檢測(cè)回收率Tab.4TherecoveryratioforstandardPSIPS1標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)墾均值回收率濃度(ng/mL)(ng/mL)(%)50.0050.43±1.5210112.5012.06±0.67963.133.37±0.06108表5夾心ELISA法測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)PnPSl精密度驗(yàn)證結(jié)果Tab.5ValidationresultforprecisionofPSI

24、bysandwichELISAPSI標(biāo)準(zhǔn)品批內(nèi)精密度(n=5)批間精密度質(zhì)瓦:濃度均值CV%均值(ng/mL)CV%(ng/mL)(ng/mL)50.0050.381.8850.552.8612.5011.066.0811.427.013.133.371.773.335.622.4方法應(yīng)用將肺炎1型菌種接種于20mL肺炎球菌培養(yǎng)基中，10%C0236T振蕩培養(yǎng)4h,期間每30min取樣1次，測(cè)定4頌吸光度，以此判斷細(xì)菌生長(zhǎng)濃度變化趨勢(shì)。同時(shí)利用建立的該夾心ELISA方法測(cè)定PS1濃度，結(jié)果顯示，隨肺炎鏈球菌濃度的增高，多糖質(zhì)旱濃度增高至2.90瞄/mL,見(jiàn)圖5。3討論肺炎鏈球菌英膜多糖濃度檢測(cè)

25、通常使用硫酸慈酮法、硫酸咔喋法等化學(xué)方法,該類(lèi)方法的檢測(cè)靈敏度為微克級(jí)，并11該類(lèi)方法對(duì)樣品純度要求較高。為了能夠靈敏且特異的檢測(cè)出發(fā)酵過(guò)程中多糖濃度圖5肺炎1型鏈球菌生長(zhǎng)過(guò)程中多糖質(zhì)量濃度變化趨勢(shì)Fig.5Thechangetrendoftype1polysaccharidemassconcentrationintheprocessofthegrowthofserotype1streptococcuspneumonia的變化趨勢(shì).為生產(chǎn)工藝的優(yōu)化和穩(wěn)定提供數(shù)據(jù)，研究開(kāi)發(fā)出夾心ELISA法,與其他夾心ELISA的不同之處在僅需要制備一種動(dòng)物來(lái)源的抗體,從而免去了制備兩種以上動(dòng)物來(lái)源抗體的繁瑣。

26、成都公司細(xì)菌性疫苗研究室前期利用全性體免疫家免，所得免疫血清經(jīng)雙向免疫擴(kuò)散檢測(cè)抗體滴度很低改用新鮮培養(yǎng)的細(xì)慎，用沸水火活后，能最大限度保證細(xì)I宥莢膜的完整性*。用全菌體混合福氏完全佐劑，進(jìn)行家兔初次免疫，再用全侑體進(jìn)行靜脈加強(qiáng)免疫.能明顯提高抗體滴度,雙向免疫擴(kuò)散檢測(cè)達(dá)1:320研究將扶得的高滴度兔血清通過(guò)親和層析進(jìn)行純化，拱得了高濃度的抗肺炎多糖IgG抗體。包被該抗體.能有效降低EI.1SA檢測(cè)中的非特異性吸附。生物素勺親和素間的結(jié)合具有極高的親和力，其反應(yīng)呈高度專一性研究利用生物素對(duì)多糖抗體進(jìn)行標(biāo)記,當(dāng)這種抗體特異識(shí)別多糖,并形成抗原抗體發(fā)合物后，生物索再與標(biāo)記辣根過(guò)氧化物的的親和索特異結(jié)

27、合。這個(gè)信號(hào)是多級(jí)放大的過(guò)程，非常適合檢測(cè)培養(yǎng)基中低濃度的多糖含bt,研究顯示最低檢測(cè)限為3.13ng/mL,完全滿足生產(chǎn)過(guò)程中對(duì)低濃度樣品檢測(cè)的需要：方法驗(yàn)i正顯示，即使混入結(jié)構(gòu)相似的其他型別肺炎多械.或倒訥湯培養(yǎng)基中多種成分的干擾，該方法也能特異準(zhǔn)確定bt肺炎球保ii型多精。另外對(duì)該方法進(jìn)行批內(nèi)和批間精密度驗(yàn)證，結(jié)果顯示所有變異系數(shù)均小于15%,證明該方法穩(wěn)定適用，可以用F對(duì)*糖生產(chǎn)過(guò)程中濃度的質(zhì)hl:控制將該方法用于實(shí)際肺炎球萌發(fā)醉過(guò)程檢測(cè)，結(jié)果顯示,隨者發(fā)酵時(shí)間延K,細(xì)前濃度逐步增A，其擇放的莢膜多糖也逐漸增多；已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道.隨著到達(dá)生長(zhǎng)平臺(tái)期,肺炎球菌釋放自溶酶的活性增強(qiáng).有更多的

28、英膜多糖被切進(jìn)入培養(yǎng)基,0：o研究發(fā)現(xiàn).發(fā)酵4h后，細(xì)萌濃度達(dá)到最高，然后逐漸下降，但.是此時(shí)多糖濃度仍繼續(xù)增高，證明r上述觀點(diǎn)。參考文獻(xiàn)HamptonLM,FarlejMMtSchuffiwrVi,Hal.Preventionofanli-Slrqfliatccusimrumimiacwilhconjugatevac-cin<*«J.JounalofInfeclDis.2012.205(3)：40I-4l1.1 MaX.YaoKII,Xie(J.Hal.(«haractenz4ili(>nMrnlhrrHnyrin-rr?*iMantSnyMorocruspf

29、ieunioniaecausinginvasivedi>ra-wminChinrM*childrenJ:.ChinMrdJ(Engl),2013.126(8):1522-1527.13AnsaldiF.IXFlorrnliis1).(umqiaP.Hal.SrnRyiwreplacenwntinStrqacocaASpnmmoniarafter(*<>njiigah*vacciiwintHMluc*tion：im(KU*t.doubtsamiprrspreliu*fornewvac<'in«*sJ.Mirn>lnolt2010.21(3)：56-(4.4L-yvaAtQuintanaAvSinchrzM,rtal.Rapi<lamix-iiMlivran-thnHir-sulfiiric'acidassayininicnqilatcformatto(|uantifycarlxJiy-<lralrinbi(>|)lianna<'riiti