腸道屏障在多器官功能不全綜合征中的發(fā)病學(xué)意義探討

1、    腸道屏障在多器官功能不全綜合征中 的發(fā)病學(xué)意義探討        目的探討腸道屏障的損傷機(jī)制和腸道屏障在多器官功能不全綜合征(MODS)中的發(fā)病學(xué)意義。方法本實(shí)驗(yàn)采用酵母多糖對大鼠行腹腔注射制備MODS模型。實(shí)驗(yàn)用SD大鼠24只，隨機(jī)分為模型組和對照組。酵母多糖劑量為1.0mg/g體重。結(jié)果MODS時(shí)外周靜脈血和門靜脈血中內(nèi)毒素水平明顯增高(P<0.01)；血和小腸組織中腫瘤壞死因子(TNF)含量升高(P<0.05)；血液中二胺氧化酶(DAO)含

2、量明顯升高(P<0.01)，腸粘膜組織中DAO含量明顯下降(P<0.01)；MODS時(shí)回腸粘膜出現(xiàn)明顯病理改變，腸粘膜通透性和腸細(xì)胞滲透性明顯增高。結(jié)論MODS時(shí)存在著嚴(yán)重的腸道屏障功能損傷，腸道屏障功能衰竭是導(dǎo)致MODS的重要環(huán)節(jié)，腸源性內(nèi)毒素是MODS 的重要致病因子，組織過氧化損傷是腸道屏障損傷的重要原因之一。保護(hù)腸道屏障，減少腸源性內(nèi)毒素的產(chǎn)生和吸收，防止過氧化損傷將成為防治MODS的重要措施。關(guān)鍵詞多器官功能衰竭腸粘膜內(nèi)毒素類 Damage of gut barrier in the pathogenesis of multiple organ dysfunction s

3、yndrome Chen Hailong,Wu Xianzhong,Pei Dekai,et al.Department of Surgery,Dalian Medical University, Dalian 116011.ObjectiveThis study was to determin the relationship between multiple organ dysfunction syndrome (MODS) and gut barrier failure and the effect of endotoxin derived from the gut.Methods24

4、SD rats were divided into two groups,model group(n=12) and control group(n=12).The experimental rats were sacrificed 48h after intraperitoneally injection of zymosan at a dosage of 1.0mg/g body weight.Results The levels of serum endotoxin in the peripheral and portal blood were markedly elevated(P&l

5、t;0. 01),the DAO concentrations decreased in the ileum tissue(P<0.05),but increased in the blood(P<0.01),the levels of XOD, MDA and TNF in the blood and ileum tissue significantly increased(P<0.01),the levels of GSH decreased(P<0,01).The histopathologic lesions were found in the intestin

6、e of the model group,including acute necrosis of intestinal mucosa,granulocyte infiltration, and increased permeability of intestinal mucosa and enterocytes.The multiple linear regression analysis showed that there were significant relationships among endotoxin,DAO,GSH, XOD, MDA and TNF.ConclusionsT

7、he results demonstrated that there was a severe gut barrier damage while MODS developed,gut barrier failure can lead to MODS.Endotoxin derived from the gut was the pathogenic factor of MODS and injury of the intestine caused by peroxidase can result in gut barrier failure and MODS.Key wordsMultiple

8、organ failureIntestinal mucosaEndotoxins目前，腸道屏障功能已引起人們極大的興趣和關(guān)注。在創(chuàng)傷和感染等應(yīng)激情況下，腸道的屏障功能受到削弱或損害，可使大量細(xì)菌、內(nèi)毒素經(jīng)門靜脈和淋巴系統(tǒng)侵入體循環(huán)，造成腸源性感染和內(nèi)毒素血癥，并在一定條件下激發(fā)細(xì)胞因子和其它炎性介質(zhì)的連鎖反應(yīng)，引起全身各器官的損害1,2。因此，研究腸道屏障的損傷機(jī)制、腸道屏障在多器官功能不全綜合征(MODS)中的發(fā)病學(xué)意義等相關(guān)問題具有極其重要的意義。本組以酵母多糖誘發(fā)無菌性腹膜炎制備大鼠MODS模型，對上述問題進(jìn)行研究和討論。材料與方法1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：SD大鼠24只，雌雄各半，體重200

9、±20g，由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，隨機(jī)分成模型組和對照組，每組12只。2.模型制備方法：無菌Zymosan粉劑(Sigma公司產(chǎn)品)與無菌液體石蠟制成混懸液，按1.0mg/g比例行大鼠腹腔注射，誘發(fā)無菌性腹膜炎，制備MODS模型3,4。對照組大鼠腹腔注射等體積液體石臘。造模后48小時(shí)，全部動(dòng)物均在乙醚麻醉下，以1/1 000升汞消毒眼球再用生理鹽水沖洗后以細(xì)玻璃管經(jīng)球后靜脈采血3ml；然后剖腹，經(jīng)門靜脈采血1ml，留測各項(xiàng)指標(biāo)；并取部分末段回腸組織進(jìn)行病理學(xué)檢查和通透性測定。3.觀察指標(biāo)和檢測方法:(1) 內(nèi)毒素：外周血及門靜脈血中內(nèi)毒素的含量采用鱟試驗(yàn)偶氮基質(zhì)顯色法進(jìn)行測定

10、。(2)還原型谷胱甘肽(GSH)：血清及腸組織中還原型谷胱甘肽含量采用熒光測定改良法5。(3)黃嘌呤氧化酶(SOD)：血清及腸組織中黃嘌呤氧化酶活性測定按吳曉生等介紹的NBT比色法進(jìn)行測定6。(4)丙二醛(MDA)：血清及腸組織中過氧化脂質(zhì)產(chǎn)物丙二醛含量的測定采用改良的八木國夫法7。(5)腫瘤壞死因子(TNF)：血清及腸組織中TNF含量用放免法進(jìn)行測定。(6)二胺氧化酶(DAO)：血清及腸組織中DAO含量測定采用分光光度法8。(7)組織蛋白定量：腸組織蛋白定量測定用Lowry法。(8)腸粘膜通透性及腸細(xì)胞滲透性測定：以鑭作示蹤劑觀察腸粘膜通透性和腸細(xì)胞的滲透性9。(9)組織病理觀察方法：動(dòng)物活

11、殺后取小塊回腸段標(biāo)本，分別置入磷酸福爾馬林緩沖液和2.5%戊二醛溶液中固定。組織經(jīng)過常規(guī)處理，分別以O(shè)lympus顯微鏡和JEM-2000EX電子顯微鏡觀察并照相。4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所得結(jié)果經(jīng)美國Minitab統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。結(jié)果1.MODS時(shí)外周血和門靜脈血中內(nèi)毒素水平的變化：無菌性腹膜炎誘發(fā)大鼠MODS后，外周血和門靜脈血中內(nèi)毒素水平分別是108.07±21.56pg/ml和234.98±28.04pg/ml均明顯高于對照組41.41±12.27pg/ml和59.48±11.53pg/ml(P<0.01)；對照組門靜脈血的內(nèi)毒素水平稍高于

12、本組外周血(P<0.05)，模型組門靜脈血的內(nèi)毒素水平則明顯高于本組外周血(P<0.05)。2.血和小腸組織中TNF含量的變化：模型組血清和腸勻漿中TNF含量分別是2.70±0.33g/ml和3.44±0.40ng/mg pro,明顯高于對照組1.62±0.27g/ml和1.17±0.27ng/mg pro(P<0.05)。3.血和小腸組織DAO含量的變化：MODS時(shí)模型組血DAO含量是23.83±3.39mg/ml,明顯高于對照組6.21±1.90mg/ml(P<0.01);模型組腸組織中DAO含量是4.84

13、±1.88mg/ml pro,明顯低于對照組14.24±2.90mg/ml(P<0.01)。4.血液中XOD、MDA和GSH的變化：模型組血液中XOD和MDA含量分別是130.64±14.43U/L 和14.46±2.41nmoL/ml,明顯高于對照組77.99±14.75U/L和 3.16±0.27nmoL/ml(P<0.01) ，而模型組血GSH含量是1.03±0.45g/ml,明顯低于對照組3.45±0.34g/ml(P<0. 01)。5.腸組織中XOD、MDA和GSH含量的變化：模型組腸組

14、織中XOD和MDA含量分別是160.83±10.08U/g pro和17.06±1.08nmol/mg pro,均明顯高于對照組的83.93±3.06U/g和12.83±2.46nmol/mg(P<0.01);模型組腸組織GSH含量是1.53±0.19g/mg pro,比對照組 3.86±0.58g/mg明顯減少(P<0.01)。6.腸粘膜的形態(tài)學(xué)變化：與對照組相比較，光鏡和電鏡下均見模型組出現(xiàn)明顯病理損害。7.腸粘膜通透性和腸細(xì)胞滲透性的改變：在MODS大鼠腸標(biāo)本中，可看到電子密度高的鑭顆粒沉積在腸細(xì)胞間隙中，沿細(xì)胞周緣

15、呈線條狀分布，線條粗細(xì)不盡相等，有時(shí)隨細(xì)胞間隙走向呈彎曲或纏繞成不規(guī)則圈網(wǎng)狀，有的鑭顆粒可呈串珠狀分布。部分標(biāo)本的鑭顆粒透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。對照組腸標(biāo)本中，腸上皮細(xì)胞間連接處、細(xì)胞外間隙和細(xì)胞內(nèi)均未見有沉積的鑭顆粒。8.多元直線回歸分析：以外周血中內(nèi)毒素水平(ET)為因變量，以門靜脈血中內(nèi)毒素水平(PET)、腸過氧化脂質(zhì)丙二醛(IMDA)、血二胺氧化酶(BDAO)、腸二胺氧化酶(IDAO)和腸腫瘤壞死因子(ITNF)等5項(xiàng)指標(biāo)為自變量進(jìn)行多元直線回歸分析，其復(fù)相關(guān)系數(shù)r=0.964 0，剩余標(biāo)準(zhǔn)差為9.929 2。方差分析表明各指標(biāo)間的多元回歸具有十分顯著的意義。討論一、腸道屏障損傷是導(dǎo)致M

16、ODS的重要環(huán)節(jié)。我們應(yīng)用無菌酵母多糖制劑腹腔注射，成功地誘發(fā)了MODS10,其臟器功能與病理變化符合MODS標(biāo)準(zhǔn)4，本文重點(diǎn)研究了腸道屏障功能的地位和作用。1.二胺氧化酶(DAO)的變化：DAO是人類和所有哺乳動(dòng)物小腸粘膜上皮絨毛中具有高度活性的細(xì)胞內(nèi)酶，在組胺和多種多胺代謝中起作用。DAO活性與粘膜細(xì)胞的核酸和蛋白質(zhì)合成密切相關(guān)，它能夠反映腸粘膜的完整性和損傷程度9。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MODS時(shí)腸粘膜組織中DAO活性明顯降低。DAO活性與血內(nèi)毒素水平、腸粘膜組織過氧化損傷情況密切相關(guān)。因此，DAO活性變化是反映腸道屏障功能狀態(tài)的良好指標(biāo)。2.腸粘膜組織的過氧化損傷：本實(shí)驗(yàn)觀察到，在MODS時(shí)腸粘

17、膜組織中XOD的活性明顯增高；GSH含量明顯減少。由于XOD的升高，使氧自由基產(chǎn)生增多；而GSH含量的減少，又使生成的氧自由基不能及時(shí)清除。于是這些活性氧成分與細(xì)胞膜上的多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化，結(jié)果導(dǎo)致腸組織細(xì)胞損傷的進(jìn)一步加劇。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MODS時(shí)腸組織病理學(xué)的改變?yōu)檎衬す逃袑由掀ぜ?xì)胞變性、壞死、脫落、腸絨毛水腫、間隙增寬。表明腸粘膜的機(jī)械性破壞是腸道屏障損傷的重要因素。3.腸粘膜通透性的改變：本實(shí)驗(yàn)用硝酸鑭作示蹤劑，在電鏡下觀察腸粘膜通透性的改變。發(fā)現(xiàn)MODS時(shí)電子密度高的鑭顆粒沿細(xì)胞周緣沉積在腸上皮細(xì)胞間隙中；在部分標(biāo)本中鑭顆粒透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。表明MODS時(shí)腸粘膜通透性和細(xì)

18、胞膜通透性均明顯增高。腸粘膜通透性的增高，使得腸粘膜屏障功能減弱，腸道中細(xì)菌和內(nèi)毒素侵入體內(nèi)，通過激活體內(nèi)多臟器中的吞噬細(xì)胞，釋放一系列具有損傷作用的多種生物活性介質(zhì)，引起全身多個(gè)器官代謝功能發(fā)生改變，這在MODS的發(fā)生和發(fā)展中起著十分重要的作用。實(shí)際上在很多情況下，腸粘膜屏障功能衰竭的發(fā)生要早于其它臟器。因此 Meakins等1將腸道稱之為創(chuàng)傷后多臟器功能衰竭的起源，Wilmore2將腸道稱之為“外科應(yīng)激條件下的中心器官（central organ）”。二、腸源性內(nèi)毒素是MODS的重要致病因子采用大鼠腹腔內(nèi)注射酵母多糖的方法，制備出非細(xì)菌感染性MODS動(dòng)物模型，并測定門靜脈和周圍靜脈血中的內(nèi)

19、毒素水平。發(fā)現(xiàn)其含量均明顯高于對照組。同時(shí)我們還測定了血清和腸組織勻漿中腫瘤壞死因子-(TNF)的含量，發(fā)現(xiàn)模型組明顯高于對照組。相關(guān)分析還表明，腸組織中TNF含量、腸組織DAO含量、門靜脈血和外周血內(nèi)毒素水平之間明顯相關(guān)。結(jié)果表明，腸組織過氧化損傷和TNF等細(xì)胞因子的釋放造成了腸道屏障的損傷和破壞，使大量內(nèi)毒素由腸壁吸收入門靜脈，造成門靜脈內(nèi)毒素血癥，再經(jīng)肝臟進(jìn)入體循環(huán)產(chǎn)生內(nèi)毒素血癥。機(jī)體單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)受到過度或持續(xù)的活化和刺激，進(jìn)而導(dǎo)致產(chǎn)生、表達(dá)和釋放過多的細(xì)胞因子及其它產(chǎn)物，通過細(xì)胞因子連鎖反應(yīng)和毒性網(wǎng)絡(luò)，不僅可導(dǎo)致機(jī)體代謝與血液動(dòng)力學(xué)異常，其持續(xù)存在還可造成自身組織、細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的廣泛損害，最終會(huì)引起宿主膿毒性反應(yīng)和MODS。而細(xì)菌內(nèi)毒素或脂多糖(LPS)是這個(gè)連鎖反應(yīng)中最重要的誘發(fā)因素。腸勻漿中TNF代表著腸組織中巨噬細(xì)胞受內(nèi)毒素攻擊而釋放的細(xì)胞相關(guān)性TNF水平，它除了通過內(nèi)分泌作用進(jìn)入血循環(huán)產(chǎn)生遠(yuǎn)隔器官損害外，還可通過旁分泌形式