高血壓、糖尿病大鼠的一氧化氮、內(nèi)皮素變化與心肌病變的關(guān)系

1、    高血壓、糖尿病大鼠的一氧化氮、內(nèi)皮素變化 與心肌病變的關(guān)系        糖尿病和高血壓時均有血管內(nèi)皮功能障礙，一氧化氮(NO)與內(nèi)皮素(ET)失調(diào)1，2。NO是重要的血管擴(kuò)張因子，由NO合酶(NOS)催化L-精氨酸生成。我們研究目的在于建立SHR-糖尿病模型，觀察高血壓合并糖尿病時心肌內(nèi)NO、ET系統(tǒng)的變化與心肌病變間的關(guān)系。一、材料與方法1實驗動物：WKY和SHR大鼠 (46周齡)42只由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外醫(yī)院提供。SHR大鼠隨機(jī)分成SHR組和SHR-糖

2、尿病組。后者以鏈脲佐菌素75 mg/kg溶于0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液(pH 4.3)中給予SHR大鼠腹腔內(nèi)一次性注射。于第10周及20周分別取心血作生化檢測，并分別取左心室肌置液氮內(nèi)，用作NO及NOS活性測定；4%甲醛固定，石蠟包埋用作光鏡檢查及原位雜交；2.5%戊二醛固定做電鏡檢查。2檢測方法：血壓測定用RBP-1大鼠尾血壓測量儀(我院臨床醫(yī)學(xué)研究所生理室研制)。血糖檢測用葡萄糖氧化酶法。血漿ET測定采用解放軍總醫(yī)院東亞免疫技術(shù)研究所提供的ET放免測定試劑盒。（1）NO測定：將心肌組織塊稱重、剪碎，按50 mg組織加入含1%牛血清白蛋白的Kreb液，37恒溫振蕩水浴(95%O2-5%C

3、O2)持續(xù)平衡孵育90分鐘，取孵育液0.1 ml，按Greiss法測終末產(chǎn)物NO2含量，換算為心肌組織釋放的NO含量(nmol/g組織)。（2）NOS活性：按文獻(xiàn)3方法分別測定內(nèi)皮型NOS(eNOS)和誘導(dǎo)型NOS(iNOS)活性，以每分鐘pmol/mg.pr表示。（3）蛋白定量用考馬斯亮藍(lán)比色法。（4）原位雜交：石蠟切片厚3 m，脫蠟后，0.3% H2O2封閉，100 g/ml蛋白酶K消化，4%多聚甲醛后固定，乙醇脫水，風(fēng)干。將加熱(80，5 分鐘)后的雜交液(含生物素標(biāo)記的NOS-cRNA探針，北京醫(yī)科大學(xué)病理系合成)加于玻片上(40 ng/片)雜交。42孵育1620小時。用2×

4、SSC甲酰胺溶液及2×SSC溶液(42)洗滌各20 分鐘。1%馬血清封閉，滴加1100ABC液，室溫孵育1小時，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。去離子甲酰胺、鮭精DNA、二巰基糖醇(DTT)及50%硫酸右旋苷購自美國公司。細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)棕色顆粒為雜交陽性，依雜交信號強(qiáng)弱分為0級。（5）光鏡檢查：切片3 m厚，做HE及Masson三重染色。（6）超微結(jié)構(gòu)觀察：組織塊經(jīng)Epon 812包埋，醋酸鈾及枸櫞酸鉛染色，日本電子1200透射電鏡觀察。3統(tǒng)計學(xué)處理：實驗結(jié)果以±s表示，多組資料用SYSTAT統(tǒng)計軟件做方差分析。二、結(jié)果SHR組及SHR-糖尿病組血壓顯著高于WKY組，分別為（209.2

5、±24.8）、（162.0±18.6）及（102.5±9.4） mm Hg。SHR-糖尿病組血糖明顯高于WKY組及SHR組，10周時分別為(20.8±2.5)、(7.4±1.2)及(9.7±2.1) mmol/L；20周時分別為(30.5±3.6)、(8.9±1.8)及(10.2±3.3) mmol/L (P<0.001)。血漿ET水平SHR組20周時高于其它兩組(P<0.01)，分別為(147.0±33.0)、(95.0±17.0)、(88.0±17.0) pg

6、/ml。光鏡觀察，SHR-糖尿病組有明顯的心肌間質(zhì)纖維化，膠原纖維呈網(wǎng)狀分隔心肌細(xì)胞(1)，心內(nèi)膜下纖維組織增多，此外SHR-糖尿病及SHR組均可見冠脈周圍纖維化，間質(zhì)細(xì)胞增多。電鏡下觀察，SHR-糖尿病組心肌細(xì)胞內(nèi)線粒體增多、腫脹、嵴減少且排列紊亂及空泡形成，心肌細(xì)胞水腫，肌纖維斷裂，間質(zhì)膠原纖維增多等。這些改變SHR-糖尿病組明顯重于SHR組。 1SHR+糖尿病組20周，心肌間質(zhì)膠原纖維增多Masson染色×100表1心肌NO及NOS活性測定(±s)組別NO(mmol/g)eNOSiNOS(每分鐘pmol/mg.pr)i/c比值10周WKY450.5±162.

7、68.3±1.14.9±1.20.6±0.1SHR205.7±75.74.7±1.99.0±1.33.2±1.1SHR-糖尿病205.0±85.60.8±0.8*10.2±0.612.8±1.3*20周WKY497.7±70.38.2±1.74.0±0.80.5±0.1SHR329.6±100.54.4±1.99.4±1.42.3±0.8SHR-糖尿病247.5±85.01.0±0.4*

8、10.0±0.610.0±1.5*注：與WKY比P0.05，P0.01；與SHR相比*P0.05，*P0.012WKY組20周，正常心肌內(nèi)冠脈NOS mRNA表達(dá)原位雜交×503SHR+糖尿病組20周，心肌內(nèi)冠脈NOS mRNA表達(dá)4WDY組20周，正常心肌阻力血管NOS基因表達(dá)5SHR+糖尿病組20周，心肌阻力血管NOS基因表達(dá)6WKY組20周，正常心肌阻力血管ET mRNA表達(dá)7SHR+糖尿病組20周，心肌阻力血管ET mRNA表達(dá)(37均為原位雜交×100)三、討論本研究成功地復(fù)制了鏈脲佐菌素-SHR-糖尿病模型，20周時心肌間質(zhì)纖維形成網(wǎng)絡(luò)狀分隔

9、心肌細(xì)胞，其心肌細(xì)胞及線粒體的變化均提示心肌能量代謝明顯障礙4，是糖尿病心肌病的病理基礎(chǔ)。SHR組及SHR-糖尿病組心肌NO含量及eNOS活性減低，說明2組均有心肌血管內(nèi)皮受損及功能障礙；高血壓及糖尿病同時存在時內(nèi)皮損害加劇。2組的iNOS活性均明顯增高，SHR-糖尿病組心肌i/c比值明顯高于SHR組，與其心肌病變程度相平行。由此看出，i/c比值較iNOS活性更能反映心肌病變程度，對評價心肌病變可能會更全面準(zhǔn)確。SHR-糖尿病組在冠脈的內(nèi)皮及平滑肌細(xì)胞NOS mRNA表達(dá)均下降，在阻力血管內(nèi)皮NOS mRNA水平降低，而平滑肌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)無明顯變化，說明心肌阻力血管內(nèi)皮損傷后平滑肌產(chǎn)生的NO對血

10、管擴(kuò)張起重要作用。兩病變組心肌小血管ET mRNA表達(dá)增強(qiáng)，SHR組20周時血漿ET水平高于其它2組，說明ET水平增高與高血壓直接相關(guān)。 本課題為國家教育部資助項目編號 教外司留（1996）644作者單位：100029 北京，中日友好醫(yī)院內(nèi)分泌科（鄭旭、李光偉、陳任明、王瑤、楊文英），病理科（張晶、羅杰、王泰齡）參考文獻(xiàn)1Rosen P, Ballhausen T, Stockklauser K. Impairment of endothelium dependent relaxation in the diabetic rat heart: mechanisms and implications. Diabetes Res Clin Pract, 1996, 31(Suppl):S143-S155.2Levin ER. Endothelins as cardiovascular peptides. Am J Nephrol, 1996, 16:246-251.3張新波，黃海鷺，張靈芝，等. 一氧化氮合成酶(NOS)活性的測定及其應(yīng)用.北京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,1994,26(增刊):173-176.4Tomita M, Muka