生化實(shí)驗(yàn)六 酶的基本性質(zhì)

1、專業(yè)：_生物工程 姓名：_陳傳鑫 學(xué)號(hào)：_3090104963 日期：_ 地點(diǎn)：_生物實(shí)驗(yàn)樓306 實(shí)驗(yàn)報(bào)告課程名稱： 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn) 指導(dǎo)老師： 史影 成績(jī)： 實(shí)驗(yàn)名稱： 酶的基本性質(zhì)實(shí)驗(yàn)底物專一性、激活劑和抑制劑、最適溫度 同組學(xué)生姓名： 陳莞爾，潘盛警 .酶的基本性質(zhì)底物專一性一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1.了解酶的專一性。 2.掌握驗(yàn)證酶的專一性的基本原理及方法。 3.學(xué)會(huì)排除干擾因素，設(shè)計(jì)酶學(xué)實(shí)驗(yàn)。二、基本原理酶是具有高度專一性的有催化功能的蛋白質(zhì)。酶蛋白結(jié)構(gòu)決定了酶的功能酶的高效性，酶促反應(yīng)要比無(wú)機(jī)催化反應(yīng)快數(shù)十倍。酶催化的一個(gè)重要特點(diǎn)是具有高度的底物專一性，即一種酶只能對(duì)一種或一類底物其催化作用

2、，對(duì)其他底物無(wú)催化反應(yīng)。根據(jù)各種酶對(duì)底物的選擇程度不同，可分成下列幾種：1.相對(duì)專一性。一種酶能催化一類具有相同化學(xué)鍵或基團(tuán)的物質(zhì)進(jìn)行某種類型的反應(yīng)。2.絕對(duì)專一性：有些酶對(duì)底物的要求非常嚴(yán)格只作用于一種底物，而不作用于任何其他物質(zhì)。如脲酶只能催化尿素進(jìn)行水解而生成二氧化碳和氨。如麥芽糖酶只作用于麥芽糖而不作用其它雙糖，淀粉酶只作用于淀粉，而不作用于纖維素。3.立體異構(gòu)專一性：有些酶只有作用于底物的立體異構(gòu)物中的一種，而對(duì)另一種則全無(wú)作用。如酵母中的糖酶類只作用于D-型糖而不能作用于L-型的糖。本實(shí)驗(yàn)以唾液淀粉酶和蔗糖酶對(duì)淀粉和蔗糖水解反應(yīng)的催化作用來(lái)觀察酶的專一性。用Benedict試劑檢測(cè)

3、反應(yīng)產(chǎn)物。Benedict試劑是堿性硫酸銅溶液，具有一定的氧化能力，能與還原性的半縮醛羥基發(fā)生氧化還原反應(yīng)，生成磚紅色氧化銅沉淀。Na2CO3+ 2H2O 2NaOH + H2CO3CuSO4+ 2NaOH Cu(OH)2+ Na2SO4還原糖(CHO or C=O)+ 2Cu(OH)2 Cu2O + 2H2O + 糖的氧化產(chǎn)物 （黃色或磚紅色）淀粉和蔗糖無(wú)半縮醛基，無(wú)還原性，與Benedict試劑無(wú)顯色反應(yīng)。淀粉被淀粉酶水解后產(chǎn)生葡萄糖，蔗糖被蔗糖酶水解后產(chǎn)生果糖和葡萄糖，產(chǎn)物都是還原糖，因此能被Benedict試劑氧化生成磚紅色的Cu2O沉淀。三、實(shí)驗(yàn)材料與試劑1、實(shí)驗(yàn)材料 蔗糖酶(樣品）

4、； 新鮮唾液（含唾液淀粉酶）；2、實(shí)驗(yàn)試劑 蔗糖酶液 蔗糖酶液(樣品）加蒸餾水適當(dāng)稀釋，備用； 唾液淀粉酶液（學(xué)生自制） 取0.5mL唾液至25ml量筒中，用蒸餾水（稀釋）到25ml，用棉花過(guò)濾備用。唾液稀倍數(shù)因人而異，可稀釋50400倍，甚至更高； 5%蔗糖（A.R.）溶液； 0.5%淀粉溶液（含0.3%NaCl）； Benedict試劑 ；四、實(shí)驗(yàn)器材與儀器1.漏斗， 2.脫脂棉花； 3.恒溫水?。?7，100）； 4.量筒；5.試管；6.燒杯；7.吸量管。 五、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容酶的專一性實(shí)驗(yàn)，按下表操作。檢查試劑淀粉酶的專一性蔗糖酶的專一性編號(hào)0.5%淀粉（0.3%NaCl）溶液 (ml)333

5、5%蔗糖溶液 (ml)333蒸餾水 (ml)333唾液淀粉酶液 (ml)111蔗糖酶溶液 (ml) 111搖勻，置37水浴保溫10min Benedict試劑 (ml)222222222搖勻，置沸水浴煮23min記錄觀察結(jié)果藍(lán)色藍(lán)色藍(lán)色磚紅色藍(lán)色藍(lán)色藍(lán)色黃綠色藍(lán)色六、結(jié)果分析和討論結(jié)果： 、號(hào)試管均呈硫酸銅的藍(lán)色，說(shuō)明這3支試管內(nèi)無(wú)還原糖，淀粉和蔗糖均未水解； 號(hào)試管呈磚紅色說(shuō)明試管內(nèi)淀粉被水解，號(hào)試管呈藍(lán)色說(shuō)明試管內(nèi)蔗糖未水解，號(hào)試管呈藍(lán)色說(shuō)明無(wú)還原糖，從這三支試管看出唾液淀粉酶只對(duì)淀粉有催化活性，不能催化蔗糖水解，具有對(duì)淀粉的底物專一性； 號(hào)試管呈黃綠色，說(shuō)明試管中部分蔗糖被水解，但未水解

6、完全，號(hào)試管呈藍(lán)色說(shuō)明淀粉未水解，號(hào)試管呈藍(lán)色說(shuō)明無(wú)還原糖，從這三支試管看出蔗糖酶只對(duì)蔗糖的水解有催化作用，對(duì)淀粉無(wú)催化作用，具有對(duì)蔗糖的底物專一性。七、思考題1觀察酶專一性實(shí)驗(yàn)為什么要設(shè)計(jì)這3組實(shí)驗(yàn)？每組各有何意義？蒸餾水有何用？答：第一組作為整個(gè)實(shí)驗(yàn)的空白對(duì)照組，檢測(cè)Benedict試劑對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的顏色有何影響。第二組作為檢測(cè)淀粉酶的專一性實(shí)驗(yàn)組，第三組作為檢測(cè)蔗糖酶的專一性的實(shí)驗(yàn)組。蒸餾水作為每一個(gè)組中的空白對(duì)照，與組內(nèi)其余兩組進(jìn)行對(duì)照。2將酶液煮沸10min后，重做二、三的操作，觀察有何結(jié)果？答：二、三組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果將和一組相同，即每組中3支試管都呈藍(lán)色，因?yàn)槊冈谥蠓羞^(guò)程中已經(jīng)變性，失去

7、催化活性，故不能催化各自對(duì)應(yīng)底物的水解反應(yīng)。3在此實(shí)驗(yàn)中，為什么要用0.5%淀粉(0.3%NaCl)溶液？0.3%NaCl的作用是什么？答：0.3%NaCl中的Cl-是作為激活劑激活唾液淀粉酶的活性，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果不至于因?yàn)橥僖旱矸勖傅幕钚圆蛔愣鴮?dǎo)致不同。. 影響酶活性的因素激活劑和抑制劑一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?. 了解激活劑和抑制劑對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響。2. 學(xué)習(xí)檢定激活劑和抑制劑影響酶促反應(yīng)速度的原理和方法。二、實(shí)驗(yàn)基本原理在酶促反應(yīng)過(guò)程中，酶的活性常收到某些物質(zhì)的影響，有些物質(zhì)能使酶的活性增加，稱為激活劑；某些物質(zhì)它們并不引起酶蛋白變性，但能使酶分子上的某些必需基團(tuán)（主要是指酶活性中心上的一些基

8、團(tuán)）發(fā)生變化，因而引起酶活力下降，甚至喪失，致使酶反應(yīng)速度降低，稱為酶的抑制劑。酶的激活劑種類：1、一些簡(jiǎn)單的無(wú)機(jī)離子，如Mg2+、Cl-等；2、一些中等大小的有機(jī)分子，如抗壞血酸等也是激活劑，它們對(duì)某些含巰基的酶具有激活作用；3、有些酶的催化作用易受某些抑制劑的影響，因而能除去抑制劑的物質(zhì)也可稱為激活劑，如EDTA能除去重金屬，因而能解除重金屬對(duì)酶的抑制作用。4、具有蛋白質(zhì)性質(zhì)的大分子物質(zhì)，這些激活劑是指可對(duì)某些無(wú)活性的酶原起作用的酶。酶的抑制劑有許多種：如重金屬離子（Ag+、Hg2+、Pb2、Cu2等）、CO、氯化物、H2S、砷化物、氟化物、生物堿、有機(jī)磷農(nóng)藥等都是抑制劑。少量的激活劑或抑

9、制劑就能影響酶的活性，而且常具有特異性。值得注意的是激活劑和抑制劑不是絕對(duì)的，各種激活劑對(duì)酶的作用是不同的。本實(shí)驗(yàn)利用淀粉被水解的不同階段產(chǎn)物與碘有不同顏色反應(yīng)，定性觀察唾液淀粉酶在酶促反應(yīng)中激活或抑制現(xiàn)象。淀粉經(jīng)酶促水解為葡萄糖的不同階段的產(chǎn)物與碘作用的顏色反應(yīng)如下：淀粉 紫色糊精 紅色糊精 無(wú)色糊精 麥芽糖 葡萄糖I2 顯藍(lán)色 顯紫色 顯紅色 不顯色 不顯色 不顯色 （ 碘色） （碘色） （碘色） （有還原性）仍為多糖（無(wú)還原性） 本實(shí)驗(yàn)中，Cl- 為唾液淀粉酶的激活劑；Cu2+為唾液淀粉酶的抑制劑。利用淀粉酶別水解不同階段產(chǎn)物與碘有不同的呈色反應(yīng)，觀察唾液淀粉酶的酶促反應(yīng)中的激

10、活和抑制現(xiàn)象。水解程度通過(guò)水解混合物遇碘溶液所呈現(xiàn)的顏色變化判斷。三、實(shí)驗(yàn)材料與試劑1、實(shí)驗(yàn)材料 新鮮唾液2、實(shí)驗(yàn)試劑 唾液淀粉酶（學(xué)生自制） 取唾液1ml至25ml量筒中，用蒸餾水稀釋至25ml，用棉花過(guò)濾備用。唾液稀釋倍數(shù)因人而異，可稀釋50400倍，甚至更高。 0.1% 淀粉溶液 1.0% 氯化鈉溶液 1.0% 硫酸銅溶液 1.0% 硫酸鈉溶液 碘化鉀-碘液四、實(shí)驗(yàn)器材和儀器1.試管及試管架 2.量筒 3.漏斗 4.脫脂棉花 5.點(diǎn)滴板 6.吸量管 7.恒溫水?。?7） 五、實(shí)驗(yàn)步驟 試管編號(hào)試劑處理12340.1%淀粉溶液 (ml) 33331% 硫酸銅溶液 (ml) 11% 氯化鈉溶

11、液 (ml) 11% 硫酸鈉溶液 (ml) 1蒸餾水 (ml) 1唾液淀粉酶 (ml) 1111混勻，37恒溫水浴，保溫10min碘化鉀-碘液（滴）1111記錄觀察結(jié)果深藍(lán)偏黑紅棕色深藍(lán)色深藍(lán)色注意： 找出準(zhǔn)確的保溫時(shí)間，是本實(shí)驗(yàn)是實(shí)驗(yàn)?zāi)芊癯晒Φ年P(guān)鍵步驟之一，唾液淀粉酶液濃度可根據(jù)個(gè)人情況而定，通過(guò)37水浴溶保溫計(jì)時(shí)，反應(yīng)時(shí)間最好在815min以內(nèi)，只有確定準(zhǔn)確的保溫時(shí)間才能進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 （2） 加入酶液后，務(wù)必充分搖勻，保證酶與全部淀粉液接觸的反應(yīng)才能得到理想的顏色梯度變化結(jié)果。（3）碘化鉀碘液不要過(guò)早地加到點(diǎn)滴板上，以免碘液揮發(fā)，影響顯色效果。六、結(jié)果討論與分析結(jié)果：反應(yīng)時(shí)間在17min中時(shí)

12、能明顯區(qū)分各管顏色不同。試管1中顏色最深，說(shuō)明CuSO4可以抑制淀粉酶的活性；試管2中顏色最淺，基本呈碘色，故淀粉酶活性最高，說(shuō)明NaCl可以激活淀粉酶的活性；試管3、4中顏色基本一致，且深淺居于試管1、2之間，淀粉酶活性一般，說(shuō)明Na+、SO42-對(duì)淀粉酶活性都沒(méi)有影響。故總體上看，可以得出Cl-是唾液淀粉酶的激活劑，Cu2+是唾液淀粉酶的抑制劑。同時(shí)，因?yàn)楦鞴艿慕Y(jié)果顏色都偏深，所以使用的唾液淀粉酶樣品活性不高，這與區(qū)分各管顏色差別需要反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)（17min）相符合。七、思考題1. 激活劑可分哪幾類？本實(shí)驗(yàn)中NaCl、硫酸銅是屬于哪種類型？答：激活劑可分為：簡(jiǎn)單無(wú)機(jī)離子、中等大小有機(jī)分子、

13、能出去抑制劑的物質(zhì)、具有蛋白質(zhì)性質(zhì)的大分子物質(zhì)等。NaCl屬于簡(jiǎn)單無(wú)機(jī)離子；CuSO4屬于重金屬抑制劑。2. 本實(shí)驗(yàn)中，1，2，3，4管各有何用意？為什么要設(shè)計(jì)第3管和第4管？答：1管可觀察抑制劑對(duì)反應(yīng)影響的現(xiàn)象，2管可觀察激活劑對(duì)反應(yīng)影響的現(xiàn)象，第3管可以將1管中的Na+和2管中的SO42-對(duì)反應(yīng)的影響去除，4管作為空白對(duì)照。3. 抑制劑與變性劑有何不同？試舉例說(shuō)明。答：抑制劑只改變酶的催化活性，并不使蛋白質(zhì)變性，其影響是可逆的；變性劑破壞了蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)變性，并且多數(shù)變性劑的影響是不可逆的。如：Cu2+是唾液淀粉酶的抑制劑，但如果將Cu2+去除淀粉酶的活性又可以變?yōu)檎Ｋ健?

14、 影響酶活性的因素溫度，最適溫度測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?. 了解溫度對(duì)酶活力的影響；2. 學(xué)習(xí)測(cè)定最適溫度的原理和方法；二、實(shí)驗(yàn)基本原理 酶的催化反應(yīng)受溫度影響很大，每一種酶所催化的反應(yīng)，在一定條件下，僅在某一溫度范圍內(nèi)表現(xiàn)出最大的活力，即反應(yīng)速度最大時(shí)的溫度，這個(gè)溫度稱為該酶促反應(yīng)的最適溫度，高于或低于最適溫度時(shí)，反應(yīng)速度逐漸下降。因此，酶促反應(yīng)與溫度的關(guān)系，用酶活力對(duì)溫度作圖，通常具有鐘罩形曲線特征。 溫度與酶活力的關(guān)系測(cè)定是選擇一定的條件，把底物濃度、酶濃度、反應(yīng)時(shí)間、pH等固定在最適狀態(tài)下，然后在一系列不同溫度條件下，進(jìn)行反應(yīng)初速度測(cè)定，以酶反應(yīng)初速度對(duì)溫度作圖，可以得一個(gè)鐘罩形的曲線

15、，即為溫度酶活性曲線，在某溫度有一酶活力最大值，這個(gè)溫度即為最適溫度。實(shí)驗(yàn)利用唾液淀粉酶為試驗(yàn)對(duì)象，在065之間選擇不同的溫度，進(jìn)行酶活力測(cè)定。根據(jù)淀粉被唾液淀粉酶水解的程度的不同，遇碘呈現(xiàn)顏色的變化來(lái)判斷酶活力的大小及最適溫度。 實(shí)驗(yàn)采用蔗糖酶為試驗(yàn)對(duì)象，在室溫至75之間選擇不同溫度進(jìn)行酶活力測(cè)定。蔗糖酶的活力常以其反應(yīng)產(chǎn)物還原糖（葡萄糖）的生成量來(lái)表示。測(cè)定還原糖的方法很多，本實(shí)驗(yàn)選擇3,5二硝基水揚(yáng)酸法測(cè)定還原糖量。在堿性條件下，3,5二硝水楊酸與還原糖溶液共熱后被還原成紅色氨基化合物，并在一定濃度范圍內(nèi)，還原糖的量與反應(yīng)溶液所呈棕紅色物質(zhì)顏色的深淺程度成正比。因此，可以用分光光度法測(cè)定

16、酶促反應(yīng)后生成的還原糖量，從而測(cè)定蔗糖水解的速度和酶活力。三、實(shí)驗(yàn)材料與試劑1、實(shí)驗(yàn)材料 蔗糖酶液(樣品）加蒸餾水適當(dāng)稀釋，備用； 新鮮唾液。2、實(shí)驗(yàn)試劑 0.2mol/L醋酸緩沖液（pH4.6） 5%蔗糖（A.R.）溶液（W/V） 3,5二硝基水揚(yáng)酸（簡(jiǎn)稱DNS）試劑 0.5%淀粉溶液（含0.3%NaCl） IK-I2溶液 四、實(shí)驗(yàn)器材與儀器1.試管及試管架， 2恒溫水浴， 3吸量管, 4滴管, 5點(diǎn)滴板，6分光光度計(jì)， 7制冰機(jī)。五、實(shí)驗(yàn)步驟溫度對(duì)唾液淀粉酶活力的影響按下表操作 管 號(hào) 試 劑 123450.5%淀粉液（0.3%NaCl）(ml)22222溫度 （）冰浴約0室溫375065

17、 各保溫5min唾液淀粉酶 （ml）11111將試管內(nèi)溶液混勻后，置各相應(yīng)溫度，保溫10minIK-I2液 （滴）11111記錄顏色變化 藍(lán)色藍(lán)色紅棕色橙紅色藍(lán)色顏色深淺溫度（）07037深淺50 溫度-酶活力曲線圖溫度對(duì)蔗糖酶活力的影響 編號(hào) 條件012345反應(yīng)溫度（） 室 溫室 溫375065750.2mol/L醋酸緩沖液（pH4.6）(ml)1111115%蔗糖溶液 (ml)0.50.50.50.50.50.5 預(yù)熱3min稀釋酶液(樣品） (ml)(作相應(yīng)的預(yù)溫）H2O 0.50.50.50.50.50.5 保溫反應(yīng)10 min3,5二硝基水楊酸 （ml）1111

18、11 混勻后，100加熱5min蒸餾水 （ml） 555555A52000.3411.1651.3200.6680.075六、結(jié)果分析討論溫度對(duì)唾液淀粉酶活力的影響從溫度對(duì)唾液淀粉酶的活力曲線可以看出，當(dāng)溫度為50時(shí)顏色最淺，即淀粉水解最完全，唾液淀粉酶的活性最高；在50兩邊唾液淀粉酶的活性都隨著溫度的改變而降低，故本組實(shí)驗(yàn)的唾液淀粉酶的最適溫度在50左右。唾液淀粉酶的活性并不是在正常的人體體溫37時(shí)最適，根據(jù)激活劑和抑制劑探索中的結(jié)果顏色普遍偏深，主要原因認(rèn)為是本組的唾液淀粉酶樣品活性不高，故樣品的最適溫度較正常情況有所提高，不是37而是本次實(shí)驗(yàn)測(cè)得的50。溫度對(duì)蔗糖酶活力的影響由試劑在520nm波長(zhǎng)的吸光度對(duì)溫度作圖得到如上圖的A520-T曲線。由圖線看出蔗糖酶在50時(shí)活性最高，故蔗糖酶的最適溫度為50。同時(shí)由曲線看出溫度高于70后酶活性顯著下降，這是因?yàn)榇藭r(shí)酶已經(jīng)因?yàn)楦邷匕l(fā)生了變性，失去了大部分的催化活性，故催化能力大大減弱。七、思考